Microscopie de fluorescence Etat de l art

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1 Etat de l art Bibliométrie (Web of sciences) CLSM GFP & TPE EPI-FLUORESCENCE 1

2 Fluorescence Diagramme de JABLONSKI S2 S s Excitation Eex Eem 10-9 s Émission Courtoisie de C. Spriet <<10-12 s S0 Eex > Eem λex < λem Triplet - Phosphorescence et photoblanchiment Diagramme de JABLONSKI Transfert d énergie Eex Triplet 10-6 s Photoblanchiment Phosphorescence Courtoisie de C. Spriet 2

3 Propriétés des fluorochromes Emission => décalage vers les grandes longueurs d onde : décalage de Stokes Propriétés des fluorochromes? L'émission de fluorescence est sensible à l'environnement de la molécule. C'est le cas, par exemple, de la fluorescéine dont le spectre d'émission varie en fonction du ph 3

4 Microscope en épi-fluorescence Objectif Miroir dichroïque objet Filtre d excitation Filtre d arrêt ou d émission Source de lumière à spectre large Microscopie confocale Stratégie : rejeter la lumière ne provenant pas du plan focal Approche : Filtrage optique 4

5 Invention du microscope confocal Marvin Minsky (1957) La microscopie à balayage Amélioration du contraste par réjection de la lumière «vagabonde» (stray light) miroir dichroïque caméra diaphragme de champ excitation miroir dichroïque photodétecteur pinhole excitation Imagerie «plein champ» objectif spécimen plan focal Imagerie «à balayage» 5

6 Confocal : conjugaison de plan focaux Source laser Plan focal source Plan focal objet Plan focal détection Objectif PM Specimen Filtre d arret Diaphragme confocal «pinhole» Microscopie confocale Formation de l image Source ponctuelle Pinhole rayons diffractés Plan image 6

7 Microscopie confocale Pouvoir de sectionnement Axe optique Intensité intégrée I 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 conventionnel confocal B conventionnel 0,5 1,0 1,5 2,0 Position le long de l axe optique (µm) confocal Microscopie confocale Mitochondries dans cellule vivante (rhodamine 123) Pouvoir de sectionnement 5 µm conventionnel confocal 7

8 Mitochondries dans cellule vivante (rhodamine 123) Formation de l image Pouvoir de sectionnement Z conventionnel confocal La microscopie à balayage pinhole 8

9 La microscopie à balayage pinhole Dispositif de déflexion XY LASER objectif Balayage objet Balayage faisceau La microscopie à balayage Balayage vertical Balayage horizontal 9

10 Echantillonnage spatial et résolution Intensité Position x balayage xy Signal numérisé Echantillonnage spatial et résolution Pixels (points élémentaires d image) Image 512x512 points 10

11 Restitution du relief par le mouvement Section transversale de peau de doigt : Immuno-marquage, épaisseur coupe histo. 50µm Section transversale de peau de doigt : Immuno-marquage épaisseur 5µm cellules de Merkel 25µm fibres nerveuses 11

12 Microscopie à déconvolution numérique Stratégie : reconcentrer la lumière diffractée Approche : Restauration numérique Microscope confocal Déconv. Plus proches voisins Déconvolution Contrainte itérative Eliminer la lumière mal placée! (supprimer des photons) Ramener la lumière où elle aurait due aller! (réassigner les photons) 12

13 Oxyz Résolution - pouvoir séparateur z z z z z z ixyz z z z z z z z Source ponctuelle Plan image Restauration 3D, contrainte itérative Tête de spermatozoïde dé-membranée Xenopus laevis incubée dans de l extrait d ovocyte. Plan focal XY Plans focaux XZ Reconstruction3D 13

14 Microscopie à excitation bi-photonique Stratégie : confiner l excitation lumineuse au foyer de la lentille objectif Approche : excitation non-linéaire Propriétés de l excitation bi-photonique Sectionnement optique (microscopie 3D) Microscopie confocale Déconvolution Contrainte itérative Excitation bi-photonique Eliminer la lumière hors focale Ramener la lumière où elle aurait due aller! (réassigner les photons) Créer de la lumière uniquement dans le plan focal 14

15 Comparaison entre fluorescence SPE et TPE SPE TPE S1 S1 S 1 S λi σ 1 a2 σ a λe > λi λi S0 Absorption linéaire Emission Section efficace σ SPE = σ a = cm 2 S0 λi ΔT σ a1 Emission λe < λi Absorption non linéaire σ TPE = σ a1 σ a2 ΔT = cm s Absorption bi-photonique Condition nécessaires pour l absorption bi-photonique : une très haute densité en photons - Densité temporelle : deux photons doivent arriver simultanément source laser pulsée femto-seconde - Densité spatiale : deux photons doivent arriver sur un même fluorophore condition réalisée par l objectif du microscope (forte focalisation due à l ouverture numérique) 15

16 Microscopies à excitation de fluorescence non-linéaire DENSITE TEMPORELLE : Source LASER IR pulsée temps 10ns 10ns 10ns 10ns P 10W P 100kW Puissance moyenne 1W Mode continu t Mode pulsé t Microscopies à excitation de fluorescence non-linéaire DENSITE SPATIALE : Objectif à grande ouverture numérique dilution spatiale confinement temporel temps confinement spatial confinement temporel 16

17 Propriétés de l excitation bi-photonique SPEF Solution de FITC TPEF Excitation 488nm Excitation 976nm Objectif x10 Confinement de la fluorescence au foyer de l objectif y Microscopies à excitation de fluorescence non-linéaire Propriétés de l excitation bi-photonique Confinement du photoblanchiment Zone de blanchiment Fluorescence GFP (TPEF) x z 0,6µm 17

18 Microscopies à excitation de fluorescence non-linéaire Propriétés de l excitation bi-photonique Réduction des dommages photo-induits dans les cellules vivantes Visualisation de la respiration mitochondriale par excitation biphotonique de l autofluorescence du NADH/NADP Microscopies à excitation de fluorescence non-linéaire Respiration mitochondriale: hépatocytes in vitro 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0 contrôle DH A DNP octanoate oléate NADH FLAVO 18

19 Illumination structurée (Apotome TM, Optigrid TM ) Stratégie : rejeter la lumière ne provenant pas du plan focal Approche : Codage optique et reconstruction numérique Principe de l illumination structurée Grille de modulation 19

20 Principe de l illumination structurée Image conventionnelle Illumination plein champ Grille d illumination structurée Principe de l illumination structurée Trois images modulées par la grille avec translation 20

21 Traitement numérique : Combinaisons des intensités minimales A B Min(A,B,C) C Dans plan focal les zones non éclairées annihilent les zones éclairées! Contribution hors focale Image normale A Traitement numérique Soustraction de l information hors focale Information du plan focal Contribution hors focale B A - B 21

22 Vers la super-résolution Les microscopies STED, PALM, SR-SIM STED : Approche par façonnage de la tâche de diffraction PALM : Approche par détection de signaux parcimonieux SR-IM : Approche par illumination structurée S1 La microcopie STED : STimulated Emission Depletion Basé sur l utilisation d un laser d excitation (λi) et d un laser de désexcitation (λe) par émission stimulée (λs), la lumière de désexcitation n est pas rétrodiffusée SPE ns S1 SE ps λs λi λe > λi λi λe = λs S0 S0 Absorption linéaire Absorption linéaire Emission stimulée immédiate Emission (ns) radiative isotrope Diffusion cohérente vers l avant 22

23 Excitation Emission Fluorescence conventionnelle ns Z Excitation Déplétion, diffusion vers l avant Emission résultante STED ns Z Le principe du STED D après S. Hell 23

24 Comparaison, Confocal versus STED D après S. Hell La microcopie PALM : PhotoActivated Localization Microscopy Repose sur la combinaison de deux approches : 1 ) Allumage sélectif et séquentiel des fluorophores : système de photoactivation à bas régime, puis photoblanchiment 2 ) Localisation du fluorophore allumé par application d un modèle de PSF, stockage de la position dans une nouvelle image 24

25 La microcopie PALM : PhotoActivated Localization Microscopy Tâches de diffraction non-résolues Fluorophore commutable allumage sélectif Ajustement PSF Détection centre Fluorophore commutable allumage sélectif Ajustement PSF Détection centre Tâches «résolues» par reconstruction D après S. Hell 25

26 Photoactivated Localization Microscopy (PAL-M) 26

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