20 juin 2017 Page 1 de 8 1. Domaine et application La trypanolyse permet de confirmer ou non la présence d anticorps contre le trypanosome Trypanosoma brucei gambiense. Pour le test, des trypanosomes vivantes sont incubés avec l échantillon et un sérum de cobaye (source de complément). Si des anticorps spécifiques contre T.b. gambiense sont présents dans l échantillon, ils se fixent sur la surface des trypanosomes, et activentt le complément. Dans ce cas, le trypanosome sera lysé et tué. La réalisation de ce test equière une expertise et l équipement d un laboratoire de référence. 2. Responsabilités SOP Titre: Trypanolyse sur sang séché sur papier filtre Whatman 4 Étude: Outils diagnostiques pour l élimination et les essais cliniques dans la trypanosomiase humaine africaine (DiTECT-THA) Fonction Technicien de labo Activités Inoculationn des souriss Incubation des trypanosomes avec les éluats des papiers filtre Lecture au microscope 3. Procédures 3.1 Précautions Les trypanosomess T.b. gambiense LiTat 1.3 et LiTat 1.5 sont hautement infectieux et virulents. C est pourquoi ces deux souches de parasites doivent être manipulées avec la plus grande prudence par un personnel hautement qualifié et correctement formé. La trypanolyse ne peux être exécutée que dans un laboratoire L2. Le personnel portera des lunettes de protection adéquate. Le port de gants à usage unique est obligatoire pendant toutes les manipulations. Le port d une blouse de laboratoire correctement ferméee est obligatoire. Cettee blouse de laboratoire ne sera portée que dans le laboratoire L2 et ne pourra en aucun cas être portée à l extérieur. 3.2 Matériel et échantillons 3.2.1 Équipement et petit matériel Animalerie et cryobanque avec les stabilats de trypanosomes Frigo (4-8 C), congélateur (-20 C), bain-marie (37 C), microscope avec contraste de phase, machine à glace Agitateur (p.e. Vortex Genie 2T, VWR 444-9174) avec adaptateur pour microplaques (VWR 444-0061) Ordinateur Imprimante Photocopieuse Perforatricee 6 mm Marqueur indélébile Micropipette à volume variable jusque 1000 µl Micropipette à volume variable jusque 100 µ l
20 juin 2017 Page 2 de 8 Micropipette à volume variable jusque 10 µl Micropipette multicanaux,12 canaux volume 5-50 µl 3.2.2 Matériel à usage unique Microplaque 96 puits avec fond plat (GREINER Microlon 96K, réf 655001) Microplaque 96 puits avec fond U (Thermo Scientific, réf 611U96) Tube polystyrene 3.5ml, 55x12 mm PS (Sarstedt, réf 55.484) avec bouchon (Sarstedt, réf 65.809) Embouts 1000 µl (bleu) Embouts 200 µl (jaune) Embouts avec filtre 10 µl (blanc) Nacelles à peser pour recueillir les confettis Réservoir à réactifs (VWR, réf. 613-1185) Lancette ou aiguille ou pince pour manipuler les confettis Feuille adhésive pour microplaque (Elscolab, réf COS4612) Gel de silice avec indicateur orange (Merck, réf 1.01969.1000) Tube Falcon de 50 ml (50 ml correspond à 35 grammes de gel de silice sec) Lame porte-objets pour microscope Lamelles couvre-objets 18 x 18 mm Lamelles couvre-objets 24 x 24 mm Seringue avec aiguille de 1 ml Ciseaux Registre d'échantillons Fichier Excel "SOP-REG-LAB-23-Trypanolyse sur papier filtre" pour enregistrer les résultats Feuille d'inoculation de souris (voir annexe) 3.2.3 Réactifs Tampon PSG (Na 2 HPO 4.2H 2 O: 7.4 g/l; NaH 2 PO 4.H 2 O: 0.3 g/l; NaCl: 1.86 g/l; glucose anhydre: 10 g/l; ph 7.9-8.1) congelé à -20 C en volumes de 2 ml Fetal bovine serum (GIBCO, réf 10500-64) congelé à -20 C en volumes de 8 ml dans des tubes Falcon Sérum de lapin contrôle positif anti-litat 1.5 congelé à -80 C en volumes de 100 µl Sérum de lapin contrôle positif anti-litat 1.3 congelé à -80 C en volumes de 100 µl Sérum de cobaye (source de complément) congelé à -20 C en volumes de 2 ml Cryostabilat T.b. gambiense LiTat 1.3 congelé en azote liquide en volumes de 1 ml Cryostabilat T.b. gambiense LiTat 1.5 congelé en azote liquide en volumes de 1 ml Souris blanches de préférence des femelles de 20 30 grammes 3.2.4 Échantillons Sang séché sur papier filtre Whatman 4 conservé dans des sachets en plastique avec du silicagel 3.3 Mode opératoire Noter que la préparation des échantillons peut se faire entre l'inoculation des souris avec les souches de T.b. gambiense et la récolte des trypanosomes 3 ou 4 jours après l'inoculation.
20 juin 2017 Page 3 de 8 3.3.1 Préparation des échantillons Imprimer la feuille "Formulaire vide TL" du fichier Excel " SOP-REG-LAB-23- Trypanolyse sur papier filtre" comme feuille de paillasse Remplir la feuille de paillasse avec la date, le nom de l'opérateur, l'étude etc. Préparer deux microplaques à fond plat (Microlon) Décongeler le volume nécessaire de fetal bovine serum (80 µl par échantillon ou environ 8 ml par microplaque = 94 échantillons) Avec le marqueur indélébile, indiquer sur le côté de la microplaque le variant testé (LiTat 1.3 ou LiTat 1.5), la date et, s'il y a plusieurs microplaques, le numéro de série de la plaque, p.e. 3- -2/4/2017-1 Avec le marqueur, tracer de lignes verticales sur les microplaques pour la diviser en quatre zones (colonnes 1-3, 4-6; 7-9, 10-12) Sortir un échantillon de sang séché sur papier filtre Whatman 4 de son enveloppe et noter le code de l'échantillon sur la feuille de paillasse Avec la perforatrice, couper quatre confettis de 6 mm de l échantillon de sang sur papier filtre au-dessus d une nacelle à peser Transférer deux confettis dans le puits A3 de la microplaque marquée LiTat 1.3 et deux confettis dans le puits A3 de la microplaque marquée LiTat 1.5. Les puits A1 et A2 reste vide et seront utilisés pour le contrôle positif (C pos) et le contrôle négatif (C nég). Noter le numéro de l échantillon sur le Formulaire pour trypanolyse dans la case A3. Noter des éventuelles remarques ou observation dans la case "Remarques" sur la feuille de paillasse. Remettre le filtre avec le reste de l'échantillon dans son enveloppe et vérifier si le silicagel est bien sec; sinon, remplacer le silicagel Etude/origine Date Souche Lot sérum de cobaye Exécuteur Stabilat Contrôle positif Lot FBS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C pos C nég B C D E F G H Remarques Procéder de même avec les échantillons suivants en transférant deux confettis par puits (A4, A5, A6 etc.) dans chaque microplaque Photocopier le "Formulaire pour trypanolyse" rempli" avec les codes des échantillons pour avoir un formulaire pour le test avec variant LiTat 1.3 et un autre pour le test avec LiTat 1.5
20 juin 2017 Page 4 de 8 À l aide d une micropipette, déposer 40 µl de fetal bovine serum dans le puits A2 (contrôle négatif). Ne rien déposer dans le puits A1. Déposer 40 µl de fetal bovine serum dans chaque puits contenant des confettis, en prenant soin de déposer le sérum au centre des confettis Couvrir les microplaques avec une feuille adhésive et laisser imprégner les papiers filtre pendant 5 minutes Régler la vitesse de l'agitateur au minimum, monter les microplaques et laisser agiter pendant dix minutes à température ambiante Incuber les plaques au frigo (4 C) pendant une nuit Le lendemain, agiter le plaques pendant une heure sur l agitateur avec la vitesse réglée au minimum Préparer deux microplaques à fond U. Avec le marqueur indélébile, indiquer sur le côté de la microplaque le variant testé (3 ou 5), l'étude, la date et, s'il y a plusieurs microplaques, le numéro de série de la plaque, p.e. 3-2/4/2017-1 Avec le marqueur, tracer de lignes verticales sur les microplaques pour la diviser en quatre zones (colonnes 1-3, 4-6; 7-9, 10-12) À l aide d une micropipette multicanaux, en commençant avec la rangée A, mais sans embout à la position 1, de la microplaque à fond plat marquée LiTat 1.3, transférer 20 µl d éluât de confetti dans la rangée A d'une microplaque avec fond U marquée LiTat 1.3. Changer les embouts de la micropipette multicanaux, cette fois-ci mettre aussi un embout à la position 1. Répéter cette étape pour les lignes B,C,D,E,F,G,H en changeant les embouts de la micropipette après chaque ligne. Dans le puits A1 de la microplaque LiTat 1.3, déposer 20 µl de contrôle positif (C pos, sérum de lapin anti-litat 1.3) Répéter le transfert d'éluât de la microplaque marquée LiTat 1.5 et déposer 20 µl de contrôle positif (C pos, lapin anti-litat 1.5) dans le puits A1 Couvrir les microplaques d une feuille adhésive et les conserver au congélateur à - 20 C pendant maximum un mois 3.3.2 Inoculation des souris avec les trypanosomes T.b. gambiense LiTat 1.3 et LiTat 1.5 Noter qu'il est fortement déconseillé d'inoculer les deux souches de trypanosomes en parallèle. Copier ou imprimer une feuille d'inoculation de souris (voir annexe) et remplir les données sur la souche, le cryostabilat, la date, l'opérateur, l'étude etc. Préparer deux ou maximum trois souris, les peser et marquer les poids sur la feuille d'inoculation Décongeler deux tubes de 2 ml de PSG Marqueur deux tubes de polystyrène (#1 et #2), les remplir avec 1 ml de PSG et les tenir à froid sur de la glace Sortir un cryostabilat (T.b gambiense LiTat 1.3 ou LiTat 1.5) de l azote liquide Décongeler le cryostabilat dans un bain-marie à 37 C Immédiatement ajouter un volume égal (1ml) de PSG au cryostabilat, mélanger et le garder à froid sur la glace Sous le microscope à contraste de phase, vérifier la parasitémie par Matching Method (MM, 5 µl sous lamelle 24x24 mm, 400x) et la noter sur la feuille d inoculation (voir figure en annexe) Diluer le cryostabilat avec du PSG pour obtenir une parasitémie de 1 trypanosome/champ (tube #1). Dans un autre tube contenant 1 ml de PSG (tube #2), transférer 10 µl de suspension du tube #1; garder les tubes sur glace
20 juin 2017 Page 5 de 8 Infecter une première souris en injectant 0.2 ml de la suspension dans le tube #1 par injection intrapéritonéale; marquer la souris à la queue avec un trait Remarque: si la souris pèse moins que 20 g, diminuer le volume d'inoculation, p.e. 0.1 ml Infecter la deuxième et la troisième souris en injectant 0.2 ml de la suspension dans le tube #2 par injection intrapéritonéale; marquer les souris à la queue avec deux ou trois traits Remarque: si la souris pèse moins que 20 g, diminuer le volume d'inoculation, p.e. 0.1 ml Noter sur la feuille d'inoculation quelle souris a reçu quelle inoculation À partir de 48 heures après inoculation, vérifier quotidiennement la parasitémie à la queue des souris par la MM et noter la parasitémie sur la feuille d inoculation À jour 3 ou 4 après inoculation, lorsque dans au moins une souris la parasitémie atteint antilog 8.1-8.4 en MM, les conditions sont réunies pour réaliser le test de trypanolyse 3.3.3 Réalisation du test Décongeler le volume nécessaire de sérum de cobaye (30 min à température ambiante); une microplaque complète = 94 échantillons Prélever un volume de sang à la queue de la souris dans du sérum de cobaye comme indiqué dans le tableau et tenir à frais Échantillons Sérum de cobaye Sang de souris 94 2.2 ml 15 µl 47 1.2 ml 8 µl 23 0.7 ml 5 µl Vérifier la parasitémie par Matching Method En fonction de la parasitémie, ajouter du sang de souris par volumes de 5 µl pour ajuster la parasitémie de la suspension de trypanosomes dans le sérum de cobaye à 5-10 trypanosome par champ (MM). Garder cette suspension à frais sur la glace À l'aide d'une micropipette multicanaux et un réservoir de réactif, ajouter 20 µl de la suspension de trypanosomes à chaque puits de la microplaque, y compris les puits contenant les contrôles (A1 et A2). Changer d embout après chaque pipettage. Monter la microplaque sur l'agitateur réglé à vitesse minimale et laisser agiter pendant 90 min à température ambiante Si applicable, recongeler le reste du sérum de cobaye 3.3.4 Lecture du test Pipeter 8 µl des contrôles positif et négatif et du premier échantillon sur une lame porte-objet (A1 à gauche, A2 au milieu, A3 à droite) Couvrir chaque goutte avec une lamelle (18X18 mm) Observer au microscope avec oculaires Wide Field et objectif 20X (10x20) Pour chaque échantillon, lire une dizaine de champs afin d'estimer le pourcentage de trypanosome vivants par champs Contrôle positif A1: vérifier si tous les trypanosomes sont morts = 100% lyse Contrôle négatif A2: vérifier si tous les trypanosomes sont vivants = 0% lyse Si un des contrôles ne donne pas le résultat attendu, le test est considéré comme invalide et le test doit être recommencé Si les contrôles donnent les résultats attendus, procéder à l'estimation de lyse des trypanosomes par chaque échantillon. Noter le pourcentage de lyse sur la feuille de trypanolyse. Noter des éventuelles remarques ou observation dans la case Déchets, nettoyage. Jeter immédiatement les lames dans le conteneur pour déchets contaminés, ne laisser surtout pas les trainer sur la paillasse! Déposer tout le matériel à usage unique dans un conteneur pour déchets contaminés
20 juin 2017 Page 6 de 8 Nettoyer la paillasse avec une solution de 2% hypochlorite 3.3.5 Enregistrement des résultats Remarque: l'enregistrement des résultats se fait avec le fichier Excel "Formulaire SOP-REG-LAB-23-trypanolyse". Ce fichier est protégé et ne peut être modifié. Pour garder les résultats en forme électronique, il faut sauvegarder le fichier sous un autre nom en ajoutant la date et série (p.e. TL- 2017-06-30-1) afin de le retrouver facilement pour compléter avec les résultats de lyse avec l'autre variant. Dans le fichier Excel ouvrir la feuille "Échantillons". Copier l'information sur l'étude/origine et les codes des échantillons dans le tableau. Ouvrir la feuille "LiTat 1.3" ou "LiTat 1.5" selon le variant testé. Copier les informations et les pourcentage de lyse de la feuille de paillasse dans le tableau Excel. Ouvrir la feuille "Résultats" et ajouter d'éventuelles remarques. Observer les résultats: si <50% de lyse: négatif; si >= 50 de lyse: positif. Imprimer la feuille et la signer. Avant de quitter le fichier Excel (fichier protégé), le sauvegarder sous un autre nom. Garder la feuille avec les résultats et la feuille originale de paillasse dans le registre de trypanolyse. 4. Définitions & abréviations IMT Institut de Médecine Tropicale, Anvers TL trypanolyse MM Matching Method PSG Phosphate Buffered Saline with Glucose 5. Historique du document Révision SOP-LAB-23-Trypanolyse sur sang séché sur papier filtre, Version 1.0, 20 juin 2017 Version initiale Nom et fonction Date Signature Auteur Philippe Büscher 20/06/2017 Révision par Approuvé par Veerle Lejon 20/06/2017
20 juin 2017 Page 7 de 8 Feuille d'inoculation de trypanosomes pour trypanolyse Date. Opérateur. Souche LiTat 1.3 LiTat 1.5 Cryostabilat code Volume (ml) Remarques Décongeler dans un bain-marie à 37 C Aussitôt après décongélation, ajouter un volume égal de PSG,0.5 ou 1 ml selon le volume du stabilat; bien mélanger Estimer la parasitémie initiale selon Matching Method (MM) (vol: 5 µl, couvre-objet: 24x24 mm, agrandissement: 10 x 40 contraste de phase) Selon le résultat du MM, diluer dans 1 ml de PSG (tube #1) pour obtenir une parasitémie de 1 trypanosome par champs (voir tableau ci-dessous) Parasitémie initiale antilog 7.9 8.1 8.4 8.7 Dilution: XX µl dans 1 ml de PSG 60 µl 30 µl 15 µl 8 µl Diluer encore 100 x dans le PSG avec 10 µl de la suspension de tube #1 dans 1 ml de PSG (tube #2) Préparer au maximum trois souris pour infection. Peser les souris. Infecter les souris par voie intrapéritoniale avec 0.1 ml/10 grammes. Marquer les souris à la queue avec un marqueur indélébile. Souris Poids (g) Suspension de trypanosomes Inoculation (ml) 1 Tube #1 1 tryp / champs 2 3 Tube #2 1 tryp / 100 champs Suivre la parasitémie et utiliser le sang d'une souris quand la parasitémie atteint antilog 8.1-8.4 selon Matching Method Jour après inoculation Date Souris 1 Souris 2 Souris 3 2 3 4 5
20 juin 2017 Page 8 de 8 Figure: Matching Method: schéma représentant le nombre de trypanosomes par champs et l' antilog correspondant