BIOCHIMIE SEMESTRE 2 : TECHNIQUES DE BIOCHIMIE 1
Deux grand objectifs : Maîtriser les principales techniques d étude et de purification d organites cellulaires et de protéines (cours). Analyser et acquérir une démarche scientifique à travers l analyse d articles scientifiques (TD). Vous donner des outils pour la réalisation de votre stage Vous donner des outils pour la troisième année et le cycle expertise (mode projet)
Programme Préparation d échantillons Préparation d échantillon cellulaire focalisation sur le fractionnement cellulaire Préparation d échantillon protéique présentation des traitements courants d échantillons protéiques purification de protéines abordée dans la partie chromatographie Electrophorèses Electrophorèse monodimensionnelle SDS-PAGE Western blotting Isoelectrofocalisation / électrophorèse en 2D Chromatographies 3
Préparation d échantillons : introduction Préparation d échantillons cellulaires pour : - isoler un organite pour étudier sa composition, sa fonction, un transport, une localisation protéique, une spécificité lipidique.. Fractionnement subcellulaire - préparer un extrait cellulaire homogène 4 Préparation d échantillon protéique pour : - isoler et purifier une protéine d un mélange initial pour étudier sa structure, sa fonction, sa concentration, son activité.. Ou pour la préparer Chromatographie Utilisation de la dialyse, lyophilisation, filtration, précipitation
1. Fractionnement subcellulaire Préparation des échantillons à partir : - Cellules en culture 5 - Tissus isolés (foie, rein, cerveau..)
2. Homogénéisation : le matériel biologique (membrane plasmique) est brisé pour en libérer les structures ou substances désirées. Divers dispositifs d homogénéisation : Autres techniques : - Seringue -French press - Ball bearing cell cracker Dounce Potter-eveljhem Ultra Turrax 6 Microtube homogenizer
Organismes possédant une paroi Lysat http://www.zoology.ubc.ca/~berger/b200sample/unit_8_protein_processing/images_unit8/p5_4_1.jpg
Homogénat cellulaire Conditions à respecter pour l homogénéisation Température : 4 C maintenir les propriétés et structures des molécules limiter les activités enzymatiques Tampon d homogénéisation : doit permettre de maintenir la stabilité des organites et molécules que l on veut étudier Tonicité, il doit être isotonique (environ 150 mm NaCl) Note : l hypotonicité est fréquemment utilisée pour faciliter l homogénéisation (levures) ph physiologique : 7,4 Présence d anti-protéases
3. L homogénat est soumis à une série de centrifugation 9
Centrifugation différentielle Les différents composants sédimentent à une vitesse donnée en fonction de leur taille et densité, dans le tampon d homogénéisation. Plusieurs étapes successives sont réalisées, le surnageant est à chaque fois centrifugé plus vite plus longtemps. 10
Centrifugation sur gradient de densité Centrifugation zonale La densité maximale du gradient est inférieure à la densité maximale des composants séparation basée sur la vitesse de sédimentation Centrifugation isopycnique (à l équilibre) La densité maximale à la base du gradient est supérieure à la densité maximale des composants séparation basée sur la densité 11 Gradient discontinu (discontinous or step gradient) : obtenu en superposant des couches de solution de densité différente
Gradient continu (continous gradient) : obtenu en créant un gradient linéaire de densité croissante Molécules les plus utilisées pour réaliser les gradients : Sucrose = saccharose CsCl : chlorure de Cesium (acides nucléiques) Percoll : gel de silice utilisé pour les gradients continus Nycodenz, optiprep
Préparation d échantillon protéique Traitements courants d échantillons protéiques : filtration, lyophilisation, dialyse et précipitation Préambule à la chromatographie Filtration Très fréquemment utilisée en biochimie : -Stérilisation -Elimination ou Isolement de précipité - concentration de solutés - élimination de sels Voir ultrafiltration 13 Système de filtration
Ultrafiltration/microconcentration Objectifs : -Concentrer des solutions de macromolécules - éliminer des constituants de faible poids moléculaire diamètre des pores très petits : 0,001 à 0,1 µm 14
Dialyse Objectif : - éliminer des petites molécules - échanger le tampon de solubilisation Diffusion à travers une membrane perméable ou semi-perméable. Diffusion selon le gradient de concentration: déplacement net des molécules du coté le plus concentré vers le coté le moins concentré. Chaque espèce chimique en solution subit individuellement ce processus. À l'équilibre, les concentrations de chaque espèce diffusible seront égales de part et d'autre. 15
Lyophilisation Objectifs : - Concentration d un échantillon (protéique, glucidique..) - Conservation Déshydratation d un produit préalablement congelé par sublimation 16
Précipitation Objectifs : - Concentration d un échantillon (protéique) - Elimination de sels Principe général : modifier la solubilité des protéines On distingue deux types de précipitation : - Précipitation totale : Acide trichloroacétique, acétone, Ethanol - Précipitation douce/différentielle : sulfate d ammonium
ELECTROPHORESES Principe Electrophorèse monodimensionnelle SDS-PAGE Western-blot Isoélectrofocalisation (IEF) Electrophorèse bidimensionnelle 18
ELECTROPHORESE Séparation de solutés chargés par migration dans un champ électrique - la migration dépend: de la charge de la protéine de sa taille du support (gel plus ou moins réticulé, papier) -dans la focalisation isoélectrique (électrophorèse dans gradient de ph) migration dépend uniquement du pi -dans l électrophorèse SDS-PAGE *, la vitesse de migration dépend - de la taille des sous-unités (protéine dénaturée) - du degré de réticulation du gel * Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Electrophorèse la plus couramment utilisée 19
SDS-PAGE Procédé permettant de séparer des protéines en mélange placées dans un champ électrique Différentes étapes du SDS-PAGE : 1. Préparation du gel d acrylamide 2. Extraction/préparation des échantillons protéiques à séparer (exemple : protéines sériques, lysat cellulaire, homogénat cellulaire, immunoprécipité..) 3. Solubilisation et dénaturation des protéines (rôle essentiel du SDS, du b-mercaptoethanol) 4. Separation des protéines déposées sur le gel placé dans un champ électrique 5. Révélation des protéines par coloration (visualisation) 20
1. Préparation du gel d acrylamide La matrice d une électrophorèse est le support physique sur lequel ou dans lequel l échantillon sera déposé et ses molécules migreront Ici : acrylamide polymérisée en polyacrylamide formant un gel poreux Le montage est ici vertical. La matrice est placée entre deux plaques de verre sous forme liquide puis cette matrice polymérise pour former un gel (Voir diapositive suivante)
1. Préparation du gel d acrylamide Polymérisation du gel d acrylamide sous l'influence d'un initiateur, (généralement le persulfate d ammonium) un des carbones impliqués dans la double liaison de l acrylamide prend une forme radicalaire (radical libre), il peut attaquer la double liaison C-C d'une autre molécule et se lier de façon covalente pour former un gel, un agent réticulant doit être ajouté : c est le rôle du bisacrylamide Du TEMED (N,N,N',N'-tétraméthylènediamine) est presque toujours utilisé comme accélérateur. La proportion acrylamide/réticulant déterminera les capacités de séparation du gel en modifiant la porosité de ce "filet tridimentsionel". plus la proportion de réticulant est grande, plus les mailles seront petites plus il y aura un effet de "tamisage moléculaire" ralentissant les protéines qui auront à passer au travers.
La proportion acrylamide/bisacrylamide ainsi que le % d acrylamide définissent des zones de séparation Possibilité de réaliser des gels en gradient continu : (5-15 % d acrylamide)
1. Préparation du gel d acrylamide Les systèmes triphasiques Les systèmes les plus couramment utilisés sont des systèmes triphasiques : = trois compartiments de ph et de composition ionique différents. = trois parties du montage de l'électrophorèse: tampon de migration (ou électrode), échantillon et gel de tassement et, gel de séparation. Tampon Gel de concentration Gel de séparation
1. Préparation du gel d acrylamide Les systèmes triphasiques caractérisé par une abondance de l'ion de traîne ("trailing ion") généralement la glycine et l'absence d'ion frontal contient les protéines dissoutes + un marqueur de migration (bleu de bromophénol) + un détergent (SDS) + un agent réducteur de liens disulfure (bmercaptoethanol) + du tampon de gel de tassement (ph 6,8) caractérisé par une abondance de l'ion frontal (Cl-) et l'absence d'ion de traîne. Au ph (6,8) du TGT, l'ion de traîne (quand il y entrera) deviendra peu chargé et l'ion frontal est très chargé. L'acrylamide y est très peu concentré de sorte que toutes les protéines migrent ensemble à la même vitesse. (= stacking gel) contient l'ion frontal. Au ph du TGS (8,8), l'ion de traîne et l'ion frontal sont très chargés. ils migrent donc tous deux très vite. L'acrylamide y est plus concentré de sorte que les protéines se séparent puisqu'elles migrent à des vitesses différentes, étant retardées selon leur masse moléculaire
2. Extraction/préparation des échantillons protéiques à séparer (exemple : protéines sériques, lysat cellulaire, homogénat cellulaire, immunoprécipité..) 3. Solubilisation et dénaturation des protéines SDS est un détergent anionique. Rompt les structures secondaires et tertiaires des protéines en les dépliant. Charge négativement les protéines (1 molécule de SDS pour 2 a-a) La forte charge négative apportée par le SDS masque la charge intrinsèque de la protéine b-mercaptoethanol agent réducteur - rompt les ponts disulfures 26
4. Séparation des protéines déposées sur le gel placé dans un champ électrique Après dépôt des échantillons, le champ électrique est appliqué, les protéines chargées négativement migrent vers l anode 27
5. Révélation des protéines par coloration (visualisation) La coloration nécessite la fixation des protéines dans le gel Le gel est placé en milieu acide dilué Le colorant le plus couramment utilisé est le bleu de Coomassie en présence d acide dilué et de méthanol ou éthanol, le bleu de coomassie se fixe sur les protéines et leur donne une coloration bleue la coloration des protéines est visible après plusieurs étapes de décoloration dans le mélange ethanol/acide Exemples de gel dont les protéines ont été révélées au bleu de Coomassie Note : la limite détection est d environ 0,5µg D autres méthodes sont plus sensibles (10ng) comme le nitrate d argent mais délicates
Relation logarithmique entre la masse moléculaire d une protéine et sa mobilité électrophorétique relative en SDS-PAGE 29
Quelles sont les principales utilisation du SDS-PAGE? Déterminer la taille de protéines Evaluer la pureté Déterminer la quantité approximative de protéines Identifier la présence de ponts disulfures Marqueurs de poids moléculaire
Matériel : 31
Note : Il existe un autre type d électrophorèse couramment utilisé : Electrophorèse utilisant comme matrice l agarose sur un montage horizontal L application la plus courante est la séparation et visualisation d acides nucléiques
LE WESTERN BLOT Objectif : identifier une protéine dans un mélange Combinaison entre la séparation par SDS-PAGE et la spécificité de détection par l utilisation d anticorps Ainsi, le WB permet : De vérifier la présence d un antigène De déterminer la quantité d antigène De vérifier ou déterminer le poids moléculaire de cet antigène
Les différentes étapes du WB : 1. Séparation des protéines par SDS-PAGE (Attention pas d étapes de fixation) 2. Transfert des protéines sur une membrane (nitrocellulose ou PVDF) en réalisant un sandwich puis appliquant un champ électrique perpendiculaire au sandwich
3. Blocage des sites non occupés par incubation de la membrane dans une solution contenant des protéines inertes 4. Incubation de la membrande dans un tampon contenant un anticorps primaire spécifique de l antigène recherché 5. Elimination de l excès d anticorps par lavages 6. Incubation avec un anticorps secondaires conjugué à un traceur (le plus souvent enzymatique, éventuellement radiomarqué) 7. Elimination de l excès d anticorps par lavages 8. Révélation du complexe Ag- AcI-AcII formé par ajout des substrats du traceur enzymatique (ou par autoradiographie) 9. Visualisation de l antigène par l apparition d une coloration ou par impression d un film autoradiographique
Comparaison SDS-PAGE / WB La moitié d un culot protéique remis en suspension est déposé sur un gel puis l ensemble des protéines est révélée au bleu de Coomassie L autre moitié est soumis à un WB puis la protéine RBV-His est spéciquement recherchée
Immunodétection Les anticorps sont souvent utilisés pour détecter la présence et/ou mesurer une protéine spécifique Anticorps primaire : dirigé contre la protéine d intérêt, forme un complexe Anticorpsantigène (protéine d intérêt) Pour l immunodétection, les IgG sont majoritairement utilisées avec des préparations polyclonales ou monoclonales purifiées de sérum animaux ou d hybridomes
Anticorps secondaires conjugués : c est un anticorps dirigé contre la partie constante (Fc) des IgG d une espèce donnée chez des animaux d une autre espèce. Exemple : on peut injecter des Fc d IgG de lapin chez une chèvre. La chèvre produira alors un anticorps contre le Fc des IgG de lapin, on parlera d anti-lapin. Cet anticorps pourra se complexer sur n importe quel anticorps de l espèce animal utilisée pour fabriquer l Ac primaire complexe ternaire Ag- Ac primaire Ac secondaire Pour détecter ce complexe ternaire, l Ac secondaire est conjugué : cet anticorps secondaire est lié de façon covalente à une molécule facile à détecter : un traceur
Note : la protéine A ou la protéine G peuvent être utilisées à la place de l Ac secondaire qui se complexe à la région constante des IgG Types de traceurs Enzymes Horseradish peroxydase Phosphatase alcaline Western blot ELISA Radioisotopes 125-I, 14C, 35S, 32P SDS-PAGE, Northen blot. Fluorophores FITC, Rhodamine.. Microscopie à fluorescence
L HRP est le traceur les plus couramment utilisé car il est utilisable dans les méthodes de chimiluminescence (ECL) chimiluminescence La luminescence est le phénomène par lequel certaines molécules portées à un état excité retournent à l'état fondamental en restituant une partie de l'énergie sous forme d'émission de lumière. Lorsque l'énergie qui permet aux molécules d'atteindre l'état excité provient d'une réaction chimique, il s'agit du phénomène de chimiluminescence. 40
ISOELECTROFOCALISATION Si un mélange de protéines est soumis à une électrophorèse dans une matrice ayant un gradient de ph et dont le ph augmente lentement de l anode vers la cathode, chaque protéine va migrer jusqu à l endroit où le ph est égal à son point isoélectrique: + - + - 41
Electrophorèse sur gel en deux dimensions (électrophorèse 2D) 42
Couplage de l électrophorèse bidimensionnelle et de la spectrométrie de masse Etude du protéome 43