Plan Microscopie optique linéaire et non-linéaire pour la biophotonique Sandrine Lévêque-Fort Laboratoire de Photophysique Moléculaire et Centre de Photonique biomédical Orsay UPR 3361 CNRS sandrine.fort@ppm.u-psud.fr www.ppm.u-psud.fr/biophotonique.htm Rappel sur la Fluorescence : flurochromes,durée de vie, spectre, FRET, Anisotropie, Microscope Methodes plein champ : principe, applications Methodes monophotoniques alternatives : déconvolution, confocal Microscopie biphotonique Optimisation pour la microscopie linéraire et non-linéaire : Disque nipkow, Illumination structurée, multipoint biphotonqiue, TIRF Microscopie STED Microscopie non-lineaire complementaires Apport de la microscopie photonique Gamme de longueurs d onde énergie 10 3 10 1 10-1 (mm) 10-3 10-5 10-7 (nm) 10-9 10-11 10-13 10 2 1m 10-2 10-4 10-6 (µm) 10-8 10-10 10-12 ondes radio micro-ondes IR visible UV X rayons gamma (γ) 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 longueur d onde (nm) Microscopie Optique classique Fluorescence - Diagramme de Jablonski Résolution en microscopie optique classique ~ λ/2 400 nm < λ < 800 nm 200 nm < Res. < 400 nm 1
Fluorescence Diagramme simplifié Fluorochromes S 1 S 0 Conversion interne absorption désexcitation non radiative k fluorescence Γ Imagerie d intensité de fluorescence I(η) avec η = Γ/(Γ+k) résolution spatiale la structure des échantillons (autofluorescence) les sites de fixation de sondes fluorescentes Imagerie de durée de vie de fluorescence Durée de vie τ = 1/(Γ+k) résolution temporelle les interactions moléculaires l environnement physico - chimique des molécules mesure relative, indépendante de la concentration Rendement quantique φ = If/Ia (nb photons emis sur le nb photons absorbéspar la molécule) 0.5 < φ < 1 Coefficient d extinction ε reflète la proba d absorption d un molécule 5000< ε < 250000 cm -1. M -1 Intensité de fluorescence ou brillance = coeff extinction ε X Rendement quantique φ Durée de vie de fluorescence τ Caractéristique de l état physic-chimique de la molécule fluroescente, correspond à la durée de vie moyenne de l état excité. τ qq ns Imagerie spectrale, polarisation, fret. corréler les informations topologiques avec les propriétés réactionnelles Quenching, photobleaching, fading.. Quenching : diminution du rendement quantique d un fluorochrome due au conditions environnementales ( PH, effet des solvants, présence d autre fluorochromes, surface métallique..), correspond à une relaxation nonradiative des electrons excités vers l état fondamental Quenching dynamique ou statique Photobleaching : destruction irréversible d un fluorophore après excitation lumineuse Exemple de marquage Live bovine pulmonary artery endothelial Fading : extinction de la fluorescence sur une longue période sans nécessairement exces d excitation lumineuse Des parades existent!! Autofluorescence/ Marqueurs Endogenous fluorophores De nombreux constituants cellulaires sont fluorescents : tritophane, NADH, flavine, collagène.. Utilisation de protéines fluorescentes GFP(Green fluorescent Protein) et ses variantes en intégrant son code à celui d une protéine que l on veut étudier Marqueurs spécifiques du noyau, mitochocondrie, etc. Nanocristaux fonctionnalisés NADH, flavine : cellular metabolism Collagen, elastin : tissue structures Aromatic amino acids : trytophan, tyrosine and phenylalanine Porphyrin, lipopigments.. Fluorescence Excitation Spectra Fluorescence emission spectra Flavines NADH Lipopigments Porphyrines Lipopigments Flavines Porphyrines NADH G.A. Wagnières, W.M. Star, B.C. Wilson, Photochem. Photobiol., 1998, 68, 603. 2
Aequorea victoria GFP Spectres des différentes variantes de protéines fluorescentes Quantum dot Très brillants Spectre excitation large Spectre emission etroit Peu de photoblanchiment Durée de vie longue -- blinking Injection de Qdot dans des œufs fertilises de Xenope Durée de vie de fluorescence k = 1 / τ avec k = k r + k nr log I 0 /I I int intrinsèque environnement intensité Δt dn = (k r + k nr )N(t)dt I(t)= I o exp (- t / τ ) I(t)~N(t) Variation de la durée de vie de fluorescence (indépendante de la concentration) Micro-environnement de la sonde Interactions Protein-protein (FRET) 3
Fluorescence Resonance energy Transfer FRET Efficacité de Transfert et distance E : Efficacité de transfert = proportion de molécules qui reviennent de l état excité à l état fondamental par un phénomène de FRET Ro : distance de Förster = distance entre les chromophores pour laquelle il y a 50 % d efficacité de transfert R : distance entre les fluorophores Plus Ro est grand plus la probabilité d avoir du FRET sera importante! Fluorescence Resonance energy Transfer FRET Methodes de mesures FRET Spectral overlap Orientation factor -Analyse du ratio donneur/ accepteur -Analyse du spectre donneur et accepteur -Photodestruction de l accepteur -Mesure du temps de déclin de fluorescence -Corrélation de fluorescence -Anisotropie de fluorescence 4
Anisotropie de fluorescence I ( //( t) I ( t) t θ ) r( t) = = r0e θ 4π η I ( t) + 2I ( t) 3kT a 3 = // Le microscope Source Lampe Xenon, halogene Diode Laser continu, pulsé Détecteur PMT Photodiode à avalanche Caméra CCD Caméra EMCCD Filtre à l émission Echantillon Filtre à l excitation Miroir dichroique Objectif Excitation/détection point par point vs «plein champ» Formation d une image 3D Résolution - Objectif Objet(x,y,z) PSF(x,y,z) = Image(x,y,z) Résolution latérale Espace de Fourier Objet(k x,k y,k z ) FTO(k x,k y,k z ) = Image(k x,k y,k z ) Transformée de Fourier 0.61λ (x, = NA =n sinθ NA r y) λ longueur d onde d émission, NA l ouverture numérique, n l indice du milieu d interface, θ l angle du demi-cône de lumière capturée par l objectif Hautes fréquences k x,k y,k z fréquences spatiales détails FTO f C = 2 NA / λ Résolution axiale r (z) = 2λ NA 2 5
Émission de fluorescence Absorption à un photon Microscopie optique classique Illumination «plein champ» Energie Photon visible-uv d'excitation Dissipation interne de l'énergie S 1 Fluorescence visible S 0 Flux de photons de fluorescence émis : Fl1α σcf F : flux de photons incidents C : concentration σ : section efficace d absorption à un photon ~10-17 cm 2 / molécule Excitation: sources continues ou pulsées de lumière visible ou UV Lampe HG, mercure.. Laser Caméra Miroir 50-50 % ou dichroique Filter Image de Sample + pas de fluctuations d intensite + echantillon dans exactement le meme etat + adapté pour les microarrays, échantillon fin Intensité et durées de vie pour l ensemble de l échantillon deux bandes spectrales simultanément deux polarisations simultanément Exemple de Dispositif : LIFA (Lambert Instr.) FLIM Domaine Fréquentiel : Application au FRET Calcul du temps de vie: Déphasage Profondeur de modulation Relatif à une solution référence FRET in the cytosol, measured by FLIM. Transiently transfected cells with pcfp (no FRET, upper cell) or with CFP-YFP tandem construct (FRET, other two cells). In case of FRET, the lifetime of the donor CFP is shorter (here: blue, 1,9ns) than in case of no FRET (here: red, 2,4ns). Imagerie de fluorescence résolue en temps par excitation à 1 photon Ultrafast laser system intensity Excitation pulse Fluorescence emission Mesure de durée de vie en champ large : Porte temporelle Delay generator CCD τ GOI Filter Sample t 1 t 2 Dichroic mirror t 3 t 3 t 2 time Ι = Ι 0 e -t/τ t 1 Persistence ~300 µs Spectre photocathode Declenchement synchronisé avec le train de pulses du laser Genérateur de délai permet des pas de 25 ps La persistence de l écran à phosphore sens de mesure du déclin 6
Macroscopic multiwell-plate imaging Chemically specific imaging 3 cm 4000ps τ Coumarin 314 DASPI 0ps Influence of the fluorophore environment (viscosity) 200 ps τ 100 0 80 20 60 40 40 60 20 80 DASPI + ethanol glycerol 40 ps Image intensité et FLIM d un cartilage et d une artère 3500 ps 2400ps τ τ 400 μm 1150 ps 80 μm 1000ps 3400ps τ Image FLIM 1750ps Intensité Fluorescence Mise en place du multi-spectral imager Images FLIM résolue spectralement (dent) F F F Paire d images d intensité de Fluorescence Dichroique filtre Photocathode de la porte temporelle Détection simultanée de différentes composantes spectrales de l intensité de fluorescence Extraction de la durée de vie associée aux composantes spectrales carie enamel Image FLIM : dentine 450-505 nm 505-575 nm 2450ps 532 ps 663 ps 450-505 nm 505-575 nm τ 1250ps 450-505 nm 575-800 nm 536 ps 486 ps 450-505 nm 575-800 nm 2550ps τ 1350ps carie Meilleure localisation grâce à la séparation spectrale des durées de vie 7
Images FLIM résolues en polarisation Polarisation-FLIM R6G + solvant (η) F Fluorescence Polarisée Anisotropie : Cube séparateur de polarisation I// ( t) I ( t) r( t) = I ( t) + 2I ( t) avec // θ= 4π η 3kT a Photocathode de la porte temporelle F F ( t θ ) = r0e 3 R6G + Methanol η = 0.6 cp R6G + Ethylene Glycol η = 19.5 cp Anisotropie r(t) 0,1 Pola. Intensité Pola. Data Fit r 0 ~ 0.318 θ ~ 4.7 ns r( t) = r ( t θ ) 0e 0,01 4,0x10 4 3 8,0x10 8 3 1,2x10 12 4 (ns) Illumination monophotonique plein champ Image de l intensite et de la durée de vie de fluorescence pour l ensemble de l échantillon + pas de fluctuations d intensite + echantillon dans exactement le meme etat + adapté pour les microarrays - mauvaise resolution axiale - Echantillon fin Microscopie "Plein-champ" Mesure de la PSF Image composite: La déconvolution est requise! Objet 3D Lentille Détecteur Microsopie Confocale Pinhole 8
Deconvolution - PSF Principe du microscope confocal Source continue ou pulsée, Proche UV ou visible Détecteur : PM, photodiode à avalanche Reconstruction de l image en microscopie confocal Méthode d analyse point par point Pinhole Influence de la taille du diaphragme Petit diaphragme Déplacement du faisceau via des Miroirs galvanomètriques + Déplacement de l objectif en Z par des platine piezo Déplacement de l échantillon grâce à une Platine X,Y,Z http://micro.magnet.fsu.edu/primer/ Influence de la taille du diaphragme Influence de la taille du diaphragme Pinhole Petit diaphragme Pinhole Petit diaphragme Diaphragme moyen Diaphragme moyen Gros diaphragme http://micro.magnet.fsu.edu/primer/ http://micro.magnet.fsu.edu/primer/ 9
Résolution en microscopie confocal PSF(x,y,z) confocal = PSF(x,y,z) illumination x PSF (x,y,z) détection Excitation plein champ/ confocal pour différentes profondeurs grain de pollen Taille de la PSF(x,y,z) confocal = 70 % de la taille PSF(x,y,z) plein champ Microscopie plein champ classique Microscopie confocal r y) (x, = r y) (x, = 0.61λ NA 0.4λ NA = 200 nm r 2λn (z) = NA 2 = 450 nm r 1.4λn = 130 nm (z) = NA 2 = 320 nm λ = 450 nm NA =1.4 NA =n sinθ λ longueur d onde d émission, NA l ouverture numérique, n l indice du milieu θ l angle du demi-cône de lumière capturée par l objectif http://micro.magnet.fsu.edu/primer/ - Energie Confocal linéaire / non linéaire Dissipation interne de l'énergie S 1 Fluorescence visible S 0 Excitation à un photon Plus de photodégradation Fluorescence et lumiere excitatrice proches + Dissipation interne de l'énergie S 1 Energie Fluorescence visible S 0 Excitation à deux photons Confinement de l excitation Μeilleure pénétration dans les milieux biologiques Microscopie biphotonique S 1 Fluorescence visible S 0 Flux de photons de fluorescence émis: 2 2α F Fl δ C F : flux de photons incidents C : concentration δ : section efficace d absorption à deux photons ~ 10-50 cm 4.s/molécule/photon F E 1 h ν Δ τ 2 = E : énergie par impulsion Δτ : durée des impulsions O : beam waist laser impulsionnel femtoseconde focalisation avec un objectif de grande ouverture numérique 2 O = 1.22 λ /ON Excitation biphotonique Dispositif expérimental Miroirs galva x63 NA 1.4 Ti: Sa 700-1000 nm 100 fs 76 MHz 700 mw Laser pompe 532 nm 5W Fluorescence Photodiode Amplificateur PM + Sélecteur d impulsions Stop Start Analyseur Temporel picoseconde PTA Dichroique Chaîne de comptage de photons uniques corrélés en temps Reduction du photobleaching Intensité et durée de vie de fluorescence Résolution spatiale ~µm temporelle 30 ps 10
Microscope commercial 2 photons Mesure de durée de vie : TCSPC chaine de comptage de photon unique corrélé en temps Pulse laser 150 fs Start-Stop 1 Start-Stop 2 Start-Stop 3 13.5 ns Laser 76 MHz puissance atténuée à qq mw afin que le taux de comptage des photons de fluorescence < 1% log N N = nb photon τ = Durée de vie t = 0 Impulsion Laser Delai (canal) Δt Mesure de durée de vie : TCSPC Image d intensité et de durée de vie en mode confocal ++ Résolution ~30 ps - - acquisition lente 1 à 30 s par point de mesure PM + carte Becker/Hickle ou Picoquant Excitation à un photon microscope Confocal à balayage Excitation à deux photons microscope biphotonique à balayage Alternatives au microscope confocal Approches alternatives Source continue ou pulsée Proche UV ou visible Parallèlisation des mesures, réduction du temps d acquisition, pour préserver les échantillons, suivi de processus rapide ou étendre la zone de l échantillon étudié illumination structurée TIRF multipoints biphotoniques 11
Microscopie monophotonique plein champ Imagerie 3D par illumination structurée CCD Opt. Lett. 22 (1997) 1905 + réponse rapide + pas de fluctuations d intensite - mauvaise resolution axiale Réseau Only zero spatial frequency does not attenuate with defocus spatially modulate wide-field image using grid Z 0 + 4 µm Echantillon z 1 Z 1 =0 plan focal Z 2 =4 μm z 2 Rejet de la lumière située en dehors du plan focal Fonction de transfert et défocalisation Imagerie 3D par illumination structurée Z=0 plan focal Z=4 μm Fréquence décroissante Défocalisation Les hautes fréquences disparaissent rapidement avec la défocalisation perte des détails Fond flou dans les images plein champ Excitation S(x,y) = 1 + m cos(2πμx + φ 0 ) Fluorescence I(x,y) = I C + I S cos(2πμx + φ 0 ) μ = βλν / NA ν pas du réseau Enregistrement de 3 images pour 3 positions du réseau I 1, I 2, I 3, pour φ 0 =0, φ 0 =2π/3, φ 0 = 4π/3 1 2 3 2 2 IS= [( I0 I2π /3) + ( I0 I4π /3) + ( I2π /3 I4π /3)] 2 I conv = (I 1 + I 2 + I 3 )/3 2 Détourner la propriété de défocalisation des hautes fréquences pour extraire l information utile introduction d une «porteuse» du signal Modulée Section Conventionnelle Epaisseur de la section Isection 1[ 2uμ(1 μ /2)] J ~2 2uμ(1 μ /2) u =8(π/λ)zsin 2 (α/2) μ = βλν / NA ν Pas du réseau Fréquence spatiale normalisée β = γ f g / f t Magnification Optically sectioned intensity of EGFP in cell membrane Modulated image γ = x50 0.75 NA μ = 0.4 FWMH theorique 0.87 µm 0.91 µm mesurée γ = x150 0.95 NA μ = 0.8 FWMH theorique 0.27 µm 0.43 µm mesurée M. Neil et al. Opt. Lett. 22 (1997) 1905 12
Illumination structurée : produits commerciaux Optigrid Illumination structurée : produits commerciaux Apotome ZEISS ~75000 euros Optimisation du microscope biphotonique Réduction du temps d acquisition Création des multipoints biphotoniques Création de plusieurs points d excitation sur l échantillon Excitation sur une ligne dégradation de la resolution latérale Guild JB, Webb WW. 1995. Biophys. J. 68:A290 Brakenhoff GJ et al. 1996.J. Microsc. 181:253 59 Disque de microlentille Beamsplitter Création de points d excitation distincts preserver la resolution spatiale meilleure utilisation de la puissance laser disponible impose un détecteur résolu spatialement Squier et al. 2000 PM remplacé par une caméra CCD intensité de fluorescence de chaque point Bewesdorf et al. 1998 Buist et al. 1998 Nielsen et al. 2001 Total Internal Reflection TIRF Microscopy At the interface between coverslip and sample, for an angle superior to the critical angle, excitation of the evanescent wave Local excitation, close to the coverslip Low background Adhesion mechanisms, membrane traffic Glass index = 1.5 Aqueous medium index = 1.37<1.5 critical angle 66 I( z) = I(0) e z d λ d = 4π 1 sin 1 n 1 2 2 2 ( n ( i ) ) 2 2 http://www.molecularexpressions.com/ TIRF is well known, widely used and commercially available for intensity measurements (Leica, Olympus, Nikon, Zeiss, ) Association with FLIM is required for some specific applications in biology, like in situ neuropharmacology ex: @ 500 nm, 70, d=140 nm http://www.molecularexpressions.com/ 13
Possible configurations Experimental setup Laser http://www.molecularexpressions.com/ CCD Delay line H R I x3 telescope 60x 1,45 Prism + large range of incident angles - samples squeezed between prism and objective - setup not user-friendly - diffusion, absorption in the sample Through the objective + compact setup + objective with large NA available + epifluorescence + possible add of reaction products - small range of incident angles CCD Hamamatsu ORCA-AG High Rate Imager (Kentech Instruments Ltd) FLIM EM CCD Images TIRF-épifluorescence Receptor dynamics Time scale:1 min (286 shots, 200ms) 10 µm Chainettes de Lactoccocus Lactis marquées à l orange acridine Epi vs TIRF Cellules HEK marquées GFP Intensity map (A.U.) FLIM map (ps) Classical epifluorescence τ = 1,79 ns (std dev = 0,05) 10 µm TIRF τ = 1,67 ns (std dev = 0,23) 10 µm 14
Techniques de microscopie alternatives STED - Principe Amélioration de la résolution Microscopie 4π Micrscopie STED : Stimulated emission depletion Contraste différent Microscopie SHG :génération de second harmonique Microscopie THG : génération de troisième harmonique Microscopie Raman Micrscopie CARS : Raman stimulé S. Hell Towards nanoscopy Nature Biotech 21 2003 STED - images Sted- Resolution S. Hell S. Hell Towards nanoscopy Nature Biotech 21 2003 STED - 4π Modes de contrastes alternatifs <2 Fluorescence visible 2 3 p s p AS 2PEF SHG THG CARS S. Hell Towards nanoscopy Nature Biotech 21 2003 Absorption non linéaire puis émission Processus non cohérent Diffusion non linéaire Processus cohérent 15
Second harmonic generation (SHG) SHG/ Fluorescence Caractéristique temporelle et spectrale 2 SHG 2PEF vs SHG-THG SHG Montage <2 Fluorescence visible 2 3 SHG 2PEF SHG THG Photobleaching Processus non cohérent Emission isotrope Signal ne dépend pas de la géométrie Pas de Photobleaching Processus cohérent Emission directionnel Signal dépend de la géométrie : SHG signal non nul si organisation non centro-symetrique THG: Signal non nul si inhomogénéités spatiales fluo Couramment associée à la détection de la fluorescence Ressources web / Bibliographie Optical Microscopy Primer http://micro.magnet.fsu.edu/primer/ Microscopy ressource center www.olympusmicro.com/primer/ Photonic group imperial college www.imperial.ac.uk Stefan Hell group Special features Nature Biotechnology Decembre 2005 16