Utilisation du microscope multi photonique ZEISS

Transcription

1 Instruction Utilisation du microscope multi photonique ZEISS I_PHIV_MICw_0003 A 19/11/07 Objet Destinataire (s) Responsables Trame informatique Description et mode de fonctionnement du microscope Zeiss Axiovert 200M LSM 510 Meta NLO. Ce système est composé de deux statifs, un droit et un inverséet d un laser femtoseconde Chameleon Ultra II COHERENT MRI users RESP MRI CRBM Historique des modifications Auteur Numéro de version Date de modification Modifications CONEJERO LAUTREDOU A 19/11/07 CONEJERO Geneviève conejero@supagro.inra.fr Rédacteur Vérificateur Approbateur Conejero / Lautredou De Rossi Verdeil 1

2 Sommaire : page Consignes générales 3 Mise en route du système 5 Etapes principales d une acquisition 8 I/ Démarrage du logiciel LSM510 9 II/Utilisation du microscope 10 III/Allumage du laser 12 IV/Choisir une configuration Mode classique 13 Mode Non DeScanned (NDD) 16 Recherche optimum λ excitation 17 V/ Scan d une image 20 VI/Faire un Z-Stack 26 VII/Pour faire une nouvelle acquisition 30 VIII/Icônes de la fenêtre Images 31 IX/ Contrôle de la platine motorisée (stage) 36 X/ Time Lapse 37 XI/ Module META: déconvolution spectrale 38 XII/ Process (filtres, contrast, unmix ) 40 XIII/ Exportation et sauvegarde des images 42 XIV/ MultiPrint 43 XV/ Eteindre le système 44 TroubleShootings 45 2

3 Consignes générales -La réservation du multiphoton, pour les utilisateurs inscrits à MRI, se fait sur le site -Pour les 1ères utilisations, prévenir Geneviève Conéjéro ou Jean-Luc Verdeil au préalable Le temps de refroidissement entre 2 allumages de la lampe HBO est de 1 heure minimum. (La durée de vie de la lampe HBO est d environ 300h) Donc vérifier qu un autre utilisateur n est pas inscrit après vous avant d éteindre mais vérifier qu il va bien venir pour ne pas laisser la lampe allumée toute la nuit. - Nettoyer soigneusement l huile (très corrosive) sur les objectifs et la platine (avec mouchoirs en papier, sinon avec avec éther 95%, alcool isopropylique 5%) Attention, les objectifs 40x et 63x sont à eau (flacon W), l objectif 100 x est un objectif à huile (flacon F), le 25x est multi-immersion (eau, glycérol ou huile, à régler avec la bague sur l objectif) Nettoyer également les oculaires - Si ça ne va pas, n hésitez pas à demander de l aide, nous sommes là pour ça, ne perdez pas trop de votre temps et ne tripoter pas tous les boutons 3

4 SECURITE LASER - Vous utilisez un laser pulsé infra rouge de classe IV d une puissance maximal de 3,5 W. - Ce laser émet dans l infra rouge (entre 690 et 1100 nm). Il n est pas visible à l œil mais très dangereux du fait de sa puissance élevée. - Ce laser est toujours dangereux pour l'oeil même après réflexion ou diffusion sur un objet même a priori non réfléchissant, il peut aussi enflammer le carton et le papier. Il est nécessaire de respecter les consignes élémentaires de sécurité, rester vigilant. 1. Ne pas insérer d'objets réfléchissant dans le chemin du laser (ne porter ni bague, ni montre lorsque vous manipulez vos préparation au dessus des objectifs). 2. Avant une acquisition, s'assurer que les échantillons sont en place sans objet suplémentaire. 3. Ne pas mettre sa lame au ras du faisceau pour vérifier où se situe le laser. 4. Ne jamais regarder le faisceau directement en sortie d objectif. 5. Ne pas débrancher les fibres, ne pas toucher au laser de manière général. 6. Appeler un responsable si vous avez le moindre doute. 4

5 Mise en route du système 1/Allumer le système de refroidissement du laser pulsé (derrière la table) en appuyant sur le bouton RUN (en semaine, ce système reste sur RUN, mettre en standby le vendredi soir) Attendre que la température affichée sur l écran soit de 20 C environ. 2/Mettre le laser en marche,en tournant la clé sur ON 5

6 3/Allumer le microscope avec l interrupteur général sur la table (bouton «components» à droite) NB: le bouton de gauche (system PC) doit rester sur ON 4/Allumer la lampe HBO, boîtier sur l étagère 6

7 5/ Se connecter au réseau MRI Clique sur OK dans la fenêtre personnelle MRI Sinon vous serez automatiquement déconnecté 7

8 Les étapes principales d une acquisition - Allumer le laser pulsé infra rouge Chameleon - Choisir une configuration - Cliquer sur new pour ouvrir une nouvelle fenêtre image - Cliquer sur find (si c est la première image) ou fast (pour les images suivantes) - Faire un crop (icône dans la barre d outils de l image, doit être en xy et pas split xy) -Puis si nécessaire, fast xy pour choisir le meilleur plan focal puis cliquer sur STOP Dans la fenêtre acquire et mode - Choisir la résolution (option optimale) ou 1024 pour une bonne qualité d image - la vitesse : scan speed 6 ou plus mais la durée du scan augmente en conséquence, plus le scan est lent, meilleure est la qualité de l image. -scanaverage:faire la moyenne entre plusieurs scans; choisir le mode line et la méthode mean puis le nombre de scan à moyenner (au minimum 2), attention la durée de l acquisition augmente en conséquence - Cliquer sur single, pour obtenir la première image Dans la fenêtre acquire et channels - régler le pinhole: totalement ouvert (max) - cliquer sur la palette dans la barre d outils de l image et choisir range indicator, les pixels sont codés en bleu, rouge et gris, selon leur intensité. - excitation : régler la puissance laser (diminuer s il y a des pixels rouges) (travailler avec un laser <10% si possible pour limiter le photobleaching) - Detector gain/amplificator offset : diminuer le gain pour moins de rouge, augmenter le gain s il n y a pas de pixels rouges dans l image. diminuer l offset si l image est toute noire, augmenter l offset s il y a trop de bleu. Remarque : la configuration : il faut parfois tester différentes configurations, les PMT ne sont pas les mêmes, parfois la qualité de l image est meilleure dans un canal par rapport à l autre. Pour faire une nouvelle image, d une autre cellule, n oublier pas d enlever le crop et le Z-stack éventuellement 8

9 I. Démarrer le logiciel LSM 510 Meta : Attention : si l icône use existing images est sélectionnée, vous pouvez travailler uniquement sur des images de la base de donnée mais vous ne pouvez pas acquérir de nouvelle image, le logiciel n entre pas en contact avec le microscope (vous n entendez pas le cliquetis des miroirs en cliquant sur VIS ou LSM). Le logiciel s ouvre sur la barre d outil : File New : créez votre base de données Open : ouvrir une base existante Tout doit être enregistré sur le disque D (data) 9

10 II. Utilisation du microscope (Vous pouvez également consulter le manuel du microscope Zeiss) Pour travailler, passer sur la Barre d outil : acquire cliquer sur l œil VIS pour que la lumière passe vers les oculaires 1. Travailler directement sur le microscope Changement des objectifs (De préférence utiliser la fenêtre Micro sur l ordi (moins de risque)) Allumer fluo halogène Intensité de la lampe halogène Changements des filtres La platine est motorisée Déplacement x,y Déplacement précis en x ou y (appuyer sur les touches jaunes pour changer) 2. Ou ouvrir la fenêtre Micro objectifs Lumière transmise Filtres de fluorescence -Dapi (Fset01) -GFP (Fset09) -RFP (Fset15) Shutter de fluorescence 10

11 Le Focus Affichage de la position sur l écran LCD Vis micrométrique (déplacement précis) Vis macrométrique (rapide) «work button» - 1 pression: remet l objectif en focus après avoir utilisé le bouton load - Pression > 2sec : fixe la position du focus maximum, si vous dépasser ça bip. Pour relever cette position, rester appuyer sur le bouton et tourner la vis micrométrique en même temps vers une position plus élevée. «Load button» descend les objectifs à la position la plus basse : pour changer de lame Les filtres Le trait Indique le filtre enclenché Fse 01 : Ex BP 365/12 ; Em LP 397 (pour DAPI) Fse 09 : Ex BP ; Em LP 515 (pour vert) Fse 15 : Ex BP 546/12 ; Em LP 590 (pour rouge) Filtres neutres : Position 2 : 0.06 NF 16 (divise l intensité lumineuse par 16) Position 1 :0.25 NF 4 (divise l intensité lumineuse de 4) Position 3 : pas de filtre (position normale) Il faut tirer la barrette pour mettre un filtre neutre (si la fluorescence observée est trop forte, souvent le cas du DAPI) Attention : si vous l utiliser, ne pas oublier de l enlever sinon le suivant risque de ne pas voir la fluorescence de son échantillon 11

12 III. Allumer le laser infra rouge Activer le laser infra rouge Chameleon Pour. modifier la longueur d onde, cliquer sur modify, taper la valeur souhaitée et faire ENTER NE PAS CLIQUER SUR STORE - Les autres lasers sont utilisés en mode confocal Voir notice d utilisation du confocal 12

13 IV. Choisir une configuration Théorie : La lumière émise par l échantillon doit être -séparée en fonction de sa longueur d onde (miroir dichroïque) -filtrée - et détectée par un PMT (photomultiplicateur) Sur ce système il y a 2 modes d acquisition 1/ Mode classique (LSM 510) -3 miroirs dichroïques (HFT ou NFT) prisme F Lumière transmise - 2 filtres d émission (BP ou LP) + 1 prisme dans le canal META (ChS) - 2 détecteurs Ch2, Ch3 + 1 détecteur META sur le canal ChS + 1 détecteur spécifique pour la lumière transmis En biphoton, utiliser les miroirs HFT KP et NFT KP HFT= miroir principal NFT= miroir secondaire 13

14 . Avec une couleur : mode single track -1 ère possibilité : utilisation des configurations pré-enregistrées Cliquer sur config, choisir sa configuration et cliquer sur «apply» -2 ème possibilité : utilisation de la fonction «Reuse» à partir d une image précédente La fonction Reuse rétablit le trajet optique utilisé lors d une acquisition précédente, laser, Miroirs, filtres, gain, pinhole, mais non l objectif. 14

15 -3 ème possibilité : réglage manuel il est possible de cliquer sur chaque miroir dichroïque et chaque filtre Cocher un canal pour l activer (ici c est le canal 2) Filtres : choisir un BP pour filtrer la lumière entre deux longueurs d onde ou un LP,qui laisse passer toute la lumière au dessus de la valeur indiquée - miroir si on utilise les canaux 2 et 3 - plate si on n utilise que le canal ChS Cocher le bon laser Ce miroir réfléchi la lumière vers la lame donc il doit contenir les longueurs d onde des lasers utilisés pour l excitation (KP 700 réfléchit ce qui est supérieur à 700 sur l échantillon et laisse passer la fluorescence émise, ce qui est inférieur à 700. Pour le canal META (ChS) Il n y a pas de filtres mais un réseau séparateur, il faut donc délimiter les longueurs d onde à filtrer. Activer un des 8 canaux Puis cliquer sur ChS La fenêtre de settings s ouvre Délimitez les longueurs d onde à récolter avec les curseurs (intervalle de 10nm) 15

16 2/ Mode Non Descanned La fluorescence émise par l échantillon est collectée directement par un détecteur externe (NDD KP685), sans repasser par la tête de balayage (d où le nom de non descanné). Des filtres (bleu, vert et rouge) sont disponibles sur ce détecteur. Ce mode de détection est utilisé surtout lorsque le signal émis est faible. L utilisation de ce détecteur ne permet pas de faire une acquisition en mode spectral (lambda). Filtres En cas de lumière parasite, mettre un cache noir sur la platine et fermer le shutter sous la lampe HBO 16

17 Recherche optimum λ excitation En microscopie biphoton, les λ d excitation sont différents des valeurs connues en mode confocal (environ le double, souvent moins) Quelque soit le mode de détection choisi, il est possible de rechercher au prélable la longueur d onde optimale d excitation avec une macro nommée LambdaScan MACRO Lambda Scan Sélectionner les λ min et max, puis le pas START Ne pas toucher au mode de calibration de l AOM 17

18 . Plusieurs couleurs : mode «multi-track» Qu est ce que le cross-talk? Recouvrement des deux spectres d émission Les deux fluorochromes doivent être excités séparément ; sinon la lumière verte du spectre Em1 apparaît rouge dans le canal2 et se confond avec le deuxième fluorochrome En pratique si vous avez du vert et du rouge, ce qui est le plus fréquent, il est conseille d essayer trois config sur un même échantillon pour choisir la mieux adaptée : - Vert Ch2 et rouge Ch3 - Vert Ch3 et rouge META - Vert Meta et rouge META,. Un conseil pour régler le focus en Z-stack en mode fast, décliquer un des deux canaux, c est plus rapide. 18

19 - réglage manuel il est possible de cliquer sur chaque miroir dichroïque et chaque filtre 1. Cliquer sur multitrack 2. Choisir line ou frame -line, facilite les réglages et pour les cellules vivantes, - frame lorsqu il faut changer les miroirs et les filtres entre les 2 tracks 3. Régler les filtres et les miroirs pour ce canal ou appliquer une configuration store/apply single track 4. Cliquer sur add track et faire les réglages pour le deuxième fluorochrome Vous pouvez donner un nom au canal (ici rhodamine) Si vous décliquer le canal, le scan se fait uniquement sur les autres couleurs (utile en cas de fluorochrome très fragile, vous pouvez faire les premiers réglages avec une seule couleur puis remettre l autre au dernier moment) Il est préférable de régler les canaux l un après l autre, pour le gain, l offset, etc, en déselectionnant un canal puis l autre. 19

20 V. Scan d une image 1. Utiliser les fonctions find ou fastxy Le scan se fait en mode frame pour une image, sinon scan un point (spot) ou une ligne (line) Faire new sinon vous risquez d écraser l image précédente «Find» pour un premier réglage automatique Conseillé pour la première image Attention ça marche pas toujours très bien surtout avec plusieurs couleurs, si vous ne voyez rien dans un canal augmenter le gain du détecteur dans la fenêtre channels «Fast» acquisition rapide en continue Attention faire STOP pour arrêter l acquisition, permet de déplacer, mettre au point, régler le Z Attention si vous ne voyez rien: regarder dans la fenêtre channels -vérifier que le détecteur (detector gain) n est pas trop bas. - mais ne pas commencer avec les détecteurs à fond, la saturation les abîme. 2. Sélectionner la zone d intérêt avec la fonction crop Élargir/rétrécir La longueur Élargir/rétrécir La largeur tourner agrandir Dans la fenêtre image, utiliser la fonction Crop pour sélectionner la zone d intérêt Attention si vous avez plusieurs couleurs, il faut que les canaux soient superposés, L icône xy doit être sélectionnée, et pas split xy sinon la fonction crop n est pas disponible 1. Tourner la zone de sélection 2. choisir la résolution (cliquer sur optimal) 3. Transformer le carré en rectangle, la ligne bleu doit toujours être dans le sens de la longueur 20

21 3. Dans la fenêtre mode : - Choisir la résolution, l option optimal permet de calculer automatiquement la meilleure résolution par rapport à l objectif et au zoom utilisé. Rem : Line step : 1, scan toutes les lignes, sinon scan une ligne sur n (fast scan) -La vitesse de scan : plus le scan est lent plus la qualité est bonne mais plus le photobleaching est important Vitesse conseillée : scan speed 6 ou 5 à 10 sec/scan - Mode: line; scan plusieurs fois la même ligne (mieux pour les cellules vivantes) frame; permet d observer l amélioration de l image. - Méthode : mean; fait la moyenne des différents passages - nombre de répétition: le laser passe plusieurs fois sur 8 bit: 256 valeurs de gris l échantillon, permet d améliorer l image (au moins 2) 12 bit: 4096 valeurs de gris (mieux pour les mesures d intensité de fluo (FRAP par exemple) mais image beaucoup plus grosse) Zoom, rotation, permet de visualiser le zoom et la rotation, possibilité de déplacer le crop soit en cliquant sur le carré soit avec les curseurs de l offset Permet parfois de rattraper une cellule qui bouge en timelapse Chercher le meilleur plan Fast xy, tourner la vis micrométrique ou avec Z dans la fenêtre STAGE, puis STOP lorsque vous avez le plan choisi. 21

22 Faire la première image : Attention si vous voyez ces icônes vous êtes en mode z-stack single Équivalent à un single Équivalent à un continu 4. Affiner les réglages dynamiques de l image: la palette Range indicator Avant réglage Le rouge correspond à une saturation des détecteurs Le bleu correspond à une limite de détection trop haute, cela signifie que vous perdrez de l information pour les structures faiblement fluorescentes Limite de détection trop haute Perte d information fond bleu fond moucheté bleu Bruit de fond 22

23 Pour faire les réglages Passer en mode continu, Attention, les réglages ne sont valables que pour une vitesse de scan Attention s il y a plusieurs couleurs vous devez être en mode split xy Cliquer sur channels Sélectionner le canal à régler s il y a plusieurs couleurs Pinhole totalement ouvert (cliquer sur Max) S il y a du rouge - Baisser le laser puis - baisser le détecteur, en cliquant sur le curseur, pour un contrôle plus fin : ctrl et clic souris S il y a du bleu, monter l amplificateur, si c est tout noir, diminuer l amplificateur Avant réglage Après réglage Il reste quelques points rouge Il peut rester moitié bleu, moitié noir 23

24 5. Enregistrer l image Donner un nom à l image Noter les caractéristiques de l échantillon et vos remarques (enregistrées avec l image et visible dans la base de donnée) Vérifier que vous enregistrez dans votre base de donnée, elle apparaît en premier dans la liste si elle est ouverte Cliquer sur OK, votre image apparaît dans la base de donnée en dernière position. La base de donnée Affichage mode Galerie Toutes les images apparaissent sous forme d imagettes avec : leur noms la résolution et le nombre d image dans la pile Pour ouvrir une image: - double clic sur l imagette - ou cliquer sur Load Affichage mode Form Chaque image apparaît séparément On voit sa position dans la galerie (ici image 12 / 24) Change d image avec le curseur On trouve ensuite son nom et la description, on peut ajouter des commentaires directement dans la base de données On trouve ensuite un ensemble de paramètres relatifs à l acquisition, enregistrés avec l image (objectifs, puissance laser, pinhole ) Remarque : on peut glisser une image d une base de données à l autre. 24

25 Utilisation des ROI (Region of Interest) Le scan peut être limité à une région d intérêt de l image Dessiner avec les outils la ou les ROI sur l image La ROI doit être enregistrée, cliquer sur add to list car elle n est pas enregistrée automatiquement avec l image, (c est important pour le FRAP surtout, sinon vous ne pouvez pas la récupérer par la suite pour faire les analyses) Sélectionner le mode scan: Use ROI, seul la ROI sera scannée Use ROI permet de diminuer le temps de scan et de visualiser uniquement la zone d intérêt 25

26 VI. Faire un Z-Stack 1. Cliquer sur Z-stack 2. Cliquer sur Mark First/Last 3. Faire fast XY 4. Se placer en haut de la cellule et cliquer sur mark first 5. Descendre à l autre extrémité de la cellule et cliquer sur mark last 6. Cliquer sur STOP Le nombre de coupes (Num Slices) est calculé automatiquement en fonction de l intervalle ici : 13 coupes, tous les 0.44 µm L intervalle optimal est d environ 0.45 µm Sinon cliquer sur Z-slice Reff. Corr: Correction de la différence d indice de réfraction R= n (indice milieu immersion) n (indice de l échantillon) Auto Z Corr: correction linéaire des valeurs de détection entre deux images de la pile (si la fluo est plus forte au début ou à la fin de la pile) L ordinateur donne automatiquement - l intervalle optimal et -le pinhole optimal pour que toutes les couleurs aient la même épaisseur de coupe Attention si vous changer le pinhole vous devez modifier les réglages du détecteur et de l offset (car il y a plus de lumière collectée avec l ouverture du pinhole) pour cela cliquer sur move to mid puis XY cont, mettre la palette range indicator et réajuster le détecteur et l amplificateur. 7. Cliquer sur move mid pour vérifier que les réglages sont OK avant de lancer le stack Vous pouvez également cliquer sur move first et move last pour vérifier que vous avez bien délimité la bonne zone à scanner (parfois sur les cellules vivantes ça bouge) 8. Cliquer sur Start 26

27 Observation du stack - Aller dans 3D View et projection si vous cliquer sur l onglet toutes les piles d images s affichent, vérifier que vous êtes sur la bonne image -Vous pouvez choisir l axe autour duquel se fait l animation, en principe axe y - Vous pouvez choisir le nombre de projection 1 pour aplatir l image sinon ça dépend de l angle, plus il y a de projection plus l image est grosse mais l animation est moins saccadée. Le mieux c est de déplacer les projections sur le schéma avec la souris, avec ¼ de rotation c est pas mal. Prévisualisation de l animation Permet de faire une animation à 360 On peut également jouer sur la transparence Mais le mode maximum donne souvent de meilleurs résultats - Cliquer sur apply 27

28 La projection s affiche dans une nouvelle fenêtre Slice permet de faire bouger l animation manuellement avec le curseur Anim: permet de lancer le film La position dans le stack défile ici On peut modifier la position du début et de fin de l animation Mode aller-retour Mode aller simple Vitesse de l animation Pour pouvoir utiliser le film dans un autre logiciel On peut exporter le film en.avi mais dans ce cas on a uniquement le mode aller simple donc ça marche pour les animation panoramique 360 et pour les timelapse Pour exporter une animation en mode aller-retour, il faut la faire dans le logiciel 3D (cf p. suivante) Ou dans un autre logiciel comme ImageJ (logiciel d imagerie gratuit) ou Volocity (MRI) Télécharger le logiciel ImageJ et le plugin LSM reader (indispensable pour ouvrir le format lsm) 28

29 - Logiciel 3D Zeiss : (ce logiciel est disponible uniquement sur le biphoton ou le PC dans le labo 36) Zoomer dans l image Ajouter des ombres Transparence pour les projections Tourne autour de l axe x Effet de surface Réglage du contraste Réglage de la qualité Tourne autour de l axe y Pour faire pivoter l image Remettre en position 0 Cliquer sur series pour faire une animation Équivalent à ce que fait le logiciel de projection Permet de définir la position de départ et celle d arrivée, puis défini le nombre de vue entre ces deux positions Permet de faire des films plus complexe, en définissant plusieurs positions intermédiaires 29

30 VII. pour faire une nouvelle acquisition Cliquer sur New pour ouvrir une nouvelle fenêtre d acquisition, sinon vous allez écraser l acquisition précédent si elle n est pas enregistrée 1. Remettre la résolution (frame size) à cliquer sur reset pour remettre le zoom à 1 et la rotation à 0 3. Cliquer sur Z stack pour revenir dans le mode d acquisition d un seul plan 4. remettre le pinhole sur Max s il a été changé (dans channels) Rem : Vous n êtes pas obliger d enlever le Z-stack XY scan correspond à la fonction single XY cont à la fonction continue Scan en XZ Normalement les réglages du laser, du détecteur et de l amplificateur sont à peu près les mêmes d une cellule à l autre dans un même échantillon, donc pas besoin de refaire find mais faite plutôt un single directement Et vérifier avec la palette range indicator que les réglages sont OK 30

31 VIII. Icones de la fenêtre image - Couleurs et canaux Permet de changer la couleur d un canal ou de l éteindre Pour définir d autres couleurs cliquer sur la palette puis add - Zoom Ajustement automatique lorsque vous étirez le cadre avec la souris Revenir à la taille standard Agrandir l image Rétrécir l image On peut également changer le zoom avec ce curseur 31

32 - Split et slice xy: permet de superposer les différents canaux Split xy: permet de séparer les différents canaux Slice: Permet de se déplacer dans le z-stack ou dans un timelapse La position dans la pile est indiquée en bas 10/20 ici - Contraste et luminosité Permet de faire un réglage du contraste et de la luminosité sur chaque canal Plus de possibilités avec more 32

33 -galerie Data: Fait apparaître sur l image la position en Z dans un Z-stack ou le temps dans un timelapse Permet d enlever des images au début ou à la fin de la pile, en cas de problème de bruit de fond sur les première images p.e. ou pour extraire une plage d intérêt. - Annotations, mesures et échelle Permet de dessiner sur l image Permet de mettre l échelle Permet de mesurer des distances et surfaces Cliquer sur la règle puis choisir un outil de dessin (trait, rectangle ) Permet d extraire une zone d intérêt Change la couleur des dessins insérés Permet de faire plusieurs dessins de suite, sinon retour automatique à l outil sélection 33

34 -profile Marche sur un plan ou sur un Z-stack reconstitué On trace une ligne ou une courbe Le logiciel trace le graphique de l intensité de fluorescence, le long de la ligne définie - Fonction de colocalisation Cliquer sur l icône histo Marche sur un plan ou sur un Z-stack reconstitué Pour chaque pixel de l image, le logiciel mesure l intensité de fluo verte (donne la position en x) et l intensité de fluo rouge (donne la position en y) et trace le diagramme de colocalisation : pixels dans canal 1 uniquement 2: pixels dans canal 2 uniquement 3: pixels qui colocalisent, ils ont autant de vert que de rouge 4: bruit fond Cliquer sur colocalisation pour avoir le graphique Cliquer là pour avoir l image Permet de délimiter les zones en déplaçant la croix sur le graphique avec la souris Choix des couleurs Ici: les pixels de la région 3 (coloc) apparaissent en blanc Peut tracer une ROI sur le graphique ou sur la photo seuls les pixels de la ROI sont alors visibles 34

35 -Ortho Permet de visualiser un stack dans les plans xz et yz Coupe en xz (sur la ligne verte) Plan xy Au niveau de la ligne bleue Coupe en yz (selon la ligne rouge) Mesure de distance en 3D -Cut Permet d observer une coupe dans n importe quel orientation dans un stack Permet de positionner la coupe Visualisation graphique de la position de la coupe 35

36 IX. Stage : contrôle de la platine motorisée Contrôle du focus, cliquer au lieu de tourner la vis micrométrique sur le microscope Détermine le pas entre 2 clics (clic sur le curseur: + 1 µm Ctrl clic: µm Shift et clic: + 10 µm) Contrôle du déplacement en xy au lieu d utiliser le joystick Détermine le pas entre 2 clics Permet de marquer le position d une cellule Elle apparaît sur le graphique et ses coordonnées sont enregistrées On choisit ensuite le numéro de la cellule qu on souhaite revoir Et on clique sur move to Permet de diviser l échantillon en carrés (tile) de 1x1 à 15x15 Permet de scanner un champs d observation très large en cliquant sur move to puis start (fonction mosaïque) 36

37 X. timelapse Start series : en manuel : lorsque vous cliquez sur StartT Stop series: manuel: définit le nombre de timepoints time: définit au bout de combien de temps arrêter la manip (mais dans ce cas il est possible de poursuivre la manip à la fin du temps en définissant un nouveau temps) Cycle delay: définit le temps entre chaque timepoint Vous pouvez enregistrer 6 temps, cliquer sur une case, mettre un nombre dans time (ici 1), faire enter, puis choisissez l unité. Cliquer sur la case à côté pour programmer un autre temps. Pendant le timelapse vous pouvez changer le délai en cliquant sur une des 6 cases. Marker: permet de mettre une marque dans l image Par exemple pour l ajout d une drogue, noter dans description une remarque et cliquer sur set lorsque vous ajouter la drogue, le logiciel enregistre le temps Noter la description Vous pouvez donner un nom, cliquer sur store pour enregistrer vos marqueurs si vous voulez les utiliser pour une autre manip Rem: cycle delay : intervalle entre la fin d un scan et le début du suivant time interval: intervalle entre le début de chaque scan Si vous voulez l un ou l autre il faut le changer dans Options, settings et time series control 37

38 XI. Module META, déconvolution spectrale Permet de tracer le spectre d émission d un fluorochrome et de séparer les couleurs de chaque pic, Pour les problèmes de cross talk, de FRET et de fluorochrome à plusieurs pics d émission Cliquer sur Lambda Mode Délimiter l étendue du spectre à mesurer Sélectionner le miroir dichroïque nécessaire Activer le laser selon le maximum d excitation du fluorochrome Ici exemple d un fluorochrome qui change de couleur selon son état Cliquer sur Single comme pour une image classique, une image est prise tous les 11 nm Les réglages se font de la même façon qu une image classique (grâce à la palette, range indicator, réglage de la puissance laser, du gain et de l amplification du détecteur, faire les réglages à la longueur d onde d émission max) Affichage des lambda de chaque image 38

39 Pour analyser l image, cliquer sur λ coded, l image apparaît en couleur réelle Cliquer sur mean, délimiter une ROI sur l image qui contient les différentes couleurs, le spectre apparaît automatiquement. Pour ajouter un canal Assigner un pic à un canal Puis cliquer sur extract channels, les 2 canaux sont séparés automatiquement Vous obtenez une nouvelle image Et là vous êtes sûr que les deux couleurs sont bien séparées par rapport à l utilisation des filtres d émission classiques. 39

40 XII. Process Traitement des images après l acquisition - Add: pour additionner deux images en une nouvelle image - Subtract - Multiply -Ratio - Copy: permet à un canal d une image d être copier dans une nouvelle image - Filter: applique un filtre à l image Lowpass filter, la fluo d un pixel est remplacé par la valeur moyenne des pixels voisins, réduit bruit fond Sharpness filter Median filter, la fluo d un pixel est remplacé par la valeur médiane des pixels voisins, réduit bruit fond -Contrast -Interpolate:changement du contrast/luminosité dans un stack, permet de compenser le bleaching au court de l acquisition d un stack -Channel shift: - Unmix: permet de réaliser une déconvolution spectrale à partir de spectres -de références préenregistrés 40

41 Déconvolution spectrale avec la fonction unmix Cliquer sur Process puis sur Unmix Sélectionner au moins 2 spectres de référence en cliquant sur ces boutons pour ouvrir la Spectra Database Generate Channel with residuals permet de visualiser la fluorescence non attribuée à un spectre Advanced Linear Unmixing augmente le nombre d itérations et améliore le résultat 41

42 XIII. Exportations des images Les images sont en format lsm, elles sont lisibles uniquement par le logiciel lsm Vous pouvez télécharger le logiciel de visualisation LSM Image Browser (pour PC) Sur le site zeiss (dans téléchargements et logiciels imagerie) Ensuite vous devez exporter les images en format.tiff,.jpeg ou.avi pour vous en servir dans d autres logiciels Dans le logiciel LSM image browser Ou directement sur le biphoton : Plusieurs choix: Raw data : données brutes avec tous les canaux (exportation avec la meilleure résolution) Content of image: exporte ce qui est visible à l écran (y compris échelle et éléments de dessins) donc soit le split soit la superposition xy Full resolution: idem que content of image mais à résolution max series: exporte toute la pile, image par image, pensez à l exporter dans un nouveau dossier Les timelapse peuvent être exporter en.avi directement ; mais pour les animations de stack, il faut faire une animation dans le logiciel 3D, sinon l animation ne fait pas un aller-retour (de préférence, utiliser le logiciel Volocity disponible au laboratoire) Sauvegarde de votre travail L ordinateur du biphotonn est pas un lieu de stockage, donc vous devez récupérer vos données (gravez un CD ou avec une clé USB) et les conserver chez vous. Pensez à supprimer régulièrement les données sauvegardées de l ordinateur du microscope afin que tous le monde puisse continuer à faire ses acquisitions dans de bonnes conditions. 42

43 XIV. Multi-print Permet de regrouper des résultats sur une même page pour imprimer sans changer de format (sinon on doit exporter les images en.tiff et faire un montage powerpoint ou photoshop). Très pratique pour présenter un résumé de ses résultats en réunion labo. Dans le logiciel LSM 510 Dans le logiciel LSM Image browser Ouvrir une image Cliquer sur copy Puis sur paste dans la fenêtre print Imprimer (affiche l imprimante par défaut) Permet d agrandir la taille de l image dans la planche Vous pouvez ajouter des annotations, flèches.. Par contre vous ne pouvez pas enregistrer la planche mais juste l imprimer 43

44 XV. Eteindre le système - Vérifier que quelqu un n a pas réservé le biphoton après vous. Si quelqu un d autre vient, vérifiez qu il a toujours l intention de le faire. Le soir, éteindre la lampe HBO et les lasers - Désactiver le laser Chameleon, cliquer sur off - Jeter les lames de microscope dans le petit container jaune dans la salle de préparation - Nettoyer les objectifs - Quitter le programme: fermer toutes les fenêtres et cliquer sur exit --Mettre le laser Chameleon en stand by (clé sur générateur) -Laisser le système de refroidissement du laser sur RUN -IMPORTANT: Se déconnecter de MRI - Couper l interrupteur général (sur la table) Attention : Ne stocker pas trop de données sur l ordinateur, sauvegarder vos images régulièrement et supprimer les données sauvegardées du biphoton. 44

45 Troubleshooting 1. Je ne vois rien aux oculaires - la touche VIS est sélectionnée - la lampe HBO est allumée et il y a un filtre dans le réflecteur - il n y a pas de filtre neutre enclenchés (barrette enfoncée en position3) - l analyseur n est pas mis la barrette doit être enfoncée -- le logiciel a bien démarré en mode scan new image - le microscope est allumé, (vérifier l interrupteur vert côté droit du microscope) 2. Je ne vois rien sur la photo en confocal - vous entendez bien les miroirs bouger quand vous passer de VIS à LSM (le logiciel a peut être démarré en mode use existing image) - vous voyez passer le laser sur la lamelle, sinon le laser n est peut être pas sur on - vérifier la configuration, le bon laser est bien allumé - vérifier si le detector gain n est pas à 0 ou trop bas, monter le progressivement en mode de scan fast, et ne le mettez pas directement à fond, il faut éviter de saturer les PMT. 3. La qualité de l image n est pas terrible - résolution : augmenter à vitesse : au moins à 6 - pinhole : ouvert, sur MAX - configuration : utiliser le canal META (ChS) le PMT est plus sensible et donne moins de bruit de fond. - utiliser la palette range indicator pour optimiser les réglages du détecteur - faire la moyenne de plusieurs scans (dans acquire, mode et scan average) Mais parfois il n y a pas de miracle si la fluorescence est faible ou diffuse, il y aura toujours beaucoup de bruit de fond. 45

46 46