Cours du mardi 11 décembre 2007 15h-17h ronéo par Alexis Régent mail : alexisregent@hotmail.com professeur Mme Cremer mail : isabelle.cremer@upmc.fr Récepteurs et médiateurs de l immunité innée Introduction Def : mécanisme de défense contre la plupart des pathogènes. La caractéristique importante étant son début immédiat après contact avec le pathogène. La plupart des cellules du système immunitaire expriment des PRR (pattern-recognitionreceptor) et sont donc susceptibles de reconnaître des pathogènes. Ces récepteurs reconnaissent des molécules aux motifs structuraux très conservés et présents sur l enveloppe des microorganismes (phospholipides, carbohydrates )mais absents sur les cellules eucaryotes. Ces structures reconnues sont des PAMPs (pattern-associated-molecular-patterns). Comparaison entre le système inné et le système adaptatif ( un peu fictif car il existe des interconnexions entre les deux systèmes ). Système inné Système adaptatif Origine Archaïque déjà présent sur plantes. 400 millions d années, retrouvé chez les vertébrés à mâchoires Motif reconnu Motifs conservés (PAMPs) Détail spécifique de la structure moléculaire (peptides) avec notion de processing (clivage, ) pour Récepteurs PRR invariants sans réarrangement, pas de clonalité, distribution cellulaire variée (PNN, PNE, monocytes, macrophages,.) Théoriquement parfaite Discrimination soi/non soi Délai Immédiat Retardé Mémoire Absente Présente aboutir aux antigènes TcR et Bcr qui ont subis des réarrangements, avec clonalité et spécificité entre interaction antigène-récepteur Imparfaite (ex. des maladies autoimmunes)
I) Les récepteurs de l immunité innée L immunité innée comprend 3 étapes : reconnaissance, activation et augmentation des chimiokines et cytokines inflammatoires (IL1, IL 6, IL8, TNF α ) Il existe 3 types de récepteurs PRR : - les récepteurs solubles (1 famille) - les récepteurs trans-membranaires dont la famille des TLR (Toll-like-receptor) (5 familles) - les récepteurs intra-cellulaires (1 famille). Ce sont les NOD. Pour détailler ces 7 familles de récepteurs : 1)Les récepteurs solubles comprennent les collectines et les ficolines, ce sont des récepteurs circulant qui peuvent fixer les pathogènes (leishmania ). 2)Les lectines de type C. Ce sont des récepteurs qui permettent la phagocytose ex : -MMR pour Mannose-Macrophage-Receptor qui reconnaît le mannose -dectine qui reconnaît le groupement β-glucan des levures -DC-sign sécrété par les cellules dendritiques mais aussi les macrophages 3)Les récepteurs scavanger (veut dire poubelle) qui reconnaissent les corps apoptotiques ou les produits du métabolisme lipidique (reconnaît le LPS mais aussi plasmodium ) 4)Les TLR avec 11 types clonés à ce jour. Ce sont des récepteurs trans-membranaires qui peuvent agir en monomères ou en hétéro dimères (TLR2/TLR1 et TLR2/TLR6) -Le TLR4 fonctionne avec des protéines accessoire car seul ne reconnaît pas le LPS. Nécessite la LBP (LPS-binding-protein) -Le TLR3 dont on connaît un seul ligand DNA double brin (rôle dans les infections virales ) -Le TLR5 qui lie la flagelline -Le TLR 7 et 8 qui lient l ADN hypométhylé (bactérien) car l ADN des mammifères est plutôt méthylé. -TLR9 qui lie les complexes immuns et le DNA -Le TLR 10 dont le ligand est inconnu 5)et 6)Les récepteurs du complément sous divisés en récepteurs du complément et en récepteurs des Fc (FcR) qui aident à la phagocytose des complexes immuns et sont donc à cheval entre inné et adaptatif 7)Les récepteurs NOD qui reconnaissent en intracellulaire des éléments de type LPS II) Les Toll Receptor Toll a été découvert chez la drosophile et a 2 rôles essentiels : dans l ontogenèse, il assure la polarité dorso-ventrale et il est également responsable de résistance anti-microbienne. Plusieurs homologues ont été découverts chez les vertébrés clonés identifiés, ce sont les Tolllike-receptor (TLR). Ces ont des protéines transmembranaires, phylogénétiquement conservées. Chez la drosophile : -reconnaissance du ligand par le récepteur TOLL
-voie de transduction activée 1 er acteur est MyD88 qui est un adaptateur moléculaire et qui permet le recrutement d enzymes notamment tube et pell qui sont des kinases. -activation d un facteur de transcription (DIF) qui appartient à la famille des protéines NF-κB -fixation sur le promoteur du gêne et activation de la transcription de peptides antimicrobiens comme la drosomycine ou la défensine. III) Les Toll Like Receptor 1) Généralités Famille de 11 récepteurs transmembranaires (en surface ou au sein de la paroi de l'endosome) Fonction de reconnaissance des PAMPs. De façon spécifiques, ils reconnaissent un ou plusieurs ligands Certains nécessitent des protéines accessoires (TLR4) 2) Biochimie Ce qui caractérise les TLR sont : -des domaines répétés riches en leucine (LRR) -une portion transmembranaire -une portion TIR (toll interleukine receptor) qui a été retrouvé sur les récepteurs à interleukine IL1 et IL 18 d'où son nom. MyD88 par son domaine TIR va pouvoir interagir avec ce domaine TIR du récepteur TLR. Les récepteurs TLR6/TLR2, TLR1/TLR2, TLR5 et TLR4 reconnaissent des éléments à la surface des bactéries. Ils sont présents au niveau de la membrane cytoplasmique Les récepteurs TLR3, TLR7, TLR8 et TLR 9 restent à l'intérieur de la cellule au niveau de l'endosome (ce qui est logique puisque ce sont des récepteurs aux acides nucléiques qui nécessite une digestion de la bactérie pour pouvoir être activés par ces acides nucléiques) 3) Transduction du signal L'ojectif final est la production de cytokines inflammatoires de chimiokines et d'interféron de type 1 (i.e. α ou β). (ne pas confondre avec l'ifn de type 2 (i.e. γ) qui est surtout retrouvé dans l'immunité adaptative) Le TLR avec sa portion TIR intracellulaire va recruter MyD88 (là aussi par son domaine TIR). Il y a ensuite une activation d'irak (kinase) puis de TRAF qui va libérer NF-κB qui était lié à IκB. NF-κB peut alors se transloquer dans le noyau et activer les promoteurs responsables de la synthèse des interleukines (IL1, IL6, ) et des IFN de type 1. On pensait initialement que MyD88 était le seul adaptateur pour tous les TLR, en fait on a mis en évidence d'autres adaptateurs : TRIF (ou TICAM1), TIRAP (ou MAL), TRAM (ou TICAM2). En aval de façon identique, il y a une cascade de kinases.
Il existe donc des voies MyD88 dépendantes et des voies MyD88 indépendantes. Rappel, TLR4 ne peut pas reconnaître le LPS seul et nécessite LBP ainsi que le CD14. C'est ce complexe LBP, CD14 qui se rapproche de TLR4 et qui fonctionne par la suite avec MD2 4) Mise en évidence du rôle des TLR - rôle du TLR 4 on prend 4 types de souris la souris lps qui a un récepteur TLR4 naturellement déficient la souris L3H/HeJ qui a une mutation du domaine TIR detlr4 le rendant inefficace la souris KO pour TLR 4 (TLR4-/-) la souris KO pour le CD14 (CD14-/-) Ces différents souches sont plus sensibles aux infections par les bactéries gram négatif (par défaut de reconnaissance ou de transduction). Par contre, ces souris sont résistantes au LPS. Normalement, avec de fortes doses de LPS, la souris fait un choc septique car l'ifn entraîne une augmentation de la perméabilité vasculaire. Les souris mutantes ou déficientes ne font pas de choc car elles ne produisent pas d'ifn. -rôle des autres TLR des souris KO pour les différents TLR, les protéines adaptatrices ont été effectuées Souris KO pour TLR4 Pas de réponse au Réponse au PG Sensibilité aux BGN LPS Souris KO pour TLR2 Réponse au LPS Pas de réponse au PG Sensibilité au BGP Souris KO pour Pas de réponse au Pas de réponse au PG Sensibilité BGP et Myd88 LPS BGN Souris contrôle Réponse au LPS Réponse au PG normal PG = peptidoglycane; BGN = bactéries gram négatif; BGP = bactéries gram positif. III) Liens entre immunité innée et acquise 1) Zoom sur le rôle des interférons L IFN joue un rôle sur l immunité innée mais aussi dans l immunité adaptative. IRF = IFN responsive factor En réponse à une activation de TLR4 et de TLR3, on a une activation d IRF3 qui conduit à la synthèse d IFNβ. Pour le TLR3 ou 4 : -il y a une voie dépendante de MyD88 qui conduit à la production de cytokines inflammatoires. -Il y a une voie MyD88 indépendante (via TRIF) qui conduit à la synthèse d IFN β (l IFNβ permet d augmenter la présentation de l antigène).
Pour TLR 7, 8 ou 9 : -il y a une voie dépendante de MyD88 qui aboutit à la production d IRF7 et à la synthèse d IFNα. Au total, l activation des TLR entraîne -une réaction inflammatoire par la production de TNFα, d IL6, d IL8, d IL12, d IL1 -une réponse antivirale par la production de IFN de type 1 (α ou β) -une activation de l immunité adaptative (IFN de type 1 et IL 12) qui augmente les molécules de co-stimulation CD80 et CD86 et qui fait maturer les cellules présentatrices de l antigène (CPA). 2) rôle dans la maturation cellulaire Pour rappel, les IL et le TNF conduisent à : -une activation de l endothélium vasculaire et permettent le recrutement de cellules de l immunité innée ( PNN et macrophages sanguins et LyB ou LyT situés dans les ganglions) -induisent une fièvre -permettent la synthèse des protéines de la phase aiguë de l inflammation Les CPA (cellules dendritiques +++) expriment des PRR dont les TLR et elles ont un rôle majeur dans le lien inné-adaptatif. On les retrouve dans 2 états : -l état immature en périphérie ou elles peuvent phagocyter les agents pathogènes et ou la présentation de l antigène est de mauvaise qualité. -une forme mature qui ne sait plus faire de phagocytose, qui devient apte à présenter l antigène et qui migre pour rejoindre les organes lymphoïdes secondaires. Ce sont en partie les IFN qui font migrer les cellules et participent à leur maturation. Par leurs PRR, les CD permettent : -une reconnaissance du pathogène -une augmentation de l expression du CMH II et une augmentation de la phagocytose permettant un chargement des antigènes sur les CMH de classe I ou II et la présentation antigénique auprès des Ly T. -une augmentation de la production de l IL12. -une modification de l expression des récepteurs des chimiokines permettant une migration cellulaire. Ex :CLR 6 retient le cellule en périphérie et en maturant, la cellule exprime CLR7 qui n a pas de ligand en périphérie mais par contre il existe des ligands à CLR7 dans les organes lymphoïdes secondaires. Comment montrer que les TLR sont importants dans la maturation cellulaire? L adaptateur moléculaire est MyD88, on crée donc des cellules KO pour Myd88 et on regarde l expression de CD80/CD86 : -Si la cellule est Myd88 + on constate une augmentation de CD80/CD86 ce qui n est pas le cas pour les cellules KO pour MyD88.
-On a besoin de 2 contrôles car il peut s agir d un problème d induction du signal ou un problème dans sa capacité à maturer. Le fait qu il y ait une réponse avec injection de TNFα ou d anti CD40 montre que la cellule conserve bien sa capacité de maturer. Idem pour la production d IL12 et pour l augmentation des Ly T et B ce qui témoigne du lien inné-acquis. ( Depuis 2005, il a été mis en évidence que des cellules du système immunitaire adaptatif peuvent exprimer des TLR en particulier les lymphocytes B et que ces TLR sont important dans la production en anticorps et pour l activité des LyB) IV) Régulation des TLR Plusieurs sites de modulation de leur activité : - il existe des récepteurs solubles connus TLR2s et TLR4s (qui empêchent donc la stimulation des TLR membranaires) - il y a une régulation négative intracellulaire (ex MyD88s, IRAKM ). Ex : MyD88s (pour short) n arrive pas à activer en aval, A20 inhibe TRAF6 - Il existe des régulateurs trans-membranaires (STL2, SIGIRR ). Ex : TRAILR inhibe NF-κB, SIGIRR inhibe IRAK Dok 1 et Dok 2 sont des régulateurs, on regarde la réponse TNF des patients wild-type (WT ou sauvage) ou Dok1 et Dok2 KO. Quand Dok1 ou Dok2 sont KO, on constate une augmentation de la production de TNF (du fait de l absence de rétrocontrôle négatif). Ces souris sont hypersensibles au LPS et même en injectant de petites doses, les souris présentent un choc septique, il y a donc plus de décès. V) Les récepteurs NOD Ce sont des récepteurs strictement intracellulaires constitués de 3 portions : -un domaine riche en leucine (LRR) -un domaine LRS -1 ( pour Nod1) ou 2 (pour Nod2) domaines CARD. Ces domaines activent NF-κB par une succession de kinase (dont RICK) Les gênes Nod comme TLR sont très conservés au cours de l évolution. Il y a 8 membres identifiés. Ils sont de localisation intracellulaire dans les cellules épithéliales., La majorité des ligands ne sont pas connus (Nod1 et Nod2 reconnaissent des peptidoglycanes de BGP pour Nod1 et de BGP ou BGN pour Nod2). VI) Pathologie Les patients qui ont une déficience en IRAK4 ont des infections récurrentes à streptocoque ou Staphylocoque. Ces patients n ont pas de réponse en IL6 et en TNF après différentes stimulation. Par contre, des produits comme PMA-iomycine permettent une production de TNF ou d IL. Ensuite, il faut s assurer que TLR est bien produite avec des Ac marqués ou en cytométrie de flux et on peut tester toutes les molécules de la voie puis il faut s assurer que la molécule présente est fonctionnelle (par séquençage). On montre ainsi qu IRAK4 est absente.
3 types de mutations ont été identifiées : IRAK4, NEMO (intervient dans le complexe avec NF-κB) et IκBα. Conclusion : En schématique -reconnaissance par des PAMPs -transduction du signal -phase d induction de l inflammation et de la phagocytose -phase d induction de la maturation des CPA et rôle de lien avec l immunité adaptative. Il existe bien entendu une régulation négative avec en cas de défaut une inflammation chronique ( ex de la maladie de Crohn). Le défaut de signalisation peut induire une sensibilité accrue aux infections. Il y a des idées en projet d associer des ligands des TLR comme adjuvant des vaccins, en particulier pour les vaccinations anti-tumorales. P.S. : Ce cours a été fait en lien avec les diapositives du professeur, et je vous invite donc vivement à regarder les schémas des diapositives qui valent parfois beaucoup mieux que du texte.