Diagnostic microbiologique au cabinet médical et au laboratoire Nadia Liassine 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 1
Tests rapides - définitions TDR Tests de Diagnostic Rapide. TROD Tests Rapides à Orientation Diagnostique. PST «Patient Self Testing» (autotests) ou «home testing» (tests à domicile) : tests réalisés par le patient lui-même. POL «Physician Office Labs» ou «doctor s tests» : tests réalisés par le médecin. POCT «Point Of Care Testing» : tests prescrits au sein d une institution médicale (hôpital, dispensaire, ambulance, ) mais pouvant être réalisés hors de l enceinte du laboratoire. Nombreuses dénominations anglo-saxonnes : bedside testing, near-patient testing, physician s office testing, extra-laboratories testing, decentralized testing, off-site testing 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 2
Tests de diagnostic rapide Conditions Réalisation rapide (souvent 30 mn) Utilisation aisée sans interférence sur la qualité Obtention précoce de résultat Rapidité Réduction des phase pré-analytique, analytique et post-analytique Simplicité Réalisation par du personnel non spécialisé 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 3
Lieux d utilisation des tests rapides A l hôpital Hors hôpital Equipes de secours Unités de soins intensifs. Laboratoires satellites. Urgences, salles d opération, salles d accouchement. Cliniques et centres spécialisés. Centres de soins urgents. Cabinets de médecins et praticiens. Domicile Médecine préventive. Dispensaires. Dans l espace. Hélicoptères et autres véhicules pour transport de patients. Bateaux, sous-marins. Ambulances et autres véhicules d urgence. Lieu de l accident. Camps militaires et champs de bataille. 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 4
Un peu de calcul Caractéristiques intrinsèques d un test Sensibilité : probabilité que le test soit positif chez les malades (VP/VP + FN). Spécificité : probabilité que le test soit négatif chez les non-malades (VN / VN + FP). Malades et non malades sont préalablement définis par un test de référence («gold standard»). Performances d un test en situation de terrain (prévalences variables de la maladie) Valeur prédictive positive (VPP) Valeur prédictive négative (VPN) Nouveau test Test de référence positifs négatifs positifs VP FP négatifs FN VN VP + FN FP + VN Echelle de performance (sensibilité ou spécificité) Très élevée: > 95% Élevée: 90-95% Bonne: 80-90% Modérée: 70-80% Faible: < 70% 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 5
Eléments de décision pour le clinicien VPP : probabilité d avoir la maladie quand le test est positif. VPN : probabilité de ne pas avoir la maladie quand le test est négatif. VPP et VPN sont calculées en tenant compte de la sensibilité, de la spécificité et de la prévalence de la maladie (thèorème de Bayse). Pour un test de même sensibilité, VPP et VPN varieront en fonction de la prévalence : Plus la prévalence est élevée, plus la VPP augmente. Plus la prévalence est faible, plus la VPN augmente. Traduit la transformation d une probabilité pré-test (prévalence) en une probabilité post-test (valeur prédictive). 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 6
Au cabinet médical... 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 7
En Suisse Ordonnance sur les prestations de l assurance des soins, OPAS, liste des analyses : http://www.bag.admin.ch/themen/krankenversicherung/00263/00264/04185/index.html?lang=fr 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 8
En Suisse Analyses dans le cadre des soins de base Ordonnance sur les prestations de l assurance des soins, OPAS, liste des analyses http://www.bag.admin.ch/themen/krankenversicherung/00263/00264/04185/index. html?lang=fr Microbiologie liste partielle 1 Urine slide, négatif ou positif Microscopie traditionnelle, coloration comprise (Gram, Giemsa, bleu de méthylène, etc.) Streptococcus beta-hémolytique du groupe A par méthode rapide Microbiologie liste partielle 2 Microscopie spéciale, préparation native (sur fond noir, polarisation, contraste de phase) HIV-1 et HIV-2, anticorps, screening, par test rapide, ql Chimie liste partielle 1 Sédiment, examen microscopique Bilan urinaire, partiel, 5-10 paramètres Liste élargie pour les médecins avec certains titres post-grades Dermatologie et vénérologie Microscopie spéciale Culture de champignons Parasite, recherche au microscope, dans une ponction Filaires et microfilaires par microscopie Flagellés dans le sédiment Gastroentérologie Helicobacter pylori par test de l uréase (biopsie) Gynécologie et obstétrique Microscopie spéciale Champignons sur milieux commerciaux Médecine tropical et médecine des voyages Microscopie spéciale Parasitologie 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 9
Diagnostic présomptif des infections urinaires Bandelettes urinaires: leucocytes (activité leucocyte estérase), production de nitrites, sang Utilisation et interprétation faciles Rapidité: lecture en 30 secondes Paramètres sang, leucocytes, nitrite pour le dépistage d une infection urinaire : Sensible 95% Peu spécifique 47% VPP médiocre 24% VPN élevée 98% Remarque : délais de péremption; conditions de conservation et d utilisation; délai de lecture Tarification 1 pt CQE : oui CQE Site CSCQ (Centre Suisse du Contrôle de Qualité) http://www.cscq.ch/sitecscq/ SiteCSCQ_FR/EnqueteFR.html http://www.cscq.ch/sitecscq/sitecscq_fr/pageaccueilfr.html Information spécifique 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 10
Urotubes (lame immergée) Dispositif avec géloses sur lames Gélose non sélective: CLED Gélose(s) sélective(s) Mac Conkey (bacilles Gram négatif) Autre Mode opératoire Prélèvement: urine avec 2 heures de rétention Immerger complètement les 2 faces de la lame Absorber le surplus d urine Incuber Lecture Au cabinet: négatif ou positif Au laboratoire: identification + antibiogramme Limites Urotubes: dates d expiration; conditions de conservation; état des géloses Mode opératoire Ensemencement incorrect Urine au fond du tube Lecture attentive 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 11
Faux 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 12
Test rapide Streptocoque A Angines Etiologies Enfants: virales: 60 à 75% Strepto A: 25 à 40% Adultes Virales: 75 à 90% Strepto A: 10 à 25% La clinique ne permet pas de différencier une angine virale d une angine streptococcique Complications des angines à Streptocoques Complications infectieuses Syndrome inflammatoire post-streptococcique (Erythème noueux, Chorée, Glomérulonéphrite, RAA) Prévention des complications post-streptocciques: délai de 10 jours pour démarrer le traitement Rhumatisme articulaire aigu Maladie inflammatoire immunologique Se développe chez 2-3% des patients lorsque l activité infectieuse se prolonge au moins 10 jours Atteinte des sujets jeunes (5-22 ans) Différents facteurs prédisposants (génétique, âge, environnement) Incidence variable selon les pays Suisse (données du Swiss Paediatric Surveillance Unit depuis 2000): incidence inférieure à 0.1 cas / 100 000 habitants /an Pays en voie de développement: 240 cas / 100 000 habitants /an Pronostic: gravité de l atteinte cardiaque (atteintes valvulaires) Conduite à tenir? Traiter toutes les angines de l enfant par antibiotique? Sur-prescription antibiotique? 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 13
Attitude pratique lors de l utilisation des TDR Angine aigue TDR Positif Négatif Facteurs de risque RAA ATCD perso RAA 5-25 ans + Environnement Ou Épisodes multiples Ou Région Endémie * antalgique, antipyrétique Antibiotique Positive Antibiotique Facteurs de risque RAA Culture Négative Traitement symptomatique * Pas de Facteur de risque RAA ** Traitement symptomatique * ** stt si évocateur de virose, +/- revue à 3jours 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 14
Tests de diagnostic rapide par immuno-chromatographie 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 15
Test de diagnostic dans la prise en charge des angines à streptocoques bêta-hémolytiques du groupe A Annales de Biologie Clinique. Volume 62. Numéro 5. 573-7, Septembre-Octobre 2004, pratique quotidienne. 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 16
Test de diagnostic dans la prise en charge des angines à streptocoques bêta-hémolytiques du groupe A Annales de Biologie Clinique. Volume 62. Numéro 5. 573-7, Septembre-Octobre 2004, pratique quotidienne. 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 17
Tests rapides Streptocoque A Evaluation Evaluation Caractéristiques intrinsèques des tests La sensibilité varie en fonction du personnel La sensibilité varie en fonction du personnel et du type de test (Allemagne, Toepfner, 2013, Eur J Clin Microbiol Infect Dis) Personnel de laboratoire > personnel non laboratoire entrainé > personnel non laboratoire. Importance de l expérience cumulée. (USA, Fox, 2006, JCM). Pas de différences pour les tests négatifs; différences pour les tests positifs; personnel de laboratoire > personnel non laboratoire (Finlande, Nissinen, 2009, Eur J Clin Microbiol Infect Dis). Comparaison technicien de laboratoire et médecins Durée étude: 3 ans Test latex, médecins: les plus mauvais résultats (S: 44.4%; SP: 8.3%; VPP: 26.7%; VPN: 16.7%) Immunoessai: C est mieux! (incl. médecins) (S: 100%; SP: 92.6%; VPP: 84.6%; VPN: 100%) 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 18
Test VIH Détection des anticorps anti-vih1 et 2 (+ Ag p24 pour les tests de 4ème génération) TROD: test rapide d orientation diagnostique Caractéristiques des tests: excellentes Remarque: lecture attentive pour les positifs faibles Cave: délai de positivité de 2 à 3 mois après primo-infection 1 cas positif doit toujours être confirmé Indications Accident sécurité biologique Femmes enceintes avec status sérologique VIH inconnu avant accouchement «test rapide» centres de dépistage (p.ex. Checkpoint) 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 19
Test de dépistage VIH et valeurs prédictives Caractéristique des tests : très sensibles: 0.99 très spécifiques: 0.999 Prévalence du VIH : Population générale: 1/300 Population à risque: 5% à 35% Si le test est positif en population générale : VPP = 0.99*0.003 / (0.99*0.003 + 0.0001*0.997) = 96.75% 3 personnes sur 100 seraient inquiétées à tort Si le test est positif en population à risque (prévalence = 0,3) : VPP = 0.99*0. 3 / (0.99*0. 3 + 0.0001*0. 7) = 99.97% 3 personnes sur 10 000 seraient inquiétées à tort 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 20
Limites des TDR Fiabilité: sensibilité, spécificité Réalisation pratique: qualité du prélèvement (p.ex. frottis de gorge), compétence de l opérateur, formation des personnels Risque d erreur post-analytique Mettre en place des programmes d assurance qualité Chaque TDR a ses caractéristiques propres qui doivent être connues pour une utilisation rationnelle 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 21
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Au laboratoire Prélèvements? Résultats 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 24
Ecouvillons 1 Ecouvillons tige en bois embout coton 2 Ecouvillons tige en plastic embout dacron 3 Ecouvillons tige en plastic embout dacron avec milieu de transport gélosé 4 Ecouvillons eswab avec milieu de transport liquide 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 25
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Au laboratoire Prélèvements J0 J1 J2 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 27
Diagnostic phénotypique Prélèvements J0 Ensemencement Examen microscopique J1 J2 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 28
Examens microscopiques Ce sont des tests rapides! Coloration de Gram (bactéries) Sensibilité: 10E3 à 10E4 bactéries /ml Germes Présence ou non Type de germes: Gram plus/gram neg liquides de ponction; prélèvements perop; hémocultures positives Autres colorations en microbiologie Ziehl ou auramine: BAAR (tuberculose) MGG: Plasmodium 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 29
Diagnostic phénotypique Prélèvements J0 Ensemencement Examen microscopique J1 Cultures J2 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 30
Prélèvements J0 Ensemencement Examen microscopique J1 Cultures J2 Identification Antibiogramme 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 31
Tests rapides Prélèvements J0 Ensemencement Examen microscopique J1 Cultures J2 Identification Antibiogramme 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 32
Tests rapides au laboratoire Détection Antigène ou anticorps Méthode Aglutination; immunocapture ou immunochromatographie sur membrane Séquence génomique (acide nucléique) PCR en temps réel 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 33
Tests diagnostiques rapides (TDR) : la panacée pour le praticien? Valérie D Acremont, Blaise Genton, Gilbert Greub - Rev Med Suisse 2011;7:984-990 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 34
Ag urinaire Legionella Légionellose Suisse: 250 à 300 cas /an Mortalité: 5 à 10% Maladie à déclaration obligatoire Diagnostic classique Culture: difficile et longue; laboratoires spécialisés IFD (immunofluorescence directe) sur prélèvements: difficile Sérologie: diagnostic tardif PCR Test rapide Durée du test: 15 minutes Sensibilité: bonne 80-90% Spécificité: très élevée > 95% Limites : Absence de culture: pas d antibiogramme; pas de typisation des souches Uniquement Legionella pneumophilia type 1 (80 à 90% des cas) Impact : majeur sur l épidémiologie de la légionellose en Suisse (le nombre de cas documentés a doublé; la majorité des cas diagnostiqués est basée sur l antigène urinaire) 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 35
Ag urinaire Pneumocoque Infections invasives à Pneumocoque 1er agent des pneumonies communautaires Agent majeur des méningites bactériennes Suisse: 9000 à 950 cas /an Maladie à déclaration obligatoire Ag urinaire Pneumocoque Diagnostic classique Culture: expectorations (peu sensibles); hémocultures Test rapide Durée du test: 15 minutes Sensibilité: faible 60-70% Spécificité: élevée 90-95% mais moindre chez l enfant (portage pharyngé) Impact : limité Le diagnostic microbiologique classique reste indiqué: plus sensible; antibiogramme. 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 36
Tests moléculaires rapides au laboratoire Automates de biologie moléculaire (extraction ADN, amplification, détection) Kits de détection spécifiques Avantages : Diminution des manipulations manuelles (diminution du risque de contamination, gain de temps) Travail possible par prélèvement Contrôles internes Limites Pas d adaptation possible des «cibles» au laboratoire Indications Laboratoires Automates délocalisés (POCTs) 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 37
MRSA sites de portage Prélèvements : nez, plis cutanés, autre (gorge, périnée) MRSA : Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Bactérie multi-résistante, suivi et contrôle par hygiène hospitalière (infections nosocomailes) Amplification moléculaire Automates pour diagnostic rapide (ex GeneOhm, GenXpert, Genoquick) La rapidité du diagnostic permet la diminution du nombre de journées d isolement inapproprié (diminution des coûts associés) Dépistage rapide et «universel» dans les hôpitaux: pas de gain sur le nombre d infections 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 38
Difficultés du diagnostic Diagnostic génotypique Faux- positifs : cassette SCCmec délétée du gène mec ou gène mec non fonctionnel Faux-négatifs : nouvelle cassette SCCmec non détectée; variant du gène mec Diagnostic Le diagnostic rapide par PCR est complété par le diagnostic classique (culture et antibiogramme) 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 39
Diagnostic moléculaire en microbiologie Une révolution diagnostique Un élargissement du spectre des agents infectieux diagnostiqués Tests de diagnostic rapides Tests de diagnostic «classique» ( 24 heures) 1 ou plusieurs cibles (PCR multiplex) Bactéries non ou difficilement cultivables Chlamydiae Mycobactéries (tuberculose) Coqueluche Virologie Outil diagnostique majeur Découverte de nouveaux virus (p. ex. virus hépatite C, SRAS, MERS-CoV) Epidémiologie (métagénomique) 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 40
Laboratoire de bactériologie Diagnostic phénotypique Prélèvements J0 Ensemencement Examen microscopique J1 Cultures J2 Identification Antibiogramme 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 41
Identifications bactériennes Miniaturisation Automatisation 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 42
Spectrométrie de masse Maldi-TOF Identification par spectrométrie de masse maldi-tof Principe: analyse d un spectre de masse d ions libres spécifique d un germe (comparaison avec les spectres d une base de données) 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 43
Spectrométrie de masse Maldi-TOF 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 44
Spectrométrie de masse Maldi-TOF Microbiologie Médicale CHU de Liège Cécile Meex 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 45
Prélèvements J0 J1 Cultures Identification par spectrométrie de masse J2 Identification Antibiogramme 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 46
Antibiogramme Différentes méthodes Disque-diffusion, microdilution (systèmes automatisés), CMI Durée: 6-18 heures La résistance aux antibiotiques est un phénomène adaptatif et évolutif (émergence de nouvelles résistances) Certains phénomènes de résistance sont difficiles à mettre en évidence Développements Mise en évidence des gènes de résistance Uniquement pour certains mécanismes (p.ex. MRSA) Utilisation de la technique Malditof En évaluation Uniquement pour certains mécanismes 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 47
L automatisation en microbiologie : ça commence! 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 48
Conclusions Développements majeurs du diagnostic microbiologique Tests de diagnostic rapide Diagnostic moléculaire Spectrométrie de masse Développements majeurs dans l organisation Informatique Automatisation Le monde microbien est un monde vivant et évolutif Pour un diagnostic de qualité, la collaboration du monde médical (cliniciens, laboratoires, chercheurs) est indispensable 2013 - Diagnostic Microbiologique - page 49