ARTICLE ORIGINAL Développement d'un test ELISA à base d'un antigène recombinant pour l'étude séro-épidémiologique de la theilériose tropicale au Maroc N. EL HAJ, M. KACHANI, F. KATZER, M. BOUSLIKHANE, R. EL GUENNOUNI, H. OUHELLI et B.R. SHIELS Département de Biologie, Université Ibn TOFAIL, B.P. 133, Kenitra, Maroc Département de Parasitologie et Maladies Parasitaires, Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, B.P. 6202, Rabat Instituts, Maroc Département de Microbiologie, Immunologie et Maladies Contagieuses, Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, B.P. 6202, Rabat Instituts, Maroc Département de Parasitologie Vétérinaire, Université de Glasgow, Bearsden Road, Glasgow, G61 1QH, UK Auteur chargé de la correspondance : Pr. Malika Kachani Téléphone : 212 7 773464 ; Télécopie : 212 7 773464 ; E. mail : kmalika@athena.online.co.ma RÉSUMÉ L'analyse des antigènes de surface du stade piroplasme brut de Theileria annulata a permis l'identification de protéines présentant des propriétés immunogéniques qui peuvent être utilisées dans des tests de diagnostic. Le gène qui code pour une de ces protéines a été identifié et cloné. Cette protéine nommée 2B2 a été produite puis purifiée. Un test ELISA, utilisant cette protéine recombinante comme antigène a été développé et standardisé puis évalué au moyen de 261 sérums témoins de bovins infectés par T. annulata et de bovins témoins négatifs. D'importants titres d'anticorps anti T. annulata ont été détectés dans les sérums d'animaux infectés par ce parasite alors qu'ils ont été très faibles dans ceux des témoins négatifs. Les degrés de spécificité et de sensibilité de ce test ont été respectivement de 0.96 et 0.89 tandis que ceux de l'elisa à base de l'antigène piroplasme brut ont été respectivement de 0.97 et de 0.75. Le degré de concordance entre ces deux tests a été calculé et la valeur Kappa a été de 0.62. Les premières investigations ont révélé que ce test pourrait constituer un moyen pratique dans le dépistage de la theilériose tropicale pour les études épidémiologiques au Maroc. MOTS-CLÉS : theilériose tropicale - Theileria annulata - diagnostic - ELISA - antigène recombinant - épidémiologie - prévalence - incidence. SUMMARY Evaluation of an enzyme linked immunosorbent assay using a recombinant antigen for the diagnosis of Theileria annulata infection. By N. EL HAJ, M. KACHANI, F. KATZER, M. BOUSLIKHANE, R. EL GUEN- NOUNI, H. OUHELLI and B.R. SHIELS. Studies of surface antigens of Theileria annulata crude piroplasms enabled to identify immunogenic proteins that could be used in diagnosis tests. The gene coding for one of these proteins has been determined and cloned. A recombinant protein was producted by molecular biology techniques and purified. An Enzyme Linked Immunosorbent Assay using this protein as antigen was developed and standardised and evaluated with 261 bovine control sera infected with T. annulata and negative controls. High titres anti T. annulata antibodies were detected in the sera of animals infected with T. annulata whereas they were very low in the negative control sera. The specificity and sensitivity of this test were estimated and were 0.96 and 0.89 respectively whereas they were 0.97 and 0.75 respectively for ELISA test using the crude piroplasme as antigen. Correlation between these ELISA tests was calculated and the kappa value was 0.62. These preleminary investigations showed that this assay could be used as a screening test in epidemiological studies of tropical theileriosis in Morocco. KEY-WORDS : tropical theileriosis - Theileria annulata - diagnosis - ELISA - recombinant antigen - epidemiology - prevalence - incidence. 1. Introduction Theileria annulata est un protozoaire qui cause la theilériose tropicale et qui est transmis par les vecteurs du genre Hyalomma spp [6]. La theilériose tropicale est une maladie lymphoproliférative d'une importance économique majeure qui menace plus de 250 millions de bovins dans les régions d'afrique du Nord, du Sud de l'europe et de l'asie [22]. Au Maroc, elle est classée parmi les maladies bovines les plus pathogènes et les plus importantes sur le plan économique. Le taux de mortalité a été estimé chez les animaux atteints, de race importée à 70 % et chez ceux de race locale à 40 % [14]. Un vaccin contre la theilériose tropicale a été mis au point [15]. Il est basé sur l'utilisation de cellules infectées par les schizontes de T. annulata, atténués en culture cellulaire par des passages successifs. Ce vaccin s'est montré efficace sur le terrain et a permis de protéger 99 à 100 % des animaux vaccinés dans une région endémique pour la theilériose [16].
562 EL HAJ (N.) ET COLLABORATEURS Le diagnostic de la theilériose est basé essentiellement sur l'identification des piroplasmes dans les frottis sanguins et des schizontes dans les frottis lymphatiques colorés au Giemsa. Toutefois, bien que la prévalence de la maladie puisse être déterminée par l'examen des frottis [15], cette technique est lente et manque de spécificité et de ce fait n'est pas pratique dans les études épidémiologiques [19]. Différents tests sérologiques basés sur la détection des anticorps dans le sérum des animaux ont été utilisés pour le diagnostic des infections dues au genre Theileria notamment la réaction de fixation du complément, le test d'agglutination et en particulier le test d'immunofluorescence indirecte (IFI), [18, 17, 2, 3]. Cependant, ces tests sont difficiles à développer et à interpréter. L'ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) est un test plus pratique car sensible, objectif et de moindre coût [25]. En effet, de nombreux travaux ont montré que ce test est un outil de choix dans le dépistage de la theilériose bovine dans les études épidémiologiques [5, 20, 11, 21]. Des investigations réalisées sur la souche T. annulata Doukkala (Maroc) ont révélé que parmi les trois stades du parasite infectant le bovin, le piroplasme constitue l'antigène le plus approprié au test ELISA [7]. Cependant, la production de cet antigène, utilisé jusqu'à présent à l'état brut, nécessite l'infection d'un animal, la collecte de sang infecté lorsque la parasitémie atteind une valeur maximale supportable par l'animal et la purification des piroplasmes. De plus, l'elisa à base de l'antigène piroplasme brut est difficile à standardiser. Cette standardisation doit être réalisée pour chaque nouvel échantillon d'antigène préparé. Pour toutes ces raisons un test ELISA, basé sur l'utilisation d'un antigène de surface du piroplasme de Theileria annulata a été mis au point. Cet antigène a été reconnu par les sérums de bovins infectés expérimentalement et par un anticorps monoclonal spécifique du stade mérozoïte de T. annulata. Le test à base de cet antigène s'est révélé suffisamment sensible et spécifique. De plus, il est pratique, de moindre coût et sa standardisation est facile. Les premières investigations ont révélé qu'il pourrait constituer un moyen pratique et sûr pour déterminer la prévalence et l'incidence de la theilériose bovine au cours des enquêtes séro-épidémiologiques au Maroc. 2. Matériel et méthodes A) PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL 1) ELISA à base de l'antigène recombinant a) Antigène L'analyse du piroplasme brut de T. annulata a permis l'identification de protéines de surface, reconnues par des sérums obtenus par immunisation avec le parasite [8]. Le gène qui code pour une des protéines immunogènes a été identifié et cloné (SHIELS et KATZER, communication personnelle). Cette protéine recombinante a été obtenue en suivant les principales étapes suivantes : L'ADN (E31B) contenant le gène codant pour la protéine ainsi que des ADNs vecteurs, extraits des cellules Escherichia coli ont subi une digestion enzymatique suivie d'une ligation puis utilisés pour transformer des cellules immunocompétentes. Les cellules ayant exprimé des protéines ont été identifiées. Le caractère immunogène de ces protéines a été vérifié par immunoblotting en utilisant des sérums de bovins infectés par T. annulata. La protéine immunogène nommée 2B2 a été produite puis purifiée sur une colonne de chromatographie. La purifiaction a été vérifiée par éléctrophorèse sur gel de polyacrylamide. b) Sérums - Standardisation : Les sérums utilisés pour la standardisation du test ELISA à base de la protéine recombinante sont des sérums individuels et des mélanges soit de sérums positifs soit de sérums négatifs pour T. annulata. Ces sérums ont été prélevés, avant ou après infection, sur des d'animaux ayant servi dans les expérimentations de vaccination contre la theilériose tropicale : (92/2) et (95/1). Expérimentation 92/2 : Dans cette expérimentation, 5 bovins de race Holstein-Pie-Noire indemnes de T. annulata qui ont été vaccinés par deux injections consécutives d'une suspension cellulaire : lymphocytes infectés par des schizontes de T. annulata Doukkala, aux doses successives de 10 4 cellules dans 2 ml du milieu RPMI 1640 à deux semaines d'intervalle puis infectés par des injections de sporozoïtes à la dose de 0.4 e-t. Les sérums ont été prélevés avant la vaccination (J0) et après injection des sporozoïtes (J28). Expérimentation 95/1 : Cette expérimentation a été conduite pour tester différentes préparations vaccinales. Vingt cinq bovins de race Holstein-Pie-Noire ont été immunisés par des cellules vaccinales de T. annulata Doukkala puis infectés par des sporozoïtes. Les sérums ont été prélevés avant la vaccination (J0) et après infection par les sporozoïtes (J40). Vingt sérums négatifs ont été mélangés pour constituer un pool négatif et 20 sérums positifs ont été mélangés pour constituer un pool positif. - Evaluation du test ELISA/2B2 : Un total de 261 sérums ont été utilisés pour évaluer l'elisa à base de la protéine 2B2. Ils ont été prélevés d'animaux indemnes de T. annulata (sérums négatifs) et d'autres infectés expérimentalement (sérums positifs). L'infection a été faite soit par vaccination par des schizontes attenués en culture cellulaire à la dose de 10 4 cellules dans 2 ml du milieu RPMI 1640 ou par injection de sporozoïtes à la dose 0.4 e-t. Les sérums ont été prélevés à différentes dates après la vaccination et à différentes dates après l'épreuve de virulence par les sporozoïtes. c) Test Le test ELISA utilisant la protéine recombinante de T. annulata comme antigène a été standardisé comme suit : Les concentrations optimales de l'antigène recombinant (2B2), des sérums tests et du sérum conjugué ont été détérminées grâce à un titrage fait par des doubles dilutions. L'antigène dilué dans du tampon carbonate bicarbonate (ph 9,6) a été utilisé aux concentrations suivantes: 0.625 µg/ml,
DÉVELOPPEMENT D UN TEST ELISA À BASE D UN ANTIGÈNE RECOMBINANT 563 1.25 µg/ml, 2.5 µg/ml, 5 µg/ml et 10 µg/ml. Un volume de 100 µl de cet antigène a été incubé dans une microplaque ELISA à fond plat (Nunc-Immonoplate I) à + 4 C pendant une nuit. Les sérums témoins positifs et négatifs ont été dilués au 1 :100 et au 1 :200, dans du tampon de dilution (PBS/Tween 20 (0.05 %)/lait 3 %), puis incubés à 37 C pendant 30 minutes. Le sérum conjugué IgG anti-bovin, produit chez le lapin (Polyvalent Immunoglobuline Peroxydase Conjugate A- 6154) a été dilué au 1 :1000, 1: 2000, 1 : 4000 et 1 :16 000 dans du tampon de dilution (PBS/Tween 20 (0.05 %)/lait 3 %) puis incubé pendant 30 minutes à 37 C. Les lavages entre les incubations ont été effectués avec du tampon de lavage PBS/Tween 20 (0.05 %), ph 7,4. La révélation du complexe immun a été effectuée par addition du substrat 33',55' tétraméthyl-benzidine (TMB, Sigma) et incubation durant 20 minutes à 37 C. La réaction a été enfin arrêtée par addition de 50 µl d'acide sulfurique (H2SO4, 2M). 2) ELISA À BASE DE L'ANTIGÈNE PIROPLASME BRUT a) Antigène L'antigène piroplasme a été préparé à partir d'un veau infecté par une souche marocaine : T. annulata Doukkala [12]. Les piroplasmes ont été purifiés selon la technique décrite par MELROSE et BROWN (1985), [12]. Ils ont été ensuite resuspendus dans du tampon phosphate salin (PBS) additionné d'un inhibiteur de protéases. La solution antigénique a subi une sonication et le contenu protéique a été estimé selon la technique décrite par KACHANI et al., (1996), [8]. b) Sérums Parmi les 261 sérums testés par l'elisa à base de la protéine 2B2, 224 ont été analysés par le test ELISA à base de l'antigène piroplasme brut. c) Test Ce test a été développé et standardisé selon la technique rapportée par KACHANI et al., [8]. La densité optique des sérums analysés par les deux tests ELISA a été déterminée au moyen d'un lecteur ELISA (Titerteck Multiscan Plus ELISA, Flow Laboratories) à 450 nm. 3) ANALYSE DES RÉSULTAS Le calcul de la spécificité et de la sensibilté des deux tests : ELISA à base du piroplasme brut et ELISA à base de la protéine recombinante a été fait selon la méthode décrite par THRUSFIELS (1986), [24]. La valeur du seuil de positivité des deux tests a été déterminée selon la formule suivante : D.O. (moyenne) + 2 (écart-type). Elle a été calculée grâce à l'analyse de 123 sérums, prélevés de veaux nés après la saison de la maladie et maintenus dans une ferme indemne de theilériose. Le degré de concordance entre les deux tests ELISA a été estimé en calculant la valeur Kappa selon la méthode rapportée par TOMA et al., (1991), [23]. 2. Résultats La standardisation de l'elisa à base de la protéine recombinante a révélé que les concentrations qui donnent les meilleurs résultats ont été de 5 µg/ml pour l'antigène, de 1 : 200 pour les sérums tests et de 1 : 4000 pour le sérum conjugué. La standardisation de l'elisa à base du piroplasme brut a révélé que les concentrations qui donnent les meilleurs résultats ont été de 5 µg/ml pour l'antigène, de 1 : 400 pour les sérums tests et de 1 : 5000 pour le sérum conjugué. Les seuils de positivité de l'elisa à base de l'antigène recombinant a été de 0.165 et celui de l'elisa à base du piroplasme brut a été de 0.321 (Tableau I). Parmi un total de 261 sérums, 224 ont été analysés par le test ELISA à base de l'antigène piroplasme brut. 154 sérums se sont révélés positifs contre 70 sérums négatifs. Le même lot de sérums (261) a été analysé par l'elisa utilisant la protéine recombinante 2B2 comme antigène. Le nombre de sérums positifs a été de 139 et celui des négatifs a été de 122 (Tableau II). D'importants titres d'anticorps dirigés contre la protéine recombinante ont été détectés dans les sérums des animaux infectés par T. annulata, tandis qu'ils ont été négligeables dans ceux issus des animaux indemnes de theilériose. Les degrès de sensibilité et de spécificité de l'elisa utilisant la protéine recombinante ont été respectivement de 0.89 et 0.96 et ceux de l'elisa à base du piroplasme brut ont été de 0.75 et 0.97 (Tableau III). Le calcul du degré de concordance entre les deux tests : ELISA à base de l'antigène recombinant 2B2 et de l'elisa à base de l'antigène piroplasme brut a donné une valeur Kappa de 0.62 (Tableau IV). L'analyse par l'elisa à base de la protéine recombinante des mélanges de sérums témoins positifs et négatifs pour T. annulata issus de l'expérimentation 95/1 a donné les résultats présentés dans la Fig. 1. Le ratio entre les valeurs des témoins positifs et ceux des témoins négatifs a été de 4.3. 3. Discussion Ces premières investigations ont révélé que le test ELISA utilisant comme antigène la protéine de surface du piroplasme de T. annulata permet la détection d'importants titres d'anticorps dans les sérums issus de bovins infectés par ce parasite et des titres négligeables dans les sérums de bovins non infectés. Les degrés de spécificité des deux tests ELISA sont comparables (0.96 pour l'elisa à base de l'antigène recombinant et 0.97 pour l'elisa à base de l'antigène piroplasme), tandis que la sensibilté du test à base de l'antigène recombinant est meillleure (0.89) que celle du test à base de l'antigène brut (0.75). Les travaux effectués sur les tests sérologiques [9] ont montré que l'elisa est l'outil de choix dans
564 EL HAJ (N.) ET COLLABORATEURS TABLEAU I. TABLEAU II. TABLEAU III. 1. TABLEAU III. 2. TABLEAU IV. les études épidémiologiques sur la theilériose tropicale, grâce à sa rapidité, son objectivité et sa sensibilité. Il présente aussi l'avantage de permettre l'analyse rapide d'un grand nombre de sérums en un temps relativement plus court que les autres tests. Parmi les trois stades du parasite infectant le bovin, le piroplasme de T. annulata constitue l'antigène brut le plus approprié pour l'elisa car il donne des titres d'anticorps négligeables et non spécifiques avant l'infection et des titres élevés et spécifiques après l'infection [7]. La comparaison de l'elisa avec l'ifi et l'examen des frottis sanguins colorés au Giemsa, comme outils de dépistage de l'infection dans les études épidémiologiques a révélé que l'elisa à base de l'antigène piroplasme est le plus sensible en particulier lorsque les sérums sont prélevés à la fin de la saison alors que le test IFI, à base de l'antigène schizonte, s'est révélé le meilleur pour la détéction de la séroconversion chez les animaux immunisés par les schizontes de T. annulata attenués en culture cellulaire après la vaccination [8].
DÉVELOPPEMENT D UN TEST ELISA À BASE D UN ANTIGÈNE RECOMBINANT 565 FIGURE 1. Variation à l intérieur et entre les plaques ELISA à base de l antigène recombinant des pools de sérums témoins positifs et négatifs. Le test ELISA à base de l'antigène piroplasme brut de T. annulata pourrait davantage être amélioré grâce à l'utilisation d'une protéine recombinante spécifique de ce protozoaire. En effet, l'elisa à base d'antigène recombinant s'est révélé aussi spécifique et plus sensible que celui utilisant l'antigène brut. De plus, la production de l'antigène recombinant ne nécessite pas l'infection d'un animal et la standardisation du test pour chaque nouvelle préparation antigénique. Des quantités importantes et homogènes d'antigène recombinant peuvent être produites. Ce test est donc moins coûteux et plus pratique. Par ailleurs, les animaux sont exposés à des infections naturelles mixtes dues à différents parasites tels que Theileria, Babesia et Anaplasma. Ce test aurait l'avantage de permettre un dépistage plus spécifique de l'infection par T. annulata. L'intérêt pratique de ce test se justifie à plusieurs niveaux : - La détermination de la prévalence de l'infection dans les élevages est indispensable pour justifier la nécessité de la vaccination en fonction de l'état d'endémicité de l'infection. Le test permetterait la détection d'animaux séropositifs dans une région donnée et d'en déterminer la prévalence. - Ce test permetterait de déterminer l'incidence de l'infection en détectant le nombre d'animaux nouvellement infectés par saison de theilériose. Cette information contribuerait à l'évaluation de l'importance de la maladie et des pertes qu'elle engendre. - Dans le cas d'importation d'animaux d'un pays indemne, la vaccination contre cette maladie s'impose car ces animaux sont plus sensibles que les animaux de race locale. La protection par le vaccin vivant contre la theilériose nécessite l'établissement de l'infection chez l'animal hôte. L'analyse par ce test des sérums d'animaux vaccinés permetterait d'évaluer l'efficacité du vaccin en détectant les animaux séroconvertis. Au Maroc, un vaccin contre la theilériose a été mis au point. Il consiste en des cellules lymphoblastiques infectées par les schizontes de T. annulata atténués par des passages sur cultures cellulaires. De nombreuses investigations ont été effectuées depuis 1985. Elles ont concerné : l'innocuité et l'efficacité du vaccin, les lignées cellulaires vaccinales, la durée de l'immunité chez l'hôte bovin conférée par le vaccin, la différence de réceptivité entre les races des bovins vaccinés et l'effet sur la gestation [16]. Des campagnes de vaccination effectuées dans une région endémique pour la maladie (Doukkala) et intéressant les veaux de plus de deux mois ont permis la protection de 99-100 % d'animaux vaccinés [4]. D'une manière générale, les éleveurs sont en faveur de l'utilisation d'un vaccin qui ne serait pas coûteux et qui pourrait réduire leurs pertes [1]. En conclusion, les premières investigations ont révélé que ce test pourrait constituer un outil pratique dans le dépistage de la theilériose bovine lors des études épidémiologiques. Il est suffisamment sensible et spécifique pour la détection des anticorps chez les animaux infectés par T. annulata. Références 1. BOUSLIKHANE M. : Tropical theileriosis (Theileria annulata) in Morocco : Epidemiolgical and economic investigations. PhD, University of Reading, U.K., 1998. 2. BURRIDGE M.J. : Application of the indirect fluorescent antibody test in experimental East Coast fever (Theileria parva infection of cattle). Res. Vet. Sci., 1971, 12, 338-341.
566 EL HAJ (N.) ET COLLABORATEURS 3. BURRIDGE M.J. et KIMBER C.D. :The indirect fluorescent antibody test for experimental East Coast fever (Theileria parva infection of cattle). Evaluation of a cell culture schizonte antigen. Res, Vet. Sci., 1972, 13, 451-445 4. FLACH E.J. et OUHELLI H. : The epidemiology of tropical theileriosis (Theileria annulata infection in cattle) in an endemic area of Morocco. Veterinary Parasitolgy, 1992, 44, 51-65. 5. GREWAL A.S. et DOLAN T.T. : Research developments in diagnosis and control of bovine tropical theileriosis in India. Recent development in the research and control of Theileria annulata. Proceeding of a workshop held at ILRAD. Nairobi, Kenya, 17-19 September 1990, 41-45. 6. HOOGSTRAAL H. : African Ixodoidea, Volume I. Ticks of the Sudan (with special reference to Equatoria Province and with preleminary reviews of the genera Boophilus, Margaropus and Hyalomma). US Navy, Washington DC., 1956, pp : 1101. 7. KACHANI M., SPOONER R.L., RAE P., BELL-SAKYL L. et BROWN G.D. : Stage-specific respons following infection with Theileria annulata as evaluated using ELISA. Paraitology Research, 1992, 72, 43-47. 8. KACHANI M., FLACH E.J. WILLIAMSON S., OUHELLI H., EL HASNAOUI M. et SPOONER R.L. : The use of an enzyme-linked immunosorbent assay for tropical theileriosis research in Morocco. Preventive Veterinary Medecine, 1996, 26, 329-339 9. KACHANI M., OUHELLI H., BOUSLIKHANE M., EL HAS- NAOUI M., EL GUENNOUNI R. et SPOONER R. : Sero-epidemiological survey of tropical theileriosis in Morocco. Investigations on vaccination against theileriosis in Morocco.In : Tropical Animal Health and Production. Proceeding of Eurpean Union International Syposium on Ticks and Tick borne diseases, Xi'an, China 3-6 September 1996. Editor Hunter et al., 1997, 29, 54-55. 10. MELROSE T. et BROWN C. : Isoenzyme variation in piroplasmes isolated from bovine blood infected with Theileria parva and Theileria annulata. Res. Vet. Sci., 1975, 27, 379-381. 11. MUSOKE A.J., KATENDE J.M. TOYE P.G., SKILTN K.P., NENE V., MORZARIA S.P., UILENBERG (ed.), PERMIN A. et HANSON J.W. : Progress towards development of an antibody detection ELISA for the diagnosis of Theileria parva. Use of applicable biotechnological methods for diagnosing heamoparasites : Proceedings of the Expert Consultation, Merida, Mexico, 4-6 October, 1993, 1994, 174-181. 12. OUHELLI H. : Theilériose bovine à Theileria annulata (dschunkowsky & Luhs, 1904). Recherche sur la biologie des vecteurs (Hyalomma spp.) et sur les intéractions hôte-parasite, 1985, I.N.P. Toulouse. 13. OUHELLI H., INNES E.A., BROWN C.G.D., WALKER A.R., SIMPSON S.P. et SPOONER R.L. : The effect of dose and line on immunisation of cattle with lymphoblastoid cells infected lines with Theileria annulata. Vet. Parasit., 1989, 31, 217-228. 14. OUHELLI H. et FLACH E. : Epidemiology and control of theileriosis in Morocco. In : Recent developpments in the research and control of Theileria annulata. Proceedings of a workshop held at ILRAD, Nairobi, Kenya, 17-19 September 1990. Editor, Dolan, T.T., 1990, 19-20. 15. OUHELLI H., INNES E., BROWN C., WALKER A., SIMPSON S. et SPOONER R. : The effect of dose and line on immunisation of cattle with lymphoblastoïd lcells infected lines with Theileria annulata. Vet. Parasit., 1989, 31, 217-228. 16. OUHELLI H., KACHANI M., FLACH E., WILLIAMSON S., EL HASNAOUI M. et SPONNER R. : Investigations on vaccination against theileriosis in Morocco. In : Tropical Animal Health and Production. Proceeding of European Union International Symposium on Ticks and Tick borne diseases, Xi'an, China 3-6 September 1996. Editor Hunter et al., 1997, 29, 101. 17. LHOR K.F et ROSS J. P. J. : Improvement of the indirect fluorescent antibody test for the diagnossis of diseases caused by intra-erythroytic parasites. Zeitschrift fur Tropenmedizin und Parasitologie, 1969, 19, 427. 18. SCHINDLER R. et MEHLIZ D : Serologische untersuchungen bei der ''Theileria mutans'' infection des Rindes. Zeitschrift fur Tropenmedizin und Parasitologie, 1969, 20, 459. 19. SERGENT E., DONATIEN A., PARROT L. et LESTOQUARD N. : Études sur les piroplsamoses bovines. Ins. Pasteur d'algérie, Alger, 1945, 816 p. 20. SUNDAR N., BALASUNDARAM S., RAMADASS P. et ANADAN R. : Usefulness of enzyme linked immunosorbent assay for the diagnosis of Theileria annulata infection. Indian Journal of Animal sciences, 1993, 63, 1219-1221. 21. SHARMA C.S., CUPTA S.L. DHAR S. et MALHOTRA D.V. : Evaluation of Dot ELISA for diagnosis of bovine tropical theileriosis. Indian Journal of Veterinary Medecine, 1995, 15, 2, 58-60. 22. TAIT A. et HALL F.R. : Theileria annulata : control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 1990, 9, 387-403. 23. TOMA B., BENET J.J., DUFOUR B., ELOIT M., MOUTOU F. et SANAA M. : Glossaire d'épidémiologie animale. Editions du point vétérinaire, ISBN 2., 1991, p. 52. 24. THRUSFIELD M. Veterinary epidemiology. Department of Animal Health. Royal (Dick) School of Veterinary Studies. University of Edinburgh. Butterworth & Co. (publishers ) ltd, 1986, p. 179-184. 25. VOLLER A., BARLEU A. et BIDWELL D.E. : Enzyme immunoassays for parasite diseases. Trans. Rev. Trop. Med. Hyg., 1976, 70, 92-106.