Introduction à la Cytométrie en Flux

Introduction à la Cytométrie en Flux

Cytométrie en flux Technique permettant de compter et caractériser des cellules en les faisant défiler à grande vitesse dans un faisceau lumineux. La caractérisation est basée sur l étude de la lumière réémise (par diffusion ou fluorescence). Technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de cellules en suspension dans un liquide. 2 2

Que sait faire un cytomètre en flux? Compter des cellules en suspension Mesurer la lumière diffusée mais aussi la fluorescence d une cellule, ou de marqueurs cellulaires Trier des cellules individuelles pour des analyses ultérieures Séparer les cellules vivantes et mortes Analyser 10 5 à 5x10 6 particules en moins d une minute. 3

Principes techniques La cytométrie en flux appliquée à l armée : 4

Principes techniques La cytométrie en flux appliquée à l armée : 5

Composantes d un cytomètre Le système fluidique Introduction et positionnement des cellules à analyser Le système optique Production et recueil des signaux lumineux Le système électronique Conversion des signaux optiques en signaux électroniques et numérisation pour analyse informatique 6

Système fluidique Il faut pouvoir étudier des cellules uniques. Il faut donc «ordonner» l échantillon en un flux de cellules uniques Centrage hydrodynamique : Echantillon dans le canal central Liquide entraineur Laser Cf. Introduction to flow cytometry, M. Rahman 7

L optique Après le centrage hydrodynamique, chaque particule passe à travers un ou plusieurs faisceaux lumineux. La lumière diffusée par la particule ou son signal de fluorescence seront étudiés. sources d excitation : Des lasers Des lentilles pour mettre en forme et focaliser la source d excitation. collection des signaux : Un système de miroirs et de filtres pour diriger et sélectionner certaines longueurs d onde vers les détecteurs. 8

Trajet optique dans un cytomètre 9

Informations apportées sur la cellule Sa taille relative forward scatter / diffusion aux petits angles Correspond à la lumière diffractée Sa granularité ou sa complexité interne relative side scatter / diffusion aux grands angles Correspond à la lumière réfléchie Son intensité relative de fluorescence 10

Signaux de diffusion Diffusion aux petits angles (forward scatter) : La lumière diffractée est collectée sous un petit angle (entre 1 et 10 ) Le signal est relatif à la taille de la cellule Diffusion aux grands angles (side scatter) La lumière diffusée est collectée à 90 de l axe du laser Le signal est relatif à la granularité et la complexité cellulaires 11

Application : cellules sanguines Intensité de diffusion aux petits angles Monocytes : famille des leucocytes (globules blancs) : - les plus grandes cellules circulant dans le sang - Rondes ou ovales, mesurent de 15 à 40 µm de diamètre. Granulocytes (plusieurs sortes) taille d environ 15µm Lymphocytes : cellules ovoïdes, nucléées, dont le noyau de grande taille (environ 7 µm, soit le diamètre d'un globule rouge) occupe quasiment tout le corps cellulaire. Intensité de diffusion aux grands angles 12

Signal de fluorescence On peut utiliser des marqueurs fluorescents pour obtenir des informations supplémentaires. Ex : anti-corps fluorescents Très utile pour identifier et quantifier des populations distinctes de cellules, des récepteurs membranaires, mesurer des activités enzymatiques 13

Fluorescence : colorants usuels Fluorophores «simples» COLORANT LIAISON/FONCTION l EX.* l EM.@ Hoechst 33342 ADN (bases A-T) 365 402 DAPI ADN (bases A-T) 357 451 Iodure de Propidium ADN (intercalant) 370, 560 631 Bromure d Ethidium ADN (intercalant) 370, 530 622 Acridine Orange ARN/ADN 492/492 527/630 Alexa 430 conjugaison 430 540 FITC conjugaison 490 543 PE conjugaison 565 578 PerCP conjugaison 488 675 APC conjugaison 642 660 PerCP/Cy5.5 conjugaison 488 695 Cy5.5 conjugaison 678 703 APC/Cy7 Protéines 650 767 Rhodamine 123 potentiel mitochondrial 505 534 BCECF-AM ph 440 530 SNARF-1 PH/traceur 488 580/630 Cascade blue traceur 399 423 Fura Red Ca 2+ 450-500 660 INDO-1-AM Ca2+ 331 405/480 Fluo-3 Ca 2+ 506 526 cf cours précédent 14

Fluorophores en tandem On met un petit fluorophore «à cheval sur» un plus gros. Le premier absorbe à la longueur d onde du laser d excitation. Mais au lieu de se désexciter par fluorescence, il transmet son énergie de façon non radiative au second fluorophore qui émet plus dans le rouge. C est le FRET (pour transfert d énergie résonant de Förster) C est une façon d augmenter le décalage de Stokes et de sonder plus de couleurs avec le même laser. 15

Förster Resonant Energy Transfer Donneur Cy3 Accepteur Cy5 excitation emission Intensité Transfert d énergie Taux de transfert d énergie : k 1 & R = $ % r T τ D 0 6 #! " excitation (nm) détection τ D, durée de vie du donneur sans accepteur r, distance donneur-accepteur R 0, rayon de Förster (5,3 nm pour Cy3/Cy5) 16

Attention au recouvrement spectral on utilise 2 fluorophores en tandem (FL-1 et FL-2) avec les spectres d émission suivants largeur spectrale d observation dans les canaux A et B Spectre de fluorescence longueur d onde Recouvrement spectral : le spectre d émission de FL-2 est partiellement inclus dans le canal A et celui de FL-1 dans le canal B 17

Bilan sur les signaux mesurés Paramètre Signification Utilisation Diffusion aux petits angles Diffusion aux grands angles Fluorescence(s) Proportionnel au diamètre cellulaire Reflète le contenu cellulaire & la granularité Proportionnelle à l intensité de marquage Identification morphologique des cellules Identification morphologique des cellules Marqueurs cellulaires, ADN, ARN, fonctions cellulaires 18

Routine : Applications de la cytométrie en flux Immunophénotypage (exemple en hématologie) Quantification du contenu en ADN (cancérologie, ) Cycle cellulaire Viabilité (test MTT) Recherche : Caryotype Flux ioniques Stress Oxydatif Fluidité membranaire Cycle cellulaire, prolifération, apoptose 19

Exemple : immunophénotypage lymphocytaire But : identifier les différentes sous-populations de lymphocytes dans le sang, la moelle, 20

Le(s) lymphocyte(s) Lymphocyte Lymphocyte B Cible : micro-organismes et cellules infectées Rôle : sécréter des anticorps qui, en s'attachant aux micro-organismes ou aux cellules infectées, faciliteront leur destruction. 10 m Cellule NK (Natural Killer) Cible : cellules infectées Rôle : tuer les cellules dont l apparence est anormale Lymphocytes T auxiliaires Rôle : activer les lymphocytes T cytotoxiques Lymphocytes T cytotoxiques Cible : cellule infectée Rôle : tuer les cellules infectées 21

Choix des anticorps Le typage cellulaire repose sur l'existence, à la surface des cellules ou dans leur cytoplasme, de molécules spécifiques appelées antigènes de différenciation. Depuis la fin des années 1970, des anticorps monoclonaux permettent de détecter très précisément les antigènes de différenciation des globules blancs. Ces réactifs ont été regroupés en classes (ou clusters) de différenciation, les CD. En 1994, 130 classes de différenciation se trouvent définies, ce vocable s'appliquant indifféremment à un anticorps ou à l'antigène de différenciation qu'il reconnaît. 22

Les lymphocytes et leurs CD Lymphocyte Lymphocyte B CD19 Cellule NK (Natural Killer) CD16 CD56 Lymphocytes T auxiliaires CD3 CD4 Lymphocytes T cytotoxiques CD3 CD8 23

Repérage des cellules sanguines par cytométrie Repérage suivant taille et granulosité double marquage pour discriminer les lymphocytes B (CD19+) et T (CD3+): - CD19 marqué à la phycoerythrine (PE) è lymphocytes T - CD3 marqué à la fluoresceine (FITC) è lymphocytes B Analyse dans les lymphocytes 24

Repérage des cellules sanguines par cytométrie Repérage suivant taille et granulosité double marquage pour discriminer les lymphocytes B (CD19+) et T (CD3+) CD19 - PE Analyse dans les lymphocytes CD3 - FITC 25

Détails techniques pour opticiens a b PE FITC a Voici le cytogramme brut obtenu et les spectres d émission de FITC et PE b 26

Détails techniques pour opticiens a b canaux d observation PE FITC a Fluorescence de FITC «bave» sur le canal de PE à tous les points correspondant à un fort marquage FITC «remontent» Idem pour PE, mais l effet est beaucoup plus faible b 27

Détails techniques pour opticiens a b PE Height FITC-Height cytogramme brut a FITC-Height après compensation b 28

Possibilités d analyse Très grand nombre de cellules (à 10 6 ) Cytomètres pouvant analyser jusqu à 10 paramètres différents En pratique : 4 à 5 couleurs de fluo différentes 29

Possibilités d analyse Lymphocytes T auxiliaires Lymphocytes T auxiliaires CD3 CD4 Lymphocytes T cytotoxiques CD3 CD8 Lymphocytes T cytotoxiques 30

Numération Lymphocytes T CD4 et CD8 Norme Lympho tot 1700-4000/mm 3 Ratio CD4/CD8 1,6±0,5 SSC CD3 CD3 CD4 CD8 à Immunodépression 31

Représentation schématique 32

Sources Intro inspirée de http://cytobase.montp.inserm.fr/cours/cours.html et de Introduction to flow cytometry, M. Rahman T21 : http://www.musee-afrappier.qc.ca/fr/index.php?pageid=3113d&page=3113d-defensef ; http://www.vulgaris-medical.net/upload/lymphocyte535_a880f.jpg ; Procidis T26 à 28 : issu du cours de Christophe Duperray (Inserm Montpellier) http://cytobase.montp.inserm.fr Immunophénotypage lymphocytaire : cf cours de Michelle Rosenzwajg, service de biothérapies/upmc CNRS/UMR7211/INSERM U959 http://adrien.six.online.fr/descli2009/document/descli2009_et05_screen.pdf T34 : http://acces.ens-lyon.fr/acces/logiciels/externes/winmdi/didacticiel-de-winmdi/ cytometr.htm 33