Intoxication d Apis mellifera au Roundup 3+, altérations comportementales et bouleversements neurochimiques Michel Sokolowski, Université de Picardie Jules Verne Maxime Gauthier, Université du Québec à Montréal Marie-Pierre Halm, Université de Caen Basse-Normandie Monique Boily, Université du Québec à Montréal 1
Introduction 2 Roundup : Herbicide non sélectif, l un des plus utilisés (pulvérisation) Utilisation en augmentation (plantes OGM «roundup ready») Molécule active: glyphosate Traces retrouvées dans les urines de divers organismes: lapins, bovins, humains (Kruger et al., 214). Résidus dans le nectar (<= 3 mg/kg) et le pollen (<=3 mg/kg) après traitement au glyphosate pur (Thompson et al., 214). Résidus retrouvés dans le miel (jusqu à 16µg/kg), y compris «bio», de nombreux pays (Rubio et al., 214).
Introduction 3 Surfactants ajoutés au glyphosate dans la formulation commerciale Faible toxicité reportée pour les abeilles: DL 5 à 48h (oral) : > 254µg/abeille DL 5 à 48h (contact) : > 33µg/abeille Très peu d études publiées sur les effets toxiques et/ou non létaux du glyphosate
Introduction 4 Effets physiologiques: La consommation chronique de faibles doses (1.25 à 1 ng par abeille) réduit l activité AChE (acetylcholinesterase) (Boily et al., 213) AChE: enzyme impliquée dans la neurotransmission des effets comportementaux sont prévisibles
Introduction 5 Effets comportementaux: Faibles doses (1.25 à 5 ng par abeille) sans effets sur la consommation chronique de sirop en cagettes (Heidrei Helmer et al., 213) Sensibilité au sucre et conditionnement olfactif de la réponse d extension du proboscis affectés par une exposition chronique (15 jours) à des concentrations de 2.5 ou 5mg/l (Herbert et al., 214) Pas d effet sur le butinage ni les danses à 2.5mg/l Mais vol de retour à la ruche affecté par le butinage de sirop à 1mg/l (Balbuena et al., 215)
Introduction 6 Les protocoles comportementaux: Hedrei Helmer et al. (213): consommation journalière en cagettes (eppendorf) Herbert et al. 214: Conditionnement de la réponse d extension du proboscis Herbert et al. 214 : butinage dans un nourrisseur (3 visites avec sirop et 3 visites avec glyphosate) Balbuena et al. 215: navigation mesurée avec radar harmonique
Objectifs 7 Etudier les effets non létaux et chroniques du roundup 3+ (17g/l de glyphosate acide) Améliorer des protocoles comportementaux existants et en proposer de nouveaux (laboratoire et vol libre) Etudier les liens possibles entre les modifications comportementales et l activité de l AChE
1. Le seuil de consommation 8 Mesurer à quelle concentration une solution sucrée de roundup est consommée sans capture de l abeille Entrainement à venir butiner à l endroit d un point lumineux (plateau) Marquage Test dans un tunnel linéaire compartimenté avec des concentrations décroissantes On note quand l abeille consomme
1. Le seuil de consommation 9 Concentrations testées: 89.5 49.7 24 15.8 9 et 5.2 g/kg de glyphosate (concentrations non isocaloriques) % d'abeilles acceptant le sirop 45 4 35 3 25 2 15 1 5 89.5 (21.4) 49.7 (34.1) 24. (42.3) 15.8 (45) 9 (47.1) 5.2 (48.3) Concentration en glyphosate (g/kg) 71% des abeilles consomment des sirops dont la concentration est >5g/kg (34% de roundup 3+) Et cela, même si la concentration en sucre du sirop est réduite (<34%)
Utilisation d un logiciel développé au labo permettant de noter l arrivée et le départ de chaque abeille 1h de butinage de sirop puis 1h de sirop avec roundup (.56.56 et 5.6g/kg) Effets du Roundup chez l abeille 2. Le butinage sur nourrisseur 1 Mesurer à quelle concentration le roundup altère le butinage Méthode «classique» avec abeilles visitant un nourrisseur
2. Le butinage sur nourrisseur 11 Diminution de la fréquence de visite au nourrisseur à 5.6g/kg Concentration élevée par rapport aux concentrations reportées (max 3mg/kg dans le pollen) Seulement 1h d exposition Accès libre au sirop: peu réaliste sur le plan écologique Méthode pas très fine pour détecter des effets (peu de VD mesurées) % de visites par rapport au bloc 1 16 14 12 1 8 6 4 2 Contrôle.56g/kg.56g/kg 5.6g/kg 1 2 3 4 5 6 7 8 Blocs de 15 minutes
3. Butinage avec contrôle de l accès à la ressource 12 4 chambres de butinage en parallèle Nouveau dispositif (brevet en cours) Abeille entraînée à venir butiner dans un chambre de butinage individuelle Dispositif à proximité de la ruche Protocole: 1h de sirop à 5% (référence) puis 3 h de sirop avec roundup à concentrations variées ( 3 3 ou 3mg/kg)
3. Butinage avec contrôle de l accès à la ressource Nectar cumulé moyen par abeille (µl) 35 3 25 2 15 1 5 13 Contrôle.2.4.6.8 1 Temps (heures) Réf h+1 h+2 h+3 Mesure du flux de nectar transféré par les butineuses dans la colonie Flux globalement constant (légère augmentation avec le temps) Variable dépendante doublement pertinente Mesure de la santé de la colonie (accumulation de ressources) Mesure de la «santé» de l apiculteur (production de miel)
3. Butinage avec contrôle de l accès à la ressource 14 Nectar cumulé moyen par abeille (µl) 35 3 25 2 15 1 5 3 mg/kg Réf h+1 h+2 h+3.2.4.6.8 1 Temps (heures) Nectar cumulé moyen par abeille (µl) 35 3 25 2 15 1 5 3 mg/kg Réf h+1 h+2 h+3.2.4.6.8 1 Temps (heures) Nectar cumulé moyen par abeille (µl) 35 3 25 2 15 1 5 3 mg/kg Réf h+1 h+2 h+3.2.4.6.8 1 Temps (heures) Légère augmentation du flux à 3mg/kg Légère diminution du flux à 3mg/kg On pourrait estimer quantitativement l impact du pesticide sur la production de miel d une colonie. Ex: à 3mg/kg, chute de plus de 13%
4. La consommation chronique de roundup 15 Méthode «standard»: exposition en cagettes Amélioration de la méthode: remplacer l eppendorf par notre système de distribution (2µl de sirop par visite) 25 abeilles par boîte pendant 11 jours (4 séries de 2 boîtes). Capture sur cadre avec couvain. Cycle jour/nuit: 12h/12h. Roundup introduit le 2 ème jour pendant 1 jours Capteur pour mesurer la mortalité toutes les heures Calcul de la consommation par abeille vivante et par heure 3 concentrations: 3 3 mg/kg (8 boîtes par concentration) Dosages biochimiques d AChE pour toutes les survivantes
4. La consommation chronique de roundup 16 3 4 Contrôle Abeilles vivantes 25 2 15 1 5 Contrôle 3mg/kg 3mg/kg 2 4 6 8 1 12 Jours Consommation cumulée par abeille (µl) 35 3 25 2 15 1 5 3mg/kg 3mg/kg 2 4 6 8 1 12 Jours Mortalité à 11 jours: environ 28% Pas de différence entre les traitements Pas d effet de la concentration sur la consommation moyenne par abeille vivante
4. La consommation chronique de roundup 17 Consommation par abeille (µl) 6 5 4 3 2 1 25 5 75 1 125 15 175 2 225 25 Heures d'expérimentation Contrôle 3mg/kg 3 mg/kg Consommation en µl 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1.5 Contrôle 3mg/kg 3 mg/kg 4 8 12 16 2 24 Heure Patron régulier de consommation jour/nuit Pic de consommation au milieu de la période d éclairement Très faible consommation la nuit Pas d effet de la concentration du roundup.
4. La consommation chronique de roundup 18 Analyses biochimiques Exposition 1: du 3 août au 1 septembre Exposition 2: du 11 septembre au 22 septembre Exposition 3: du 23 septembre au 4 octobre 2 boîtes par concentration testée Méthode de dosage en microplaque adaptée d'ellman (1961) 1n = 2 têtes d'abeilles (entre 7 et 12n par boîte) Unités de mesure de l'act. de l'ache (mmoles/hre/mg protéines) ANOVAs à 1 critère. Traité statistiquement par exposition
4. La consommation chronique de roundup 19 Activité AChE (µmole/hre/mg prot) 4 3 2 1 Exposition 1 Activité AChE (µmole/hre/mg prot) 4 3 2 1 Exposition 2 Activité AChE (µmole/hre/mg prot) 4 3 2 1 Exposition 3 * contrôle 3mg/kg 3mg/kg Concentration en glyphosate contrôle 3mg/kg 3mg/kg Concentration en glyphosate contrôle 3mg/kg 3mg/kg Concentration en glyphosate Augmentation significative (p=.244) de l activité d AChE pour 3 mg/kg, mais seulement pour l exposition 3 (abeilles d octobre).
5. Le choix entre sirop contaminé et sirop non contaminé 2 Savoir si les abeilles sont capables d éviter de consommer du roundup: protocole de choix Boîtes à 2 nourrisseurs : l un distribue du sirop, l autre du sirop+roundup ( 3 3 ou 45mg/kg) 45 abeilles par boîte (butineuses) Distribution de 2 µl de sirop à chaque visite dans chaque nourrisseur Cycle jour/nuit (12h/12h). Distribution stoppée automatiquement la nuit (21h-9h). Jour 1: choix sirop/sirop. Jours 2 et 3: choix sirop/roundup
5. Le choix entre sirop contaminé et sirop non contaminé Proportion de sirop pour la fleur 1 1.8.6.4.2 21 Jour 1: Sirop-Sirop Jour 2: Sirop-Sirop Jour 3: Sirop-Sirop Contrôle 9 11 13 15 17 19 21 Heure dans la journée Proportion de roundup consommé 1.8.6.4.2 Jour 1: Sirop-Sirop Jour 2: Sirop-Roundup Jour 3: Sirop-Roundup 3 mg/kg 9 11 13 15 17 19 21 Heure dans la journée 9 11 13 15 17 19 21 Heure dans la journée Pas de préférence pour le sirop non contaminé à 3 et 3mg/kg À 45g/kg (dose extrêmement élevée), les abeilles évitent le glyphosate en mois de 3 heures et n y reviennent quasiment pas le lendemain Proportion de roundup consommé 1.8.6.4.2 Jour 1: Sirop-Sirop Jour 2: Sirop-Roundup Jour 3: Sirop-Roundup 3 mg/kg Proportion de roundup consommé 1.8.6.4.2 Jour 1: Sirop-Sirop Jour 2: Sirop-Roundup Jour 3: Sirop-Roundup 45 g/kg 9 11 13 15 17 19 21 Heure dans la journée
Conclusion 22 Les abeilles consomment du sirop même à des concentrations de glyphosate élevées Pas d effet d une exposition chronique au glyphosate sur le patron de consommation de sirop Les abeilles n évitent pas le glyphosate quand elles en ont la possibilité (sauf à des concentrations très élevées). le butinage ne semble affecté qu à partir de concentrations de 3mg/kg (les analyses sur les composantes du butinage sont en cours) Le glyphosate peut entrer dans une ruche avec d éventuelles conséquences pour la colonie (couvain)
Conclusion 23 Modification de niveaux d activité d AChE détectés pour une exposition chronique à une concentration de 3mg/kg, mais seulement pour les abeilles d octobre. Sensibilité accrue des abeilles d automne aux pesticides? (Wahl et al., 1983) Résultat qui contraste avec l absence d effet comportemental à cette même concentration: faire des tests comportementaux à après l exposition chronique (locomotion). Batterie de protocoles innovants parfaitement adaptée pour l étude des effets sublétaux.
24 Remerciements: Jean-Philippe Chombar, Moudrik Fallous, Alexis Fourny, Mickael Naassila, Cleomir Niquet, Caroline Trecherel