Les Récepteurs Olfactifs des Insectes: intérêt des approches génomiques Dr Emmanuelle Jacquin-Joly et Arthur de Fouchier INRA Versailles, Institut d Ecologie te des Sciences de l Environnement de Paris I. INTRODUCTION II. RECEPTEURS OLFACTIFS: découverte et caractéristiques III. RECEPTEURS OLFACTIFS et transmission du signal IV. RECEPTEURS OLFACTIFS: aspects fonctionnels V. CONCLUSION I. INTRODUCTION Généralités Présentation et organisation du système olfactif, comparaison vertébrés/invertébrés Importance de l olfaction chez les insectes: un grand nombre de comportements sont régis par l olfaction reconnaissance intra et interspécifique Reconnaissance de l hôte Connaître les bases moléculaires de la reconnaissance olfactive chez les insectes Aspects fondamentaux dégager des principes fondamentaux comprendre la spécificité du système la dynamique Communication sexuelle Communication sociale Aspects appliqués: trouver des cibles potentielles pour perturber les comportements liés à l olfaction chez les insectes néfastes (ravageurs, vecteurs de maladie )
Dans un contexte de lutte contre les insectes: Organisation du système olfactif Différents pièges olfactifs Mieux comprendre les mécanismes de l olfaction et de sa modulation permet de modifier les comportements olfactifs et contribuer au développement de méthodes de lutte alternatives aux insecticides pour le respect de l environnement et de la santé 1. système périphérique: l antenne 2. système central: les lobes antennaires et les corps pédonculés 1. Système périphérique: l antenne support de l olfaction chez les insectes Diversité des éléments moléculaires impliqués dans la reconnaissance périphérique du signal - Transport binding-proteins (OBPs) - Réception recepteurs olfactifs (OR) - Transduction éléments de la transduction (canaux ionique - Terminaison enzymes de dégradation (ODEs) odorantbinding protein OBP CSP odorantdegrading enzyme neuron La sensille trichoïde olfactive:une unité morpho-fonctionnelle Acc cells (from Kaissling 2004 ANIR) ionotropic receptor IR odorant receptor OR Co receptor ORco Transformation d un signal chimique en signal électrique
Molecular mechanisms of olfaction 2. Système olfactif central: lobes antennaires et corps pédonculés Video Bayer.com Cerveau d abeille Intégration du signal Organisation du système olfactif similarité modèles vertébrés/invertébrés 1. Neurones olfactifs 3. Corps pédonculés 2eme relais synaptique Support des organes sensoriels cavité nasale antenne Organes sensoriels muqueuse olfactive sensille 200 µm 1er relais synaptique bulbe olfactif lobes antennaires 200 µm 2eme relais synaptique cortex olfactif corps pédonculés 2. Lobes antennaires 1er relais synaptique Organisation similaire, système compartimenté chez les insectes nécessité de traverser un milieu aqueux jusqu au dendrite du neurone molécules odorantes généralement hydrophobes transport?
II. LES RECEPTEURS OLFACTIFS découverte caractéristiques moléculaires Découverte des RO RO découverts chez le rat en 1991 (Buck & Axel: prix Nobel de médecine 2004) Hypothèses: GPCR exprimés uniquement dans les tissus olfactifs Amplification de gènes candidats par utilisation d amorces dégénérées supposées s hybrider aux domaines transmembranaires + analyse des patrons d expression: ~1000 gènes puis découverte chez les autres vertébrés (poissons: 1993; homme: 1994; oiseaux: 1996), en 1995 chez l invertébré C. elegans (800) GPCR, 7 domaines transmembranaires, assez conservés entre vertébrés NH 2 TM(1-7) E1 E2 E3 I1 COOH I2 I3 binding region extracellular membrane intracellular E2 TM3 TM4 TM2 E3 TM5 TM6 I3 TM2 TM7 E1 TM1 COOH NH 2 Les RO d insectes -découverte de RO potentiels chez la drosophile en 1999 grâce à l utilisation des données du génome (échec des autres stratégies): -clonage in silico (algorithme multivariable) - + tissu-spécificité (expression exclusive dans les organes chimiosensoriels): ~ 60 candidats Benton et al 2006 Séquences drosophiles extrêmement divergentes de celles de vertébrés, Seule l analyse du génome a permis de les identifier
Les récepteurs olfactifs de la drosophile Les neurones exprimant un RO donné convergent vers le même glomérule (ici: PrRO-GFP) arista 3e segment antennaire Hybridation in situ sur coupes d antennes Il existe une carte d expression antennaire pas de coexpression de RO: un neurone olfactif exprime un type de RO Caractéristiques de RO de drosophile ~60 RO divergence de séquence avec les RO de vertébrés ou de C. elegans peu d homologie entre eux constituent une nouvelle famille de GPCR le profil d expression spatial est stéréotypé (identique d un individu à l autre: différent de la distribution aléatoire des vertébrés) Points communs avec les RO de vertébrés: - pas de coexpression de RO: un neurone olfactif exprime un type de RO (différent de C. elegans) - Les neurones exprimant le même type de RO convergent vers le même glomérule du lobe antennaire D après Benton, 2006, CMLS Similarité entre les circuits olfactifs de mammifères et d insectes: Un neurone exprime généralement un seul type de récepteur olfactif (rouge, bleu, vert) Les axones des neurones exprimant le même type de récepteur convergent vers un glomérule unique du cerveaux
DOR Mais des différences insectes/vertébrés: Topologie inversée des RO d insectes? Démontré chez la drosophile pour quelques RO Chez les insectes: un récepteur atypique serait nécessaire à la fonctionnalité des autres récepteurs Très conservé entre les espèces Pas d orthologue ches les rongeurs Exprimé dans le quasi-totalité des neurones olfactifs, donc coexpression avec un RO Interviendrait dans l adressage membranaire du RO et dans sa fonctionnalité pas hétérodimérisation GPCR Benton et al 2006 HIS insecte Quel mécanisme de transduction du signal chez les insectes?? III. RECEPTEUR & TRANSDUCTION odeur Débat actuel sur le fonctionnement des RO de drosophile et la voie de transduction associée Voie métabotrope: Interaction avec une protéine G et cascade de transduction Voie ionotrope: Le dimère 83b/RO formerait un canal ionique Ca2+ OBP Insectes: la voie IP3 PIP2 PLC IP3 récepteur olfactif Gs AC canal ionique Vertébrés: la voie de l AMPc Gq AMPc récepteur olfactif AMP Ou les deux?
Et chez les autres insectes? - Avec le développement du séquençage des génomes complexes d insectes modèles: - découverte chez l anophèle A. gambiae (79 candidats), vecteur de la malaria (2001) et - le ver à soie Bombyx mori (2004). - l abeille (2006) - d autres moustiques - Le ténébrion Tribolium - Contrairement aux RO de mammifères: Une extrême divergence entre espèce (20% d identité), même du même ordre, et au sein d une même espèce Les RO des insectes: des cibles potentielles pour perturber l olfaction? une nouvelle famille de récepteurs à 7 TM Un fonctionnement atypique? Origine évolutive? De nouvelles cibles pour «bloquer» l olfaction? - divergence vertébrés/inesctes, divergence entre les espèces d insectes (une approche espèce-spécifique - structure RCPG-like bénéficiant du savoir faire pharmacologique sur ce type de récepteurs Mais difficile à identifier chez des espèces non-modèles pour lesquelles il n y a pas de génome séquencé (comme les ravageurs des cultures!) 83b OR Une stratégie alternative développée au laboratoire: approche transcriptomique par l élaboration d une banque d EST d antennes du papillon Spodoptera littoralis, pour la découverte des gènes exprimés dans l antenne, parmi eux ceux impliqués dans l olfaction La noctuelle du coton, Spodoptera littoralis: Modèle agronomique aux enjeux économiques: Polyphage Résistance aux insecticides Culture du coton: 24% des pesticides vendus dans le monde Culture la plus polluante de la planète Qu est ce qu une banque d EST? une collection d étiquettes de gènes exprimés dans un tissu donné: elle résulte du séquençage aléatoire d une banque d ADNc fabriquée à partir d un tissu particulier à un temps donné, Elle reflète donc les gènes exprimés dans ce tissu à ce temps donné. Seule une partie de chaque ADNc est séquencée: cette séquence (200 500 nucléotides) est appelée étiquette ou Tag qui peut être utilisée pour identifier le gène par comparaison à des banques de gènes internationales.
Construction de la banque 1. purification des ARN 1. collection of 2g of S. littotalis antennae (12 000 antennae!!!) 2. RNA extraction (TriZol): 2 mg obtained antennal RNA ladder Construction de la banque 2. synthèse des ADNc, transformation des bactéries Complementary DNA synthesis Library construction of DNA transcripts: a representation of the genes expressed in the olfactory organ mrna Full lenght cdna reverse transcription cdna insert 5 3 directional plasmid cloning 3. RNA quality and integrity controlled by agarose electrophoresis rrna Average insert size: 2.1 kb bacteria transformation DH10B T1 Séquençage aléatoire Sanger + séquençage haut-débit 1. Library plating larvae 2. Clones picking to 96 well plates Legeai et al 2011 BMC Genomics Sanger Jacquin-Joly et al 2012 IJBS Poivet et al 2013 PloS One 454 3. Random sequencing Illumina Trinity, MIRA Contigs
Analyses des séquences (bioinformatique) 1. Raw data cleaning (removing of plasmid sequence) 2. BLAST analyses (Basic Local Alignment Search Tool): comparison of each contigs with Databases (Genbank, Swiss- Prot, TrEMBL) through Blast analyses Contig: ATTGCATTGCCCGAATGCAGT 17 50 odorant binding protein OBP CSP 47 72 odorant degrading enzyme 25 2 Blastn: Nucleotide query vs nucleotide sequences Informations on similar known genes Blastx: translated query vs protein database Co receptor IR8a/25a Legeai et al 2011, BMC G Jacquin-Joly et al 2012, IJBS Poivet et al 2013, PloS One ionotropic receptor IR odorant receptor OR B. mori Co receptor ORco Ion channel SNMP 66 ORs Tanaka et al 2007 18 IRs Croset et al 2010 44 OBPs Gong et al 2009 Lepidopteran ORs SlitORs Pheromone receptors 50µm in situ hybridization experiments (SlitOR13) 3µm 3µm 3µm V D antennal segment olfactory sensilla trichodea mechanosensory sensilla chaetica hygro/ thermosensory sensilla styloconica ORco gene expression at the bases of small subsets of sensilla specifically involved in olfaction
une sous famille très conservée: OR18 Orthologues de RO18 H. armigera O. nubilalis S. littoralis B. mori S. nonagrioides M. brassicae H. zea Brigaud et al 2009, FEBS j, 2009 H. virescens OR18 5 orthologues clonés chez des noctuelles Très conservés Pas d orthologues dans les génomes d insectes Disponibles Un sous-type «noctuelle»: Une cible spécifique? Oui mais après? Quel rôle biologique pour ces récepteurs? Ou: quel comportement cibler? Brigaud et al 2009, FEBS j, 2009
III. Etude fonctionnelle des récepteurs olfactifs: Sans démonstration fonctionnelle, les RO ne sont que potentiels Méthodologie: In vitro en système hétérologue In In vitro: vivo: Arthur systèmes analyse Ovocytes de xénopes électrophysiologie Lignées cellulaires (Sf9, HEK ) imagerie calcique In vivo surexpression ou expression ciblée chez l espèce Expression chez d autres espèces (Drosophile, Coenorhabditis) Invalidation (silencing par interference ARN) électrophysiologie et comportement Établissement d une carte «du récepteur au neurone» par comparaison des spectres de réponse des récepteurs à ceux des neurones olfactifs - 1 RO peut reconnaître plusieurs odorants - 1 même odorant peut être reconnu par plusieurs RO V. conclusion Même logique olfactive chez les insectes et les rongeurs 1 RO-1 neurone-1 gomérule Cependant: -RO divergents -topologie différente -Mécanisme de transduction? Similaire aux propriétés des récepteurs olfactifs du rat
Conclusion Les bases moléculaires de l olfaction chez les animaux: Beaucoup de similitudes, qui résulteraient d une convergence des mécanismes et des acteurs moléculaires plutôt que d une origine commune Cependant: les gènes olfactifs ne sont connus que chez un petit nombre d espèces, essentiellement mammifères, nématodes, insectes Qu en est il chez les autres invertébrés, terrestres, marins? Leur découverte permettra de mieux comprendre leur origines évolutives Applications de l études des récepteurs olfactifs Médecines (troubles olfactifs, anosmie, régulation de la prise alimentaire) Productions animales (élevage: gestion du stress, gestion des inséminations ) Productions agricoles de nouvelles cibles pour la mise au point de nouvelles méthodes de lutte contre les insectes respectueuses de l environnement Gestion des insectes vecteurs de maladies (paludisme, fièvre jaune ) Nanotechnologies: Nez artificiels (diagnostic, détection de substances dangereuses, qualité des aliments, qualité de l eau, environnement, criminologie scientifique )