abc Ann Biol Clin 2008 ; 66 (4) : 459-63 Interférence de l hémoglobine glyquée labile sur le dosage de l HbA 1c par une méthode de chromatographie liquide haute performance Interference of labile glycated hemoglobin on HbA 1c assay by a high pressure liquid chromatography method J. Szymezak N. Leroy E. Lavalard P. illery Laboratoire de biochimie et de recherche pédiatriques, American Memorial Hospital, CHU de Reims <pgillery@chu-reims.fr> Article reçu le 11 janvier 2008, accepté le 6 mai 2008 Résumé. Le dosage de l HbA 1c par technique de chromatographie liquide haute performance reste soumis à des interférences, dont celle de la fraction labile de l HbA 1c, rencontrée dans 1à2%desprélèvements. Nous avons évalué l interférence de l HbA 1c labile sur le dosage de l HbA 1c avec l analyseur Variant II (BioRad) en formant in vitro de l hémoglobine glyquée labile et en testant deux protocoles d élimination de l HbA 1c labile (lavage et incubation des globules rouges dans une solution saline, ou incubation dans la solution de lavage et de dilution de l analyseur). Des taux élevés d HbA 1c labile supérieurs à 4,5 % conduisent à une sous-estimation de la valeur réelle de l HbA 1c. Les différents protocoles testés sont efficaces et applicables en routine. La méthode la plus rapide consiste en l incubation des globules rouges dans la solution de lavage et de dilution de l automate pendant une durée minimale de deux heures, cette durée pouvant être augmentée en cas de taux très élevé de fraction labile. Mots clés : HbA 1c, HbA 1c labile, chromatographie liquide haute performance, interférence Abstract. HbA 1c assay by high pressure liquid chromatography remains submitted to interferences, among which that of labile HbA 1c in1to2%of samples. We have evaluated the interference of labile HbA 1c on HbA 1c assay using Variant II analyzer (Biorad), by in vitro formation of labile glycated haemoglobin and by evaluation of two protocols of elimination of labile HbA 1c (wash and incubation of red blood cells in saline solution, or incubation in the wash/dilution solution of the analyzer). Levels of labile HbA 1c higher than 4.5 % lead to underestimation of HbA 1c. he different protocols tested proved efficient and were adapted to routine conditions. he fastest method is the incubation of red blood cells in the wash/dilution solution for at least two hours, or more if labile fraction is unusually high. Key words: HbA 1c, labile HbA 1c, high pressure liquid chromatography, interference doi: 10.1684/abc.2008.0251 La spécificité des méthodes de dosage de l HbA 1c utilisant la chromatographie d échange ionique n est pas absolue, même si la mise en œuvre de la chromatographie liquide haute performance (CLHP) améliore significativement les performances analytiques des systèmes employés. Cependant, le pic identifié comme HbA 1c en CLHP peut encore comporter différents composés contaminants, comme l HbA 1c labile, l hémoglobine carbamylée, ou encore des variants d hémoglobine [1]. L HbA 1c labile, ou Hb pré-a 1c, est une forme réversible intermédiaire dans la formation de l HbA 1c. Elle augmente rapidement après une hyperglycémie, mais son taux n est pas corrélé à l équilibre glycémique des semaines Ann Biol Clin, vol. 66, n 4, juillet-août 2008 459
précédentes, à la différence de celui de l HbA 1c. L exclusion de l HbA 1c labile du calcul lors de l évaluation de l HbA 1c constitue donc un préalable indispensable à la mise en œuvre de toute technique de dosage. Dans la plupart des cas, le taux d HbA 1c labile n est pas suffisant pour influer sur le calcul de l aire du pic d HbA 1c. Cependant, chez certains patients, notamment en cas de découverte ou de déséquilibre récent du diabète, des taux d HbA 1c labile élevés peuvent être observés, et interférer potentiellement avec la mesure d HbA 1c. Nous avons testé l influence de taux élevés d HbA 1c labile sur l analyseur Variant II, automate de CLHP d échange ionique. De précédentes évaluations, auxquelles les données du fabricant sont conformes, avaient montré que le résultat d HbA 1c était fiable pour des valeurs HbA 1c labile inférieures à 4,8 % [2, 3]. Cependant, des valeurs supérieures sont régulièrement rencontrées au laboratoire. Dans cette étude, nous avons donc étudié les conditions d élimination de cette interférence en réalisant in vitro des échantillons d hémoglobine glyquée labile, et avons testé deux protocoles d élimination de celle-ci afin de valider leur utilisation en pratique de routine. Matériel et méthodes Appareillage et prélèvements Les dosages d HbA 1c ont été réalisés à l aide d un automate CLHP Variant II équipé du kit HPLC réf 270-2101 et du logiciel Clinical Data Management System version 3.5 (BioRad Diagnostics, Marnes-la-Coquette) selon les recommandations du fabricant. Les tests ont été effectués à partir d échantillons de routine parvenus au laboratoire pour un dosage d HbA 1c, prélevés en tubes contenant de l EDA (Vacutainer EDA K3 réf 367657, Becton-Dickinson, Le Pont-De-Claix). Aucun prélèvement supplémentaire n a été nécessaire et aucun prélèvement n a été conservé pour cette étude. lycation de l hémoglobine in vitro La glycation de l hémoglobine in vitro a été réalisée dans les conditions suivantes : 0,8 ml de sang total ont été mélangés à 0,2 ml d une solution de glucose 2,5 M dans du NaCl 0,15 M (concentration finale de glucose : 0,5 M) et incubés dans un bain-marie à 37 C pendant 30 minutes. Une série témoin a été réalisée par incubation dans les mêmes conditions avec NaCl 0,15 M. Le dosage de l HbA 1c a été effectué sur le tube primaire, sur le tube incubé avec la solution de glucose et sur le tube témoin d incubation. Procédures d élimination de l HbA 1c labile Deux procédures d élimination de l HbA 1c labile ont été testées : trois lavages successifs des globules rouges suivis d une incubation de 4 heures à 37 C dans une solution de NaCl 0,15 M [4] ; une incubation dans la solution de lavage et de dilution de l automate (solution Wash réf 270.2112) pendant 2, 3 et 4 heures à température ambiante (20 C) [5]. Les échantillons ont ensuite été dosés dans les conditions habituelles. Résultats Dans un premier temps, l interférence d un taux élevé d HbA 1c labile sur le dosage d HbA 1c a été étudiée. Cinq échantillons, dont le taux d HbA 1c initial était compris entre 5,2 et 16,5 %, ont été soumis à la procédure de glycation de l hémoglobine in vitro. Les résultats sont exposés dans le tableau 1. Les incubations des séries témoins montrent la stabilité du taux d HbA 1c au cours de la manipulation. Dans les séries incubées avec le glucose, on observe une très forte augmentation du taux de l HbA 1c labile (valeur finale de 7,5 à 10,7 %, soit une augmentation d un facteur 4 à 5). L aspect des chromatogrammes montre qu en ce cas la séparation entre HbA 1c labile et HbA 1c est insuffisante, avec pour conséquence une évaluation incorrecte du taux d HbA 1c. rois exemples sont présentés sur la figure 1. Dans ces conditions d incubation, on ne note ni formation ni dégradation d HbA 1c, ce qui indique que la différence de résultat d HbA 1c est entièrement due à l interférence de ableau 1. Effetdelaformationin vitro d hémoglobine glyquée labile sur le dosage d HbA 1c. HbA 1c (%) Avant traitement Après incubation (témoin) Après incubation avec glucose 2,5 M % HbA 1c % LA1c % HbA 1c % LA1c % HbA 1c % LA1c 5,2 1,5 5,2 1,4 4,4 7,7 5,3 1,7 5,4 1,5 4,5 7,5 7,5 2,2 7,6 2,0 6,5 9,6 5,8 1,7 5,8 1,5 4,9 7,8 16,5 3,1 16,8 2,4 14,5 10,7 LA 1c = HbA 1c labile. 460 Ann Biol Clin, vol. 66, n 4, juillet-août 2008
Hémoglobine glyquée labile l hémoglobine glyquée labile sur l intégration de l aire du pic d HbA 1c. L effet des deux protocoles d élimination de l HbA 1c labile sur le résultat d HbA 1c a ensuite été étudié sur quatre échantillons contenant un taux initial d HbA 1c labile supérieur à 4,6 %. L examen des chromatogrammes montre une fraction labile élevée dans les conditions basales, avec une séparation incomplète des pics d HbA 1c labile et d HbA 1c.Le traitement de l échantillon par lavage et incubation prolongée des globules rouges dans NaCl 0,15 M permet une élimination totale de la fraction labile, qui n est plus détectée en tant que telle en raison de son faible taux (figure 2B). A B C 2 HbA 1c = 5,3 % 2 HbA 1c = 7,5 % HbA 1c = 16,5 % 2 2 Les protocoles d incubation dans la solution Wash pendant des périodes différentes conduisent à une diminution régulière des valeurs d HbA 1c labile avec le temps d incubation : dans le cas présenté sur la figure 2, la fraction d HbA 1c labile passe de 6,1 % à 4,3 % après deux heures, 3,7 % après trois heures et 3,1 % après quatre heures. Dès deux heures d incubation dans la solution de lavage, il est donc possible de valider la valeur rendue par l automate. On note que les valeurs d HbA 1c sont identiques dans les trois cas, supérieures à la valeur initiale trouvée, mais inférieures à la valeur obtenue après élimination totale. Les expériences réalisées avec d autres échantillons ont donné des résultats similaires, présentés dans le tableau 2. HbA 1c = 5,4 % HbA 1c = 4,5 % 2 2 HbA 1c = 7,6 % HbA 1c = 6,5 % 2 HbA 1c = 16,8 % HbA 1c = 14,5 % 2 2 Figure 1. Effetdelaformationin vitro d hémoglobine glyquée labile sur la séparation chromatographique d HbA 1c. rois échantillons contenant un taux d HbA 1c de 5,3 % (A), 7,5 % (B) et 16,5 % (C) ont été analysés par CLHP sans traitement (), après incubation 30 minutes dans NaCl 0,15 M (), et après incubation 30 minutes dans du glucose 0,5 M (). Le pic d HbA 1c est présenté sous forme grisée. Ann Biol Clin, vol. 66, n 4, juillet-août 2008 461
ableau 2. Elimination de l hémoglobine glyquée labile. Valeur initiale raitement par incubation dans NaCl 0,15 M raitement par incubation dans la solution Wash 2 heures 3 heures 4 heures HbA 1c LA 1c HbA 1c LA 1c HbA 1c LA 1c HbA 1c LA 1c HbA 1c LA 1c 10,6 6,1 11,7 ND 11 4,3 11,1 3,7 11,2 3,1 9,5 5,2 10,1 ND 9,6 3,5 9,7 3,2 9,8 2,9 11,8 6,8 13,6 ND 12,3 5,1 12,4 4,9 12,5 4,4 8,8 4,6 9,6 ND 9,2 2,6 9,1 2,4 9,0 2,2 ND = non détectable ; LA 1c = HbA 1c labile. Les échantillons ont été traités comme indiqué dans le paragraphe Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l hémoglobine totale. Discussion La formation d HbA 1c labile, ou Hb pré-a 1c, est liée au contact de l hémoglobine des globules rouges avec des concentrations élevées de glucose. Sa présence témoignant le plus souvent d un déséquilibre glycémique récent, cette fraction ne doit pas être prise en compte dans la détermination du taux d HbA 1c. Cependant, bien que les procédures opératoires garantissent le plus souvent l absence d interférence [6-8], les taux d HbA 1c labile peuvent, dans certains cas, atteindre des valeurs très élevées. Nous avons étudié cette influence sur la technique de CLHP Variant II, automate pour lequel des taux d HbA 1c labile supérieurs à 4,8 % provoquent une interférence A 2 HbA 1c = 10,6 % B négative sur le résultat d HbA 1c, et n autorisent pas la validation technique [2, 3]. Nous l avons confirmé par des expériences de glycation artificielle. Dans notre expérience au laboratoire, un taux plus élevé d HbA 1c labile est observé chez environ 1 à 2 % des patients. La question de son élimination se pose alors [4, 5], aucun protocole d élimination de l hémoglobine glyquée labile n étant préconisé dans la notice du fabricant. Dans la littérature, différents protocoles d élimination ont été évalués, mais peu d études concernent cet automate [2]. Le protocole d utilisation de l appareil Variant de première génération indiquait la nécessité d une incubation dans la solution de lavage et de dilution de l automate, soit l équivalent de la solution Wash du Variant II [5]. Un autre 2 HbA 1c = 11,7 % C HbA 1c = 11,0 % D HbA 1c = 11,1 % E HbA 1c = 11,2 % 2 2 2 Figure 2. Effet de deux protocoles d élimination de l HbA 1c labile sur le dosage d HbA 1c par CLHP. Un échantillon de concentration initiale d HbA 1c de 10,6 % et d HbA 1c labile de 6,1 % a été dosé avant (A) et après élimination de l hémoglobine glyquée labile par lavage et incubation des globules dans NaCl 0,15 M (B) ou dans la solution de dilution et lavage (Wash) pendant 2 heures (C), 3 heures (D) et 4 heures (E). 462 Ann Biol Clin, vol. 66, n 4, juillet-août 2008
Hémoglobine glyquée labile protocole consiste en un lavage et une incubation des globules rouges dans NaCl 0,15 M [4]. La première méthode (incubation dans la solution Wash) permet une élimination progressive de l HbA 1c labile, mais se révèle d efficacité variable selon les échantillons. Dans tous les cas, une durée minimale de deux heures à température ambiante est nécessaire pour permettre une validation technique du résultat d HbA 1c : en effet, des protocoles d élimination moins contraignants (par exemple 30 minutes à 4 C ou à température ambiante) se révèlent totalement inefficaces (résultats non montrés). La seconde méthode (incubation dans NaCl 0,15 M), telle que décrite ici, élimine presque totalement l HbA 1c labile. Cependant, le logiciel de l automate ne parvient plus à détecter le pic résiduel élué à ce niveau, et intègre cette fraction dans le pic d HbA 1c. Cette procédure très efficace paraît donc conduire à une surestimation du résultat final. En effet, une élimination partielle de l Hb pré-a 1c, par incubation dans la solution Wash, donne des valeurs plus basses et cohérentes entre elles. Soulignons par ailleurs qu une incubation quatre heures à 37 C ne provoque pas de formation d HbA 1c (résultats non montrés). En conséquence, nos résultats confirment l interférence de taux élevés d HbA 1c labile sur le dosage de l HbA 1c par cette méthode de chromatographie liquide haute performance. La valeur seuil préalablement rapportée de 4,8 % doit être prise en considération avec prudence, nos expériences montrant une interférence mineure, mais réelle, sur un prélèvement contenant 4,6 % d HbA 1c labile. De ce fait, les échantillons de patients présentant un taux d HbA 1c labile supérieur à 4,5 % doivent donc subir un traitement d élimination afin de corriger l interférence. Le protocole de lavage et d incubation des globules rouges dans NaCl 0,15 M, applicable par ailleurs à toute méthode de dosage d HbA 1c, est efficace, mais il nécessite un traitement long de l échantillon, reporte le rendu du résultat, et peut conduire à une surestimation de la valeur d HbA 1c. Une alternative, spécifique à la méthode CLHP utilisée ici, consiste à incuber l échantillon dans la solution de lavage et de dilution de l automate pendant deux à quatre heures. Le protocole le mieux adapté en routine consiste en une incubation de deux heures. Si le taux d HbA 1c labile reste trop important pour permettre la validation du dosage (en pratique supérieur à 4,5 %), le temps d incubation peut être prolongé d une ou deux heures dans les mêmes conditions avant de renouveler le dosage. La problématique générale concerne toute méthode de dosage de l HbA 1c. En effet, chaque fois qu une interférence de ce type peut affecter une méthode donnée, celle-ci doit faire l objet d un protocole précis sur la conduite à tenir, notamment dans certaines situations cliniques comme la découverte d un diabète ou des taux récemment modifiés d HbA 1c. Remerciements. Les auteurs remercient Mme Elisabeth Deschamps pour la dactylographie du manuscrit, et Mme Marie-Alix Cresseaux pour sa participation à la conception et à la réalisation de l étude. Références 1. illery P, Delpech M, arcia I, Vague P, Dézier JF, Périer C. Evaluation des méthodes de dosage de l hémoglobine glyquée : méthode et paramètre de référence. Ann Biol Clin (Paris) 1995 ; 53 : 395-8. 2. Higgins N, Blakney B, Dayton J. Analytical evaluation of the Bio- Rad variant II automated HbA 1c analyzer. Clin Biochem 2001 ; 34 : 361-5. 3. Maquart F, Leroy N, Volondat A, illery P. Evaluation de l analyseur Variant II de Bio-Rad pour le dosage de l hémoglobine A 1c. Ann Biol Clin (Paris) 2000 ; 58 : 199-203. 4. Wyble S, French CA, Mayer K. Removal of labile glycosylated hemoglobin to correct for fluctuations in hemoglobin A 1 measurement by column chromatography. Clin Chem 1982 ; 28 : 1993-4. 5. Ellis, Chang L, Cogionis B, Daneman D. Incomplete removal of labile fraction when measuring hemoglobin A 1c with Bio-Rad Variant analyzer. Clin Chem 1997 ; 43 : 2437-9. 6. Camargo JL, Felisberto M, ross JL. Effect of pre-analytical variables on glycohemoglobin measurements in routine clinical care. Clin Biochem 2004 ; 37 : 836-9. 7. Nathan DM, Dunn BS, Francis B. wo commercial methods evaluated for eliminating the labile fraction from the assay for glycated hemoglobin (glycohemoglobin). Clin Chem 1984 ; 30 : 109-10. 8. erreni A, Paleari R, Caldini A, Ognibene A, Mosca A, Messeri. Evaluation of the analytic performances of the new HPLC system HLC- 723 7 for the measurement of hemoglobin A1c. Clin Biochem 2003 ; 36 : 607-10. Ann Biol Clin, vol. 66, n 4, juillet-août 2008 463