L année en gynécologie-obstétrique. 1. Un peu d histoire

L année en gynécologie-obstétrique Une étape supplémentaire a été de quantifier l ensemble de l ADN circulant et d identifier une différence en cas de fœtus aneuploïde, grâce à une méthode de quantification de séquences d ADN (ou Massively Parallel Sequencing, MPS) [12-14]. Cette technique permet de comparer de façon précise deux quantités d ADN, et donc de distinguer une quantité augmentée en cas de fœtus aneuploïde. Chiu et al. ont alors démonréalités en gynécologie-obstétrique # 168_Mars/Avril/Mai 2013 Médecine fœtale : quoi de neuf? M. TASSIN, L. MANDELBROT Service de Gynécologie-Obstétrique Hôpital Louis Mourier, Université Paris-Diderot COLOMBES. La médecine fœtale entre dans une nouvelle ère. Depuis plusieurs années est évoquée l imminence de l utilisation du dépistage non invasif de la trisomie 21 dans le sang maternel. Ce dépistage est d ores et déjà utilisé dans plusieurs pays. Son arrivée en France va révolutionner notre façon d envisager le dépistage de la trisomie 21, nécessitant avant sa mise en place une réflexion aussi bien éthique qu économique et scientifique. Actualités dans le dépistage [ non invasif 1. Un peu d histoire L ADN fœtal circulant dans le plasma maternel a été mis en évidence pour la première fois par Lo et al. [1], en 1997. L expérience initiale reposait sur la mise en évidence du chromosome Y par PCR chez des patientes enceintes de fœtus masculins. Cet ADN fœtal coexiste dans le plasma avec l ADN maternel et représente environ 10 % de l ensemble de l ADN circulant [2, 3]. En raison de l importance de l ADN maternel circulant en comparaison avec l ADN fœtal, les recherches s orientèrent initialement vers la détection de marqueurs absents du génome maternel [4]. Ainsi, le diagnostic non invasif de sexe masculin en cas de risque de maladie génétique liée à l X, ou du rhésus fœtal positif chez les patientes rhésus négatif, est utilisé en pratique courante [5,6]. 2. Techniques de dépistage non invasives du chromosome 21 Contrairement à la mise en évidence de gènes absents chez la mère (SRY, Rh-D), l identification de la trisomie 21 nécessite des techniques plus performantes. D abord, des techniques ont cherché à distinguer l ADN fœtal par des marqueurs spécifiques (ARN dérivé du placenta, signatures épigénétiques, polymorphismes fœtaux spécifiques) [7-9]. L étape suivante a été de cibler spécifiquement un chromosome (en l occurrence le chromosome 21), afin de déterminer s il est en quantité anormale. Une technique développée par l équipe de Tong et al. [9, 10] a pu quantifier la présence du chromosome 21 par l intermédiaire du gène HCLS présent sur ce chromosome. Un ratio spécifique (epigenetic-genetic ratio) est augmenté en cas de trisomie 21 [10]. D autres équipes se sont affranchies du ciblage spécifique de l ADN fœtal, en mesurant la quantité d ADN plasmatique circulant, aussi bien maternel que fœtal. La théorie est qu en cas de fœtus trisomique, la quantité d ADN circulant est plus importante qu en cas de fœtus euploïde. La différence est suffisante pour être mise en évidence, car environ 10 % de l ADN libre dans la circulation maternelle est d origine fœtale. La quantification du chromosome 21 par PCR par l intermédiaire d un locus chromosomique spécifique dans le plasma maternel a été mise au point par Lo et al. [11]. 65

Médecine fœtale tré que les mères de fœtus trisomiques 21 avaient une quantité augmentée de séquences d ADN, en relation avec le chromosome 21 supplémentaire [15]. Dans cette étude, 86 fœtus trisomiques ont été identifiés avec une sensibilité de 100 %, et 2 faux positifs dans une population de 753 patientes à haut risque de trisomie 21. Une autre technique de dépistage non invasif de la trisomie 21 a été développée plus récemment : l analyse de séquences spécifiques de chromosomes ou Digital Analysis of Selected Regions (DANSR). Elle permet de cibler spécifiquement les loci spécifiques des chromosomes 13,18 et 21, et de doser la quantité de ces chromosomes afin d obtenir un ratio corrélé à un score de risque, évitant ainsi d effectuer une analyse de l ensemble de l ADN fœtal circulant. Cette technique est moins coûteuse que la technique MPS du fait de la moindre quantité de génome testé [16]. La validation clinique de ces techniques a d abord été effectuée dans des populations de patientes à haut risque de trisomie 21 [17-19], avec une sensibilité et une spécificité du dépistage supérieures à 99 % (tableau I). Des études plus récentes ont montré que la sensibilité et la spécificité sont du même ordre de grandeur dans des populations non sélectionnées [20] (tableau I). Dans l étude de Nicolaïdes et al. [20], 2 049 patientes non sélectionnées ont été évaluées a posteriori pour le risque de trisomie 21 et de trisomie 18 par amplification sélective d ADN fœtale (DANSR). Cent sérums (4,8 %) ont été exclus de l étude pour échec d analyse (2,6 %) ou fraction fœtale circulante trop faible (2,2 %). Au total, le taux de détections était de 100 % pour la trisomie 21 et 18, avec 0,1 % de faux positifs. L étude de Dan et al. [21] est la plus grande étude à l heure actuelle sur le dépistage non invasif sur sang mater- Etude Population Performances diagnostiques Palomaki et al. Genet Med 2011 Ehrich M et al. AJOG 2011 Chiu RWK et al. BMJ 2011 Bianchi et al. MELISSA Study. Obstetrics and Gynecology 2012 Norton ME et al. NICE Study AJOG 2012 Dan S et al. Prenatal Diagnosis 2012 Nicolaides KH et al. AJOG 2012 nel. Elle s est déroulée dans 49 centres chinois de diagnostic prénatal sur une période de 2 ans, avec l analyse de 11 105 patientes. La sensibilité de dépistage de la trisomie 21 et 18 est 100 %, la spécificité de 99,96 %. La force de ces deux études est de concerner des patientes non sélectionnées, avec des résultats similaires aux études précédentes. 3. Au-delà du dépistage de la trisomie 21 Le dépistage des trisomies 18 et 13 est réalisable à partir de l ADN fœtal sur sang maternel. Pour la trisomie 18, la sensibilité et la spécificité sont sensiblement les mêmes que pour la trisomie 21 [20-24]. En revanche, les résultats sont moins bons pour la trisomie 13, avec des sensibilités de 91,7 % et 78,6 % dans les deux études publiées [22, 23]. Lo et al. ont également démontré la possibilité de mettre en évidence une anomalie monogénique (en l occurrence la bêta-thalassémie) par une technique non invasive quantifiant les haplotypes hérités des 2 parents (technique RHDO) [25]. Dès lors, la possibilité est ouverte à plus ou moins court terme d utiliser une technique 1 696 patientes à haut risque Se = 99,1 % Sp = 99,9 % 480 patientes à haut risque Se = 100 % Sp = 99,7 % 753 patientes à haut risque Se = 100 % Sp = 97,9 % 534 patientes à haut risque Se = 100 % Sp = 100 % 4 002 patientes à haut risque Se = 100 % Sp = 99,9 % 11 805 patientes non sélectionnées 2 049 patientes non sélectionnées Se = 100 % Sp = 99,9 % Se = 100 % Sp = 99,9 % Tableau I : Performances de la détection de la trisomie 21 sur ADN fœtal circulant dans le sang maternel : sélection de la littérature. non invasive pour le diagnostic d une variété de maladies monogéniques. 4. Limites de la technique non invasive Le dépistage à partir de l ADN fœtal circulant, bien que très sensible et spécifique, n est pas un test diagnostique. Il demeure nécessaire de confirmer un résultat positif par un prélèvement invasif (biopsie de trophoblaste ou amniocentèse). En effet, on ne peut pas prendre une décision d interruption médicale de grossesse sur un examen qui comporte quelques faux positifs. Les causes possibles de ces faux positifs sont, d une part d ordre technique, le seuil étant fixé pour privilégier la sensibilité il s agit en fait de cas faiblement positifs et, d autre part, d ordre biologique, telles que des mosaïques confinées au placenta. Plus la population étudiée est à bas risque, plus le risque de faux positifs de un pour mille devient important d un point de vue pratique. Par exemple, dans une population dont le risque de T21 est de 1/1000, un résultat positif signifie que le fœtus a une probabilité aussi grande d être normal que d être trisomique (valeur prédictive positive 50 %). 66

5. Place du dépistage des trisomies par l ADN fœtal circulant Il reste donc à définir la place de ce dépistage. Faut-il le considérer comme un outil de seconde intention après une étape de sélection des patientes par le test combiné du premier trimestre? Ou peut-il remplacer totalement le test combiné? Tout d abord, le dépistage non invasif ne supprime pas l intérêt des échographies, y compris celle du premier trimestre, qui permet de dépister divers anomalies. En cas d anomalie échographique, la discussion d un prélèvement invasif sera toujours nécessaire, même si le test sur l ADN fœtal libre est négatif, en raison du très faible risque de faux négatif. Surtout, l échographie gardera tout son intérêt pour le diagnostic d anomalies non chromosomiques. Concernant le test lui-même, plusieurs limitations sont toujours d actualité. Des limites techniques tout d abord : le délai de réponse (de l ordre de 15 jours) et le taux d échecs (de l ordre de 4 à 5 %) posent des problèmes pratiques. Il est prévisible que certaines patientes se retrouveront sans résultat après 14 SA. Que proposer alors à ces patientes? L échographie du premier trimestre n aura certes pas disparu et la clarté nucale aura pu être mesurée, mais faudra-t-il leur proposer les marqueurs sériques du deuxième trimestre ; par ailleurs, certaines patientes (en cas d obésité notamment) sont exposées à des taux de faux négatifs plus importants du fait de la relative plus faible proportion d ADN fœtal circulant ; enfin, les sous-populations comme les grossesses gémellaires ou les grossesses sur don d ovocytes doivent être plus spécifiquement évaluées. En dehors des limites techniques, le coût est actuellement problématique pour proposer ce test en population. Différents tests sont commercialisés actuellement aux Etats-Unis (Sequenom : MaterniT21plus, Ariosa : Harmony prenatal test) et en Allemagne, en Suisse et en Autriche (Verinata : Prenatest). Les prix varient entre 795 et 2 760 USD. Les Etats-Unis, par l intermédiaire de la Société internationale de diagnostic prénatal (ISPD), ont émis des recommandations sur l utilisation du dépistage non invasif de la trisomie 21 [26]. Il est actuellement proposé aux patientes définies comme à haut risque de trisomie 21 : âge supérieur à 35 ans, anomalies échographiques, antécédent de trisomie 21, marqueurs du 1 er trimestre élevés, translocation robertsonienne parentale avec chromosome 21 impliqué. Un test de dépistage positif doit systématiquement être confirmé par un prélèvement invasif (biopsie de trophoblaste ou amniocentèse). Par ailleurs, l importance d une consultation prétest y est soulignée. En France, le Comité consultatif national d éthique pour les sciences de la vie et de la santé (CCNE) vient d émettre très récemment un avis favorable au développement des tests génétiques fœtaux sur sang maternel. Il estime que le test génétique fœtal de la trisomie 21 sur sang maternel pourrait être progressivement introduit comme un élément du dépistage combiné actuel. En l occurrence, ce test s adresserait aux patientes considérées comme à risque par le test combiné (âge + nuque + marqueurs sériques). Il confirme qu un caryotype devra être réalisé en cas de test positif. "Au- delà, ce test pourrait être proposé en première intention du dépistage, si sa pertinence scientifique se confirme en cette matière, chez l ensemble des femmes enceintes : les limites de cette mise en place sont d ordre technique, organisationnel et financier plus qu éthique". Le délai de mise en place du test dépend dès lors de l'agence de la Biomédecine. 6. Les avancées de la CGH array Le caryotype standard est actuellement toujours le gold standard pour la mise en évidence de déséquilibres chromosomiques en diagnostic prénatal. Néanmoins, cette technique a deux principaux inconvénients : la nécessité d une culture cellulaire d environ trois semaines, et la résolution maximale d interprétation limitée à 5-10 Mb. Pour pallier le délai inhérent à la culture cellulaire et du fait de la fréquence de certaines anomalies recherchées, des sondes dirigées vers des loci spécifiques des chromosomes 13, 18, 21 et Y ont été développées. C est la technique d hybridation in situ par fluorescence (FISH). La CGH array ou caryotype moléculaire possède le triple avantage de s affranchir de la nécessité d une culture cellulaire, de ne pas se limiter à des loci précis et d atteindre une résolution de l ordre de 1 Mb. Le principe repose sur la détection de gains ou de pertes de matériel chromosomique, identifiées par hybridation in situ de régions chromosomiques connues. La comparaison entre un ADN témoin et l ADN analysé permet de détecter des différences en plus ou en moins de matériel chromosomique et d identifier les régions correspondantes à une résolution de 1 Mb. La CGH array est utilisée de façon usuelle en postnatal dans le cas des retards mentaux non étiquetés, d anomalies morphologiques à caryotype conventionnel normal. On retrouve jusqu à 15 % d anomalies à la CGH lorsque le caryotype était considéré comme normal [27]. L utilisation des micro arrays est en cours d évaluation dans la pratique du diagnostic prénatal, à partir de prélèvements de cellules fœtales par amniocentèse ou biopsies de trophoblaste. Les indications sont encore débattues : clarté nucale augmentée, RCIU, malformations 67

Médecine fœtale Son utilisation en cas de MFIU semble améliorer le taux de dépistage d anomalie génomique, notamment par le fait qu il n y a pas besoin de culture cellulaire pour la technique CGH, ce qui est fondamental dans le cas des cellules altérées en cas de mort fœtale [28]. Depuis la première étude de Rickman et al. en 2006 [29], démontrant la faisabilité de la CGH array sur des cellules fœtales non cultivées obtenues par amniocentèse, plusieurs techniques ont été développées, s orientant progressivement vers une analyse à plus grande résolution. Une méta-analyse récente par Hillman et al. [30] montrait que la CGH array en prénatal détectait 3,6 % (IC 95 % : 1,5-8,5) de déséquilibres chromosomiques supplémentaires lorsque le caryotype standard était considéré comme normal. Deux grandes études portant sur plus de 4 000 grossesses ont retrouvé une amélioration du taux de détection d anomalies chromosomiques lorsque la CGH array est comparée au caryotype standard [31, 32]. Le problème majeur de l utilisation de la CGH array en diagnostic prénatal est celui de l interprétation des résultats. En effet, il est parfois difficile, voire impossible, de corréler des variations de nombre de copies de génome, identifiées par la technique, avec le phénotype fœtal. Ces variations de génome sans lien identifié avec la clinique sont appelées variations de significations indéterminées. Le nombre de ces variations inconnues se réduit chaque jour grâce à la mise en place de bases de données internationales permettant de mettre en commun les résultats [33]. La prochaine étape d utilisation de la CGH array sera probablement de supplanter complètement le caryotype conventionnel. D autres méthodes de séquençage génomique pourront dans l avenir prendre le relais de cette technologie. Une technique, décrite par l équipe de Talkowski et al. [34], permet un séquençage de l ensemble du génome, dans un délai raisonnable (15 jours) en utilisant des séquences d ADN connues réparties dans tout le génome. Il demeure néanmoins le problème du coût des techniques qui est un frein à son utilisation systématique. D autre part, la pratique de ces tests en diagnostic prénatal doit être accompagnée d une information particulièrement claire sur les avantages et limites de la technique, au cours d une consultation dédiée. Le séquençage haut débit posera des questions médicales et éthiques. Par exemple, quelle information donner lorsqu on découvre fortuitement un polymorphisme dans un intron ou un exon qui est associé à une maladie totalement différente de ce qui est recherché dans le dépistage? Faut-il le dire? Que faire si la maladie ne s exprime que tardivement dans la vie? Si elle ne débouche sur aucune prise en charge particulière? Si elle permet un traitement ou un suivi précoce qui améliore le pronostic? Ces questions sont déjà connues des généticiens en postnatal, mais elles prennent un relief inédit en prénatal. L aboutissement logique sera ultérieurement la micro array sur l ADN fœtal dans le sang maternel, voire un séquençage. Pour l instant, cette éventualité n en est qu au stade d études préliminaires de faisabilité [35]. En plus du problème d interprétation des résultats variants d origine fœtale, l application de ce type de test sur sang maternel expose au risque de détecter des variants d origine maternelle. Cela pose des problèmes d interprétation de l origine fœtale ou maternelle de l anomalie. Il pourrait s agir de mosaïcismes chez la femme, avec ou sans conséquence, ou d un génotype potentiellement pathogène chez elle. [ Conclusion Le dépistage non invasif des anomalies chromosomiques dans le sang maternel est incontestablement un tournant majeur dans la pratique de la médecine prénatale. Son bénéfice essentiel sera de réduire de manière spectaculaire le nombre de gestes diagnostiques invasifs à risque de perte fœtale. La technologie s appliquera dans un proche avenir aux maladies monogéniques. L avancée rapide des nouvelles technologies moléculaires, telles que la CGH array, est en passe de transformer la cytogénétique prénatale et ouvre la perspective d analyser une grande partie du génome fœtal dans le sang maternel. Ces avancées imposent une réflexion éthique sur l information des patientes et le risque de dérive potentielle vers un enfant zéro défaut. Bibliographie 1. Lo YMD, Corbetta N, Chamberlain PF et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet, 1997 ; 350 : 485-487. 2. Lo YMD, Tein MS, Lau TK et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum : implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet, 1998b ; 62 : 768-775. 3. Lun FMF, Chiu RWK, Chan KCA et al. 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