L EXPRESSION DES GENES

Transcription

1 Denise Aragnol Instabilité du génome et cancérogenèse CNRS/Université de la Méditerranée L EXPRESSION DES GENES Chez les eucaryotes?

2 I-DEFINITION D EXPRESSION GENIQUE Expression génique : recouvre l ensemble des mécanismes qui conduisent à l apparition d un produit fonctionnel d un gène Produit fonctionnel: -Une protéine transcription + traduction -Un ARN transcription Exemples de «produit final fonctionnel» de type ARN: ARNt, ARNr, de nombreux (petits) ARN cytoplasmiques et nucléaires dont les fonctions sont encore inconnues traduction The RNA content of a cell. This scheme shows the types of RNA present in all organisms (eukaryotes, bacteria and archaea) and those categories found only in eukaryotic. The non-coding RNAs of archaea have not yet been fully characterized and it is not clear which types are present in addition to rrna and trna

3 II-LA TRANSCRIPTION LES ARN POLYMERASES EUCARYOTES -3 ARNpol différentes: ARN pol I, ARN Pol II, ARN Pol III compositions et fonctions différentes, structures similaires -multimériques (8 à 12 s. u.); >500kDa Functions of the three eukaryotic nuclear RNA polymerases Polymerase Genes transcribed RNA polymerase I (nucléole) RNA polymerase II RNA polymerase III 28S, 5.8S and 18S ribosomal RNA (rrna) genes Protein-coding genes; most small nuclear RNA (snrna) genes Genes for transfer RNAs (trna), 5S rrna, U6-snRNA, small nucleolar (sno) RNAs, small cytoplasmic (sc) RNA L ARNpol II eucaryote est constituée de plus de 10 sous-unités

4 RNA Pol II est la mieux connue; structure déterminée par cristallographie en 2001 Structure cristallographique de l ARN polymérase II.A. Enzyme libre à une résolution de 2,8 Å.L enzyme contient un sillon (Rpb1)bordé à son entrée par une paire de mâchoires, supérieure (partie de Rpb1 et Rpb9) et inférieure (Rbp5), et au fond duquel se trouvent deux ions Mg 2+ qui indiquent l emplacement du site actif. Près du site actif, l hélice de pontage (Rpb1) traverse le sillon pour rejoindre Rpb2. Le pore localisé à l arrière de l enzyme permettrait l entrée des rntp et la sortie de l extrémité 3 libre (Protein Data Bank Accession Code :1i50). B.Enzyme en élongation à une résolution de 3,3 Å.La pince formée de parties de Rbp1 et Rbp2 effectue une rotation de 30 qui maintient la matrice d ADN et le transcrit au sein du complexe transcriptionnel. L extrapolation du trajet probable des acides nucléiques au sein de l enzyme montre que l ADN double brin situé en aval fait contact avec la mâchoire inférieure puis passe entre le lobe de Rbp2 et une partie de la pince formée par Rbp1.Des flèches indiquent les sites d entrée et de sortie de l ADN (Protein Data Bank Accession Code :1i6H). Violet :mâchoire supérieure;rose :mâchoire inférieure;jaune :lobe;vert foncé :sillon;blanc :hélice de pontage;orange :site actif;vert pâle : pore;bleu :mur;rouge :pince;bleu pâle :ions Mg 2+(Protein Data Bank Accession Code :1i50).Bleu :brin matrice;vert :brin codant;rose :ARN. Le code de couleur des domaines de l enzyme est le même qu en (A)

5 La RNA pol II possède un domaine C terminal particulier, constitué de répétitions d un heptapeptide (tyr-ser-pro-thr-ser-proser) qui peut présenter différents niveaux de phosphorylation LES FACTEURS GENERAUX PIC: préinitiation complex

6 LES FACTEURS EN AMONT LES PROMOTEURS EUCARYOTES SONT COMPLEXES EXEMPLE DE PROMOTEURS RECONNUS PAR L ARN POL II Chez les eucaryotes le promoteur comprend toutes les séquences importantes pour l initiation de la transcription. Il est modulaire et complexe Promoteur basal: -TATAbox (-25) TATAWAW avec W=A ou T -Inr YYA(+1)NWYY avec Y=C ou T Eléments en amont: CAAT ou GC ou octamère (oct) En général les promoteurs eucaryotes ne contiennent pas l ensemble de ces éléments Les nombres et positions des éléments en amont sont variables

7 L ASSEMBLAGE DU COMPLEXE D INITIATION DE LA TRANSCRIPTION DEFINIT LE CHOIX DU BRIN MATRICE Les interactions entre l ARN Pol, les différents modules du promoteur et les différents facteurs protéiques du complexe d initiation de la transcription définissent le «start» de transcription et déterminent le choix du brin matrice 5 CAAT TATA 3 L ELONGATION PEUT COMMENCER 3 ATAT TAAC 5 5 CAAT TATA ATAT 3 TAAC 5 III-LA MATURATION -Addition de la coiffe en 5 The C-Terminal Domain (CTD) of RNA Polymerase II Coordinates Transcription and PremRNA ProcessingThe CTD consists of 52 repeats of the consensus heptapeptide Tyr-Ser-Pro- Thr-Ser-Pro-Ser and serves as a platform for the ordered assembly of the factors responsible for transcription, pre-mrna 5_ capping, splicing, and 3_ processing at different stages in the synthesis of the nascent transcript.

8 Capping of eukaryotic mrna. The top part of the diagram shows the capping reaction in outline. A GTP molecule (drawn as Gppp) reacts with the 5 end of the mrna to give a triphosphate linkage. In the second step of the process, the terminal G is methylated at nitrogen number 7. The bottom part of the diagram shows the chemical structure of the type 0 cap, with asterisks indicating the positions where additional methylations might occur to produce type 1 and type 2 cap structures. -L excision des introns et l épissage des exons commencent pendant l élongation

9 Structure of U1-snRNP. The mammalian U1-snRNP comprises the 165-nucleotide U1-RNA plus ten proteins. Three of these (U1-70K, U1-A and U1-C) are specific to this snrnp, the other seven are Sm proteins that are found in all the snrnps involved in splicing. The U1-RNA forms a base-paired structure as shown. The U1-70K and U1-A proteins attach to two of the major stem-loops of this base-paired structure, and U1-C attaches via a proteinprotein interaction. The Sm proteins attach to the Sm site. Based on Stark et al. (2001)

10 -L extrémité 3 de l ARN est obtenue par coupure endonucléasique suivie d une polyadénylation CPSF: Cleavage &polyadenylation specificity factor CstF: cleavage stimulation factor PAP: polya polymerase C A Schematic representation of the polyadenylation machinery. The majority of the components of the mammalian and yeast polyadenylation complexes are conserved, including all currently known factors that function in the transcription connection. For simplicity, only the mammalian nomenclature is depicted; the yeast names of factors that have important roles in the events described here are also indicated. (Note that although an apparent human homolog of Ssu72 exists, it has not yet been characterized functionally)., documented protein protein interactions that help link transcription and 3' processing (see text). Polyadenylation signal sequences (upstream AAUAAA, CA cleavage site consensus, and downstream G/U-rich region) are boxed. CPSF, cleavage-polyadenylation specificity factor; CstF, cleavage stimulation factor; CFI and CFII, cleavage factors I and II, respectively; PAP, poly(a) polymerase.

11 IV-LA TRADUCTION Elle a lieu dans le cytoplasme où les ARNm ont été exportés Chez les eucaryotes la petite s. u. du ribosome reconnaît et lie la coiffe Initiation of translation in eukaryotic cells Initiation factors eif-3, eif-1, and eif-1a bind to the 40S ribosomal subunit. The initiator methionyl trna is brought to the ribosome by eif-2 (complexed to GTP), and the mrna by eif-4e (which binds to the 5 cap), eif-4g (which binds to both eif-4e at the 5' cap and PABP at the 3' poly-a tail), eif-4a, and eif-4b. The ribosome then scans down the mrna to identify the first AUG initiation codon. Scanning requires energy and is accompanied by ATP hydrolysis. When the initiating AUG is identified, eif-5 triggers the hydrolysis of GTP bound to eif-2, followed by the release of eif-2 (complexed to GDP) and other initiation factors. The 60S ribosomal subunit then joins the 40S complex.

12 Elongation stage of translation The ribosome has three trna-binding sites, designated P (peptidyl), A (aminoacyl), and E (exit). The initiating N-formylmethionyl trna is positioned in the P site, leaving an empty A site. The second aminoacyl trna (e.g., alanyl trna) is then brought to the A site by EF-Tu (complexed with GTP). Following GTP hydrolysis, EF-Tu (complexed with GDP) leaves the ribosome, with alanyl trna inserted into the A site. A peptide bond is then formed, resulting in the transfer of methionine to the aminoacyl trna at the A site. The ribosome then moves three nucleotides along the mrna. This movement translocates the peptidyl (Met-Ala) trna to the P site and the uncharged trna to the E site, leaving an empty A site ready for addition of the next amino acid. Translocation is mediated by EF-G, coupled to GTP hydrolysis. The process, illustrated here for prokaryotic cells, is very similar in eukaryotes. (Table 7.1 gives the names of the eukaryotic elongation factors.)

13 V-L EXPRESSION EST REGULEE Toutes les étapes de l expression génique sont régulées nucleus *Nuclear export cytoplasm a more accurate outline of the events involved in genome expression, especially in higher organisms. Note that these schemes apply only to protein-coding genes. Those genes that give rise to non-coding RNAs are transcribed and processed as shown but the RNAs are not translated.

14 La régulation transcriptionnelle cytoplasme noyau cytoplasme noyau

15 La chromatine: C est la structure macromoléculaire ADN-protéine présente dans le noyau des cellules eucaryotes. Elle constitue un contexte transcriptionnel répressif -Le nucléosome 147 pb d ADN sont enroulés autour de l octamere d histone, formant deux tours 25A en ,8A en 1997

16 2m d ADN dans un noyau de 10μm de diamètre

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19 D autres exemples de niveaux de régulation potentiels Schematic of mrna export and alternate mrna fates in the cytoplasm. Export through the NPC requires export adaptors and receptors as well as Dbp5p. Some mrnas are exported 5' end first and are immediately engaged by ribosomes (A), whereas others may be exported by a non-5'-endfirst mechanism (B). Once in the cytoplasm, some mrnps are stored in a translationally silent state (C), and others are transported to specific subcellular locations along the cytoskeleton (D). Movement of RNA-containing granules in dendrites of cultured neurons. a k Time-lapse images, taken 20 s apart, of an anterograde-moving granule (arrow). The granule is detected by visualization of fluorescent SYTO-14, which binds to RNA. The granule moves more than 5 m, with an average velocity of 0.04 m s-1. This movement was stimulated by depolarization