Anciens et Nouveaux Virus Respiratoires Laurent Andréoletti (PU-PH) Laboratoire de Virologie Médicale et Moléculaire, EA/IFR53 CHU et Faculté de Médecine de Reims
Virus et Infections Respiratoires Infections respiratoires hautes Rhinite Otite Pharyngite Laryngite Infections respiratoires basses Bronchites Bronchiolites Pneumonies Enfants <2ans/ 0-5 ans Adultes immunocompétents Adultes immunodéprimés Personnes âgées > 65ans Communautaires et /ou Nosocomiales
Infections Respiratoires Communautaires Incidence annuelle de la pneumonie communautaire aiguë Enfants > adultes de moins 75 ans ++ Enfants de moins de 5ans: 34 to 40 cases per 1000 (Europe et USA) Pays en voie de développement =Europe = USA McIntosh K, NEJM, 2002 Etiologie des pneumopathies communautaires aiguës de l enfant Virale dans 25 à 60 % des cas McIntosh K, NEJM, 2002
Virus et Infections Respiratoires Basses de l Enfant Bronchiolite 460 000 cas /an (30 % de la population des moins de 2 ans) Hospitalisations: augmentation de 9 % par an Bronchiolites récidivantes= d hyperréactivité bronchique développement de l asthme infantile Exacerbation de l asthme infantile 100 000 consultations /an aux urgences en France (2006)
Virus et Infections Respiratoires Basses de l Enfant En 2002 McIntosh K, NEJM, 2002
Identification de nouveaux virus respiratoires Allander et al., 2005 Foulogne et al., 2006
Anciens et Nouveaux Virus Respiratoires en 2008 BOCAVIRUS POLYOMAVIRUS KI & HU Parvoviridae ADN Polyomaviridae ADN
Virus et Pathologies Respiratoires Infections respiratoires hautes RVH, Coronavirus, hmpv para influenza: Rhinite VRS, Adenovirus Otite Adenovirus Parainfluenza Pharyngite ParaInfluenza Laryngite Infections respiratoires basses Bronchites VRS, Influenza Bronchiolites ParaInfluenza Coronavirus NL63,HKU Pneumonies hmpv Bocavirus Polyomavirus KI, HU Anciens virus nouvellement identifiés
Emergence de nouveaux virus respiratoires Surveillance viro-épidémiologique
Physiopathologie des Infections virales Respiratoires VRS: la réponse inflammatoire participe au pouvoir pathogène Days after infection Oppenshaw, 2007 ESCV, Lyon
Epidemiologie des infections respiratoires virales
Infections virales au cours du temps chez des enfants souffrant de Bronchiolite RSV HRVs EVs RSV HMPV HRVs EVs HMPV Possibilités de co-infections respiratoires Jacques et al. JCV 2006 Jaarti et al. EID 2004
Pourquoi documenter les infections virales respiratoires?? Permet d établir un diagnostic étiologique Prévention des infections nosocomiales Diminution de la prescription inadaptée d Antibiotiques Utilisation rationnelle d antiviraux Suivi épidémiologique et virologique Meilleure prise en charge des patients
Infection virale respiratoire : Le prélèvement nasopharyngé Prélèvement de référence en pédiatrie chez les 0 à 4 ans (CDC, WHO, 2007)
Infection virale respiratoire : Le prélèvement nasal Prélèvement de référence pour les virus Influenza chez l adulte (Invs 2008) A Virocult B Pasteur CNR grippe GROG Prélèvement nasopharyngé à stocker à 4 c
Diagnostic virologique Recherche des anticorps = Sérologie = Diagnostic indirect Recherche du virus ou de ses constituants = Diagnostic direct
Diagnostic virologique direct Culture cellulaire classique: MRC-5 MA-104 MDCK MA-104 MA-104 Detection des Antigènes viraux par IF ou techniques EIA Séroneutraisation sur culture par Ac Detection moléculaire et identification par séquençage moléculaire: PCR Temps réel réel, TA cloning, séquençage des gènes codant pour les protéines de surface ou de capside GT G A CT CA T CG ACCT G A TCT ACACT GGGG T AGT GC 1200 180 190 200 210 0 2158 2557
Détection des antigènes viraux par Immunofluorescence Cellule épithéliale respiratoire Anticorps monoclonal Influenza A Influenza B Microscope VRS uv Identification Para influenza I, II, III Adénovirus Rendu des résultats en 4 heures
Détection des virus respiratoires par culture cellulaire virus libres Cellule épithéliale respiratoire infectée Anticorps monoclonaux Cellules permissives En culture Rendu des résultats en 3 à 6 jours
Interprétation des résultats virologiques IF Culture Interprétation + en attente Infection virale + + Infection virale + - Infection virale; prélèvement 4 c?? - + prélèvement moyen: peu de cellules Acellulaire + mauvais prélèvement Acellulaire - mauvais prélèvement - - Absence d infection virale
Détection des infections respiratoires par culture cellulaire 11509 aspirations nasophayngées traitées par culture + IF 2444 (21.2%) de détections positives pour des virus respiratoirescommuns Adenovirus (6.2%) Para Influenza Virus III (2.8%) Influenza Virus B (0.9%) Influenza Virus A (10.%) RSV (55.2%) Enterovirus (10.3%) Rhinovirus (12.4%) Absence de détection des nouveaux virus respiratoires
Diagnostic virologique moléculaire Detection moléculaire et identification par séquençage moléculaire: PCR Temps réel TA cloning, séquençage Développement des test de RT-PCR Temps réel multiplex (9 à 12 virus respiratoires) Augmentation significative des taux de détection des virus respiratoires + 40 à +65 % de positivité
Diagnostic étiologique viral de la bronchiolite du nourrisson Diagnostic virologique classique Diagnostic + 42% VRS 37% NEGATIFS 59% PARA 3 3% Combinaison du diagnostic virologique classique et de la détection moléculaire INFL A 1% NEGATIFS 17% VRS 37% E+RH 9% 3ème agent étiologique INFL A 1% MPVh MPV 10%9% EV 2% 2ème agent étiologique RV RH 22% 22% PARA 3 3%
Épidémiologie de la bronchiolite du nourrisson Hiver 2001-2002 18 16 VRS 14 12 10 EV RVH 8 6 MPVh 4 2 0 2 pics épidémiques de RVH et EV au mois de mars et mai sept Oct. Nov. Déc. Janv. Fév. Mar. Avr. Mai Juin. Cas de bronchiolites survenant au printemps
Liste des souches de virus détectées
Barrettes de 8 puces à ADN
Lecteur de barrettes de puces à ADN
Exemple d interprétation d une puce à ADN Genomica. Positif RSV A et Bocavirus Carré servant à aligner la Grille de lecture RSV A RSV A BOC 1 BOC 1 BOC 2 CI CI Témoin de révélation Carré servant à aligner la Grille de lecture BOC 1 BOC 2 RSV A BOC 2 CI Carré servant à aligner la Grille de lecture Témoin de révélation
Diagnostic virologique classique des souches virales < 3 jours après le début des signes cliniques Ecouvillons- Nez-pharynx-Aspiration Rhinopharyngée Examen immédiat Immunofluorescence (IF), EIA Détection des antigènes NP A&B 30Min. à 2 heures IF Virus Influenza A IF Virus Influenza B Test rapide EIA RT-PCR 2 jours Culture virale, Labo L2 MDCK+Trypsine 2 à 4 jours
Diagnostic virologique classique des souches virales Détection des souches classiques virales à tropisme respiratoire Diagnostic journalier Prélèvement= ANP Si période épidémique VRS= Tests rapides VRS + Tests d Immunoflurescence 1 Monoclonal VRS Ac polyvalents Adeno, flua, FluB, Parainfluenza I, II,III + 2 Ac monoclonaux
Diagnostic virologique classique des souches virales Prélèvement= ANP Si période épidémique Influenza= Tests rapides FLU A/B + Tests d Immunoflurescence 1 Monoclonal FLU A 2 3 4 Monoclonal FLU B Monoclonal VRS Ac polyvalents Adeno, flua, FluB, Parainfluenza I, II,III + Ac monoclonaux
Diagnostic virologique classique des souches virales Prélèvement= ANP Si période hors épidémie de VRS et Grippe= Tests d Immunoflurescence 1 2 VRS Ac polyvalents Adeno, flua, FluB, Parainfluenza I, II,III hmpv + Ac monoclonaux
CONCLUSIONS Virus respiratoires : Rôle dans la bronchiolite Exacerbation de l asthme infantile Infections graves chez les greffés de poumons Infections communautaires en réanimation Infections nosocomiales Virus nouvellement découverts: BOCAVIRUS, SAFFOLD, hmpv rôle agent étiologique ou de cofacteur à démonter!! Virus émergents : Recombinaison virus animal et humain: coronavirus, influenza Risque pandémique!! Virus respiratoires : diagnostic classique; culture cellulaire, EIA, IF Virus respiratoires : Diagnostic Moléculaire RT-PCR multiplex, Avenir puces ADN: combinaison: bactéries+virus
Remerciements Unité de Virologie Médicale et Moléculaire CHU de REIMS, EA/IFR53 Laurent Andréoletti Nicolas Lévêque Véronique Brodard Jérôme Jacques Fanny RENOIS Service de Pneumologie François Lebargy Gaetan deslée Jeanne Marie Perotin Service de Pédiatrie A Jacques Motte Michel Abely Kathia Bessaci Delphine Minette