L imagerie de pointe au service de la recherche

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1 Dossier de presse «Voyage dans l intimité des cellules» L imagerie de pointe au service de la recherche J. Dompierre/Institut Curie Visite de presse du 26 juin 2003

2 Sommaire LA MICROSCOPIE OPTIQUE p 4 La microscopie à épifluorescence p 5 La vidéomicroscopie 4-5D à déconvolution p 8 La microscopie confocale à balayage laser p 9 La microscopie à deux photons p 11 LA MICROSCOPIE IONIQUE p 13 LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE p 16 L IMAGERIE PAR RESONANCE MAGNETIQUE p 19 LA MICROSCOPIE A FORCE ATOMIQUE p 22 MIEUX VOIR POUR MIEUX COMPRENDRE p 24 TABLEAU RECAPITULATIF p 25 Contacts presse Relations Presse Catherine Goupillon Tél Céline Giustranti Tél Iconographie Cécile Charré Tél Fax service.presse@curie.fr 1

3 L imagerie de pointe au service de la recherche En se dotant d un plateau de haute technologie en constante évolution, l Institut Curie a placé l imagerie au cœur de ses recherches. Des équipements de pointe contribuent largement à améliorer l étude des cellules normales et tumorales. Le plateau d imagerie repose essentiellement sur trois types de microscopies optique, ionique et électronique ainsi que sur la technique de résonance magnétique nucléaire (RMN). Observer, plonger au plus profond de notre organisme pour comprendre comment il fonctionne, ce rêve est en passe de devenir une réalité tangible pour les biologistes. Mais s il est désormais possible de suivre une protéine dans son intimité cellulaire, l histoire remonte à plusieurs siècles et elle est étroitement associée au développement de la biologie cellulaire. Depuis lors les techniques se sont développées et de nouveaux outils sont apparus. Les dernières avancées de la microscopie optique permettent d observer en direct la vie des cellules. La microscopie électronique, un autre «grand classique», nous entraîne au cœur de la cellule pour voir ses plus petits composants. Mais il y a aussi des techniques toutes récentes : la microscopie ionique et la microscopie à force atomique (AFM). Développées par des physiciens, elles font une entrée fort remarquée dans le monde de la biologie. Du fait de son caractère peu invasif, la RMN constitue également une approche innovante pour étudier la matière vivante. La microscopie en quelques dates L'emploi en biologie du microscope simple, constitué d'une seule lentille, remonte au XIVe siècle, mais on a la preuve qu'il était déjà possible, en des temps bien plus reculés, d'examiner des objets au moyen de lentilles. Les plus anciens microscopes composés de plusieurs lentilles connus datent de Ils ont été construits par les opticiens lunetiers hollandais Jansen père et fils, qui ont découvert les capacités de l'association de plusieurs lentilles en observant le paysage à travers les vitres des fenêtres de leur atelier. Mais c est le Hollandais Van Leeuwenhoek qui est considéré comme l'inventeur de la microscopie moderne. Grâce à ses microscopes simples, loupes parfois à deux ou trois verres pour diminuer leurs focales en restant de dimension raisonnable, de conception fondée sur une adaptation empirique de leurs caractéristiques optiques à celles de l'œil, il observe dès 1673, des bactéries, des protozoaires, des spermatozoïdes, des fibres nerveuses. Tous ces instruments d imagerie sont utilisés pour des applications bien précises. En multipliant les points de vue sur la cellule, ils permettent d accumuler des informations complémentaires sur 2

4 les phénomènes biologiques étudiés. Les mécanismes complexes qui régissent la machinerie cellulaire sont ainsi de mieux en mieux compris. Depuis plusieurs années, l Institut Curie accorde une place majeure à l imagerie du vivant, ce qui lui permet désormais de jouer un rôle moteur dans le développement d instruments sophistiqués tant pour l acquisition que pour le traitement d images. Les chercheurs de l Institut bénéficient d un ensemble exceptionnel d outils performants et complémentaires pour «voir» les structures biologiques et suivre des mouvements dynamiques dans la cellule. Améliorer et combiner les techniques d imagerie pour accéder à l intimité cellulaire et mettre à jour des mécanismes jusqu alors inconnus, tel est l objectif des chercheurs de l Institut Curie. 3

5 LA MICROSCOPIE OPTIQUE La microscopie optique conventionnelle telle qu elle était utilisée au XIXe siècle, posait encore plusieurs problèmes. Tout d'abord, la résolution est dépendante de deux lentilles, et par conséquent, assez limitée. La faible profondeur de champ de l'image est également un handicap à l'observation : si la zone de mise au point est nette, les zones immédiatement au-dessus et audessous sont floues et perturbent l'image observée. De plus, une cellule vivante n'est pas assez contrastée, ce qui rend l observation des différents compartiments qui la composent difficile. (matériel et logiciel), en étroite collaboration avec les autres unités de l Institut. Depuis 1997, le parc d imagerie s est considérablement développé : il existe désormais une quinzaine de postes d observation, dont deux microscopes confocaux (l un d entre eux est équipé pour la cellule vivante depuis 2001), quatre postes de vidéomicroscopie et un poste réservé pour la recherche et le développement en imagerie. Quelques définitions utiles Pour pallier ces deux inconvénients majeurs, les Résolution : C est la distance minimale entre deux objets pour qu ils puissent être scientifiques ont eu d une part recours à des distingués l un de l autre lors de marqueurs fluorescents, et d autre part à l utilisation l observation. Elle dépend de trois paramètres, la longueur d onde, l ouverture d'une seule lentille : la microscopie à numérique du système de lentilles utilisé et épifluorescence était née Une histoire entre microscopiste et biologiste qui ne cesse depuis lors d évoluer, de se perfectionner et de nous emmener encore plus loin dans les méandres de la cellule. l indice de réfraction du milieu de montage dans lequel baigne l échantillon. Diffraction optique : En raison de sa nature ondulatoire, la lumière ne suit pas exactement le parcours lumineux idéalement rectiligne prédit par les optiques géométriques. Les ondes Les chercheurs de l Institut Curie participent activement aux évolutions de l imagerie optique. La plate-forme d imagerie numérique du pôle de biologie cellulaire, placée sous la responsabilité de Jean-Baptiste Sibarita 1, présente en effet l originalité lumineuses traversent un système optique par une variété de trajets légèrement différents, de telle sorte qu elles interfèrent et provoquent des effets de diffraction optique. En conséquence, l image d un point n est pas ponctuelle mais une tâche lumineuse. de consacrer une partie importante de ses activités au développement de nouveaux outils L Institut Curie est d ailleurs un centre référent au niveau européen pour le traitement des images et un enseignement de haut niveau est dispensé à d autres chercheurs par Jean Salamero 2, Vincent Fraisier 3 et Jean-Baptiste Sibarita. 1 Responsable de la plate-forme d imagerie scientifique dans l UMR 144 CNRS/Institut Curie «Compartimentation et dynamique cellulaires» dirigée par Jean Paul Thiery. 2 Equipe «Mécanismes moléculaires du transport intracellulaire» dirigée par Bruno Goud, UMR 144 CNRS/Institut Curie. 3 Ingénieur de la plate-forme d imagerie scientifique. 4

6 Depuis mai 2001, une structure de tests systématiques de nouveaux matériels existe au sein du pôle de biologie cellulaire. Le rôle de cette infrastructure est d évaluer précisément les nouveaux appareils et logiciels disponibles sur le marché. Ces tests sont réalisés en étroite collaboration avec les biologistes de l Institut, afin de répondre au mieux à leurs besoins. Néanmoins, avant toute validation biologique, d autres tests minutieux sur des objets calibrés sont systématiquement effectués. Ces derniers permettent de déceler précisément les avantages et inconvénients des systèmes étudiés. La microscopie à épifluorescence Un microscope à épifluorescence, c est l alliance entre un microscope optique ordinaire (éclairé par une lampe de lumière blanche) et deux filtres qui permettent de sélectionner et de visualiser la fluorescence. Concrètement, un marqueur fluorescent (voir ci-dessous) est lié à un anticorps qui va aller dénicher dans la cellule la protéine d intérêt et se fixer spécifiquement sur elle. Le choix subtil des filtres permet alors de détecter la protéine. Le premier filtre est sélectionné pour ne laisser passer que les longueurs d ondes qui excitent le marqueur fluorescent en question, tandis que le second les arrête et ne laisse passer que les longueurs d ondes émises par ce même marqueur fluorescent. En conséquence, la lumière recueillie en sortie de microscope (au niveau de l œil ou du système d'acquisition de l'image) ne correspond qu'aux radiations émises spécifiquement par le fluorochrome fixé sur la molécule d intérêt. Cela permet de localiser la protéine dans l échantillon et cela même si elle n est présente qu en quantité infime. Pour accentuer l effet des filtres et ainsi éviter au maximum les déperditions de lumière, un miroir «dichroïque», est généralement ajouté sur le trajet optique. Pour que cette technique revête tout son intérêt, il faut que plusieurs protéines puissent être localisées en même temps dans une cellule, ce qui revient à utiliser différents marqueurs et des jeux de filtres, chacun spécifique d un fluorochrome. S il est envisageable dans une préparation d utiliser La fluorescence : balise Argos du monde cellulaire Les molécules fluorescentes ont la particularité de pouvoir absorber la lumière a une longueur d onde donnée puis de réémettre à une longueur d onde plus élevée c-à-d avec une couleur précise. La fluorescence observée peut avoir plusieurs origines. Il existe dans certaines cellules des fluorochromes naturels, comme la chlorophylle qui, excitée, émet une lumière rouge. Des substances fluorescentes peuvent également être fixées à un anticorps ou introduites seules lorsqu elles ont la capacité d aller se lier à une structure cellulaire particulière. La rhodamine et ses dérivées, la fluorescéine et le DAPI, sont les colorants les plus utilisés. Excités par une lumière de longueur d'onde appropriée, ils émettent respectivement une lumière rouge, verte et bleue. Par exemple, le DAPI qui se fixe spécifiquement sur l ADN est généralement utilisé pour localiser le noyau des cellules. plusieurs fluorochromes, il est en revanche difficile d'observer en même temps les radiations émises par chacun d'eux : il faut alterner les filtres pour obtenir des clichés successifs des 5

7 protéines d intérêts ou avoir recours à des techniques de détection plus complexes. L image de l ensemble est ensuite recomposée grâce à un traitement Avantages Observer plusieurs marqueurs Rapide Coût peu élevé Résolution latérale 200 nm et axiale 1 µm Inconvénients Sur cellule fixée 2D informatique. Pour cela, il est préférable de travailler sur du matériel fixé, ce qui implique que les cellules aient été figées par une immersion dans un solvant ou dans un acide. En outre, compte-tenu de la faible capacité de pénétration de cette technique, seul des échantillons peu épais peuvent être observés : le matériel biologique est découpé avant l observation en fine tranche grâce à un microtome. Plus la coupe est fine, plus l image sera nette. A ce stade, la microscopie à épifluorescence ne permet donc pas de travailler sur du matériel vivant. L épifluorescence pour mieux comprendre le développement métastatique A ce jour, l un des défis de la cancérologie est de mieux comprendre la formation des métastases pour pouvoir les éviter. L équipe de Lionel Larue 4 à l Institut Curie vient d apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes conduisant à la migration des cellules. Ils ont montré que l activation d AKT entraîne une perte d adhésion entre les cellules. Pour cela, ils ont observé grâce à la microscopie à épifluorescence, la localisation dans la cellule, de protéines assurant la cohésion cellulaire. Jointes à d autres résultats obtenus par des études de biologie moléculaire ou de coupes histologiques, ces données prouvent que l activation d Akt en continu confère aux cellules la mobilité nécessaire pour aller envahir d autres tissu et former des métastases 5. La microscopie à épifluorescence a ici largement contribué à démontrer le rôle de «carburant» d AKT. Quand microscopie à épifluorescence rime avec 3D La cellule est un objet en 3 dimensions. Il est donc rapidement apparu indispensable pour les chercheurs de l Institut Curie d inclure une nouvelle dimension aux images observées en épifluorescence. Jean-Baptiste Sibarita et Jean Salamero se sont donc attachés à améliorer ce système. Pour permettre l acquisition d images à différentes profondeurs, ils ont équipé leur microscope avec un petit outil motorisé un piézo-électrique. Piloté par informatique, il permet de déplacer la zone de mise au point avec une très grande précision (de 0,1 à 0,2 micromètre) et ainsi d acquérir séquentiellement des coupes optiques sur l épaisseur voulue de l échantillon. L ensemble de ces coupes est ensuite traité par un logiciel qui permet de reconstruire une image en 3D. Pour éliminer le flou dû à la contribution des autres plans optiques, les images sont traitées par un logiciel de déconvolution mis au point par Jean-Baptiste Sibarita (voir p. 7). 4 Equipe «Génétique du développement des mélanocytes», UMR146 CNRS/Institut Curie «Régulations cellulaires et oncogenèse». 5 The protein kinase Akt induces epithelial mesenchymal transition and promotes enhanced motility and invasiveness of squamous carcinoma lines. Sylvia Julien Grille et coll. Cancer Research, vol. 63, pp ,

8 Cette association entre ordinateur et microscope à épifluorescence permet l acquisition d images 3D de cellules fixées multimarquées, de manière entièrement automatisée et rapide. Le plateau technique de microscopie optique en fluorescence de l'institut Curie est particulièrement adapté à l'étude du comportement cellulaire. L image 3D obtenue dix fois plus rapidement qu'avec un microscope confocal permet de localiser avec une très haute définition les composants cellulaires au cours des processus vitaux. Avantages Observer plusieurs marqueurs 3D Traitement informatique pour améliorer la qualité de l image Coût peu élevé Résolution latérale 150 nm et axiale 500 nm Rapidité Inconvénients Sur cellule fixée La déconvolution pour améliorer les images Un des intérêts majeurs de l acquisition d image numérique est de pouvoir ensuite les traiter par des logiciels pour en améliorer la qualité. Les chercheurs de la plate-forme d imagerie consacrent une part importante de leurs activités à la mise au point de tels logiciels, et notamment à des algorithmes de déconvolution. Le but de la déconvolution est de restituer à leur place d origine les contributions provenant des plans inférieurs et supérieurs au plan de coupe, de manière à supprimer le flou optique et donc à augmenter la résolution. Cela revient en fait à diminuer la taille de la tache lumineuse formée par l image d un point. L un des logiciels de déconvolution mis au point par Jean-Baptiste Sibarita est actuellement commercialisé. Il permet de traiter rapidement et automatiquement les images obtenues par microscopie optique. C'est grâce à ce traitement de l'image que l'on obtient des images 3D à haute résolution en microscopie traditionnelle, et de la 5D en vidéomicroscopie (5D = 3D + temps + 2 longueurs d'onde). Appliqués aux images de microscopie confocale, ces algorithmes permettent quasiment d améliorer la résolution d un facteur deux. La microscopie à déconvolution pour voir les neurones en 3D L équipe de Frédéric Saudou 6 étudie la maladie de Huntington, une affection neurologique rare qui provoque des mouvements anormaux des membres, de la tête et du cou. Sur le plan cellulaire, cette pathologie est due à la mort des neurones par un mécanisme encore mal connu faisant intervenir une protéine, la huntingtine qui devient mutante. Les biologistes de l Institut Curie ont développé un modèle cellulaire reproduisant les caractéristiques de la maladie qui leur a permis de montrer que la protéine huntingtine mutante doit s accumuler dans le noyau des cellules pour induire la mort par apoptose des neurones 7. En associant la huntingtine mutante avec un marqueur fluorescent, ils ont ensuite pu observer sur des images en 3D obtenues par microscopie à épifluorescence avec déconvolution le rôle de certaines protéines sur la formation de ces agrégats. Ils ont récemment identifié deux protéines capables de bloquer à la fois la formation de ces agrégats dans des cellules où la huntingtine est mutante, et la mort neuronale 8. C est la première fois que des facteurs agissant directement sur la protéine impliquée dans la maladie de Huntington sont ainsi découverts. 6 Equipe «Signalisation intracellulaire et mort neuronale» UMR 146 CNRS/Institut Curie. 7 Huntingtin Acts in the Nucleus to Induce Apoptosis but Death Does Not Correlate with the Formation of Intranuclear Inclusions. Frédéric Saudou et coll. Cell. 95, pp 55-66, The IGF-1/Akt pathway is neuroprotective in Huntington s disease and involves Huntingtin phosphorylation by Akt. Sandrine Humbert et coll. Developmental Cell. 2 pp 831-7,

9 La vidéomicroscopie 4-5D à déconvolution Grâce aux progrès dans la motorisation des microscopes et au développement des nouvelles sondes fluorescentes pour le vivant, il est possible d équiper les microscopes de dispositif permettant d observer de cellules vivantes multimarquées en 3D et dans le temps. C est la vidéomicroscopie, une technologie qui marque une nouvelle étape dans le développement de l imagerie à épifluorescence en biologie, jusqu à présent cantonnée à la matière morte. Pour maintenir les cellules en vie lors de l observation, les microscopes doivent être équipés d un thermostat (37 C) et d un régulateur de CO 2. L association de la vidéo à des microscopes optiques offre ensuite la possibilité d acquérir des coupes optiques d une cellule vivante en temps réel et selon plusieurs champs. Les séries d images ainsi collectées sont traitées par déconvolution. Un traitement informatique assemble ensuite toutes les images ponctuelles acquises pour permettre une observation en volume. Le suivi en mouvement et en temps réel des cellules est alors possible. Quatre postes de vidéomicroscopie numériques entièrement pilotés par ordinateur existent déjà à l Institut Curie. Cet équipement ouvre de nouveaux horizons pour l étude de l évolution des cellules et du milieu intracellulaire. Filmer la vie des cellules La vidéomicroscopie 4-5D à déconvolution a permis aux chercheurs l équipe de Michel Bornens 9 de «filmer» une étape jusqu à présent insoupçonnée de la division cellulaire. La compréhension de ce processus essentiel à la vie de toute cellule revêt une importance capitale puisqu en cas de défaillance, des dysfonctionnements à l échelle de l organisme peuvent survenir. En effet, une division cellulaire incorrecte peut donner naissance à une cellule défectueuse et à termes à l apparition d un cancer. Il existe donc des mécanismes de surveillance intervenant lors des étapes cruciales de la division cellulaire. En observant les mouvements du centrosome, organite microscopique, les chercheurs de l Institut Curie ont mis en évidence un nouveau «signal» déclenchant la séparation des deux cellules-filles lors de la fission cellulaire 10. Cette approche entièrement visuelle apporte de nouvelles connaissances sur le cycle cellulaire et son déroulement. L analyse dynamique des cellules contribue à une meilleure compréhension de certains mécanismes cellulaires et de leur évolution au cours du temps. Avantages 3D Traitement informatique pour améliorer la qualité de l image Coût peu élevé Résolution latérale 200 nm et axiale 500 nm Matériel vivant Inconvénients Pas plus de deux marqueurs en simultané 9 Equipe «Biologie du cycle cellulaire et de la motilité» UMR 144 CNRS/Institut Curie. 10 Centrosome-dependent exit of cytokinesis in animal cells. M. Piel et coll. Science. 291, ,

10 La microscopie confocale à balayage laser Elle repose sur le même principe de base que la microscopie à fluorescence. La lampe à lumière blanche est remplacée par un laser ce qui permet d illuminer un seul point, à une profondeur donnée et la lumière émise par l échantillon traverse une ouverture de la taille d un trou d épingle avant d atteindre l objectif ce qui permet de rejeter la lumière émise par les autres plans. Ce système offre une meilleure résolution que les microscopes à épifluorescence classiques. En revanche, le laser doit balayer l échantillon pour obtenir des images de toute la surface. En déplaçant l échantillon précisément suivant l axe optique de l'objectif, le laser peut ensuite prendre des images à une autre profondeur et ainsi de suite Toutes les images obtenues sont enregistrées puis traitées par un logiciel qui reconstruit une image en 3D. Equipée d'un thermostat, ainsi que d'un régulateur de CO 2 (permettant de maintenir les cellules en condition adéquate), la microscopie confocale à balayage permet également d observer du matériel vivant et plusieurs marqueurs en simultané. C est certainement la raison pour laquelle la microscopie confocale à balayage est la technique d'imagerie la plus répandue aujourd'hui. Cette méthode est toutefois assez lente, puisqu'il faut environ 500 ms pour acquérir l image d un plan et donc quelques minutes pour obtenir la représentation d'une cellule en 3D. Jeux de lumière laser ou comment pister les protéines Avantages Observer en simultané plusieurs marqueurs 3D Traitement informatique pour améliorer la qualité de l image Résolution latérale 0,2 µm et axiale 0,5 µm Matériel vivant Inconvénients Coût élevé Lenteur La présence d un laser suffisamment puissant permet aux chercheurs d accéder à de nouvelles approches basées notamment sur le photoblanchiment qui consiste à éteindre la fluorescence. La technique de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) est une technique de plus en plus répandue pour étudier les mouvements des protéines in vivo. Elle consiste à illuminer fortement une région donnée de la cellule par le laser pour «éteindre» définitivement les protéines marquées. Il est ensuite possible d observer le retour progressif de la fluorescence dans ce «trou noir». Le FRAP permet de mesurer en combien de temps la zone est repeuplée par les protéines marquées. Cela permet de mettre en évidence des échanges entre les compartiments cellulaires, et de calculer la vitesse de diffusion d une molécule. Directement dérivé du FRAP, la technique de FLIP consiste à «éteindre» plusieurs fois de suite la même zone, puis à regarder si cette région se repeuple d un type de protéine. 9

11 Contrairement aux deux autres techniques, le FRET concerne des cellules fixées. Elle permet d observer les interactions entre deux protéines par transfert d énergie. Les deux types de protéines sont marquées par des fluorochromes distincts, mais dont le pic d excitation de l un est suffisamment proche du pic d émission de l autre pour qu il puisse être activé lorsque les protéines sont couplées. Mais l un des grands espoirs des chercheurs de l Institut Curie repose sur la photoactivation. Cette technique développée récemment nécessite l utilisation d un laser émettant à une longueur d onde précise (413 nm) pour exciter un type de marqueur. Après avoir «allumé» la fluorescence dans une région spécifique, les chercheurs suivent ensuite les mouvements de la protéine marquée. Etudier l efficacité de tout nouveaux anticorps intelligents grâce au confocal Les anticorps, en raison de leur capacité à reconnaître un marqueur cellulaire particulier une protéine sont généralement utilisés pour identifier des cellules anormales dans l organisme. A ce titre, ils jouent un rôle clé dans le diagnostic, le traitement et la recherche fondamentale. Le groupe de Franck Perez 11 a «confectionné» in vitro un nouveau type d anticorps réunissant pour la première fois plusieurs propriétés cruciales 12 : produits en quelques jours, ils peuvent être directement exprimés dans les cellules et sont par ailleurs sensibles à la forme des protéines. Les anticorps conformationnels sont particulièrement importants car l activité des protéines dépend de leur forme. Ainsi, certains cancers ou des pathologies comme la maladie de Creutzfeldt-Jacob sont dus à une protéine figée dans une forme anormale. La microscopie confocale leur a permis de tester l efficacité de cette toute nouvelle catégorie d anticorps dirigée contre la forme active de la protéine intracellulaire Rab6 et de la comparer aux anticorps classiques non conformationnels. C est en effet la seule technique disponible à ce jour qui permette de suivre la dynamique de deux anticorps en simultanée. Les chercheurs de l Institut Curie ont ainsi pu montrer la spécificité de leur anticorps pour la forme active de la protéine Rab6. Ces travaux constituent une avancée technologique à la fois pour la recherche fondamentale et pour le diagnostic. 11 Equipe «Mécanismes moléculaires du transport intracellulaire» dirigée par Bruno Goud, UMR 144 CNRS/Institut Curie. 12 Recombinant antibodies to the small GTPase Rab6 as conformation sensors. Nizak C. et coll. Science. Vol. 300, pp ,

12 La microscopie à deux photons Variante de la microscopie confocale à balayage, de résolution équivalente (de l ordre du micron), la microscopie à deux photons (M2P) exploite un phénomène optique qui consiste à créer de la lumière au point de focalisation. Cette propriété offre de nouvelles perspectives pour «plonger» au sein des tissus et même au cœur de la cellule. Si la M2P fonctionne avec le même type d'échantillons que la microscopie confocale, des échantillons plus épais peuvent également être étudiés. Il n'est alors plus obligatoire de faire des coupes dans les tissus, ce qui autorise les observations, par exemple, d organes chez un animal. En outre l étude de l anatomie cellulaire est rendu possible sans marquage. Le principe de la M2P est d exciter une molécule fluorescente par un faisceau infrarouge produisant des impulsions ultra-brèves tellement intenses que deux photons sont absorbés simultanément par cette molécule. Ce type d excitation est confiné dans un volume très petit (1 mm 3 ) sans que l espace traversé soit illuminé. La bonne pénétration de la lumière infrarouge permet une imagerie en profondeur beaucoup plus fine. En outre, l excitation étant limitée au point focal, la phototoxicité est réduite, ce qui permet de suivre la fluorescence pendant un temps plus long qu avec un microscope confocal. Enfin, comme la largeur des spectres d excitation à deux photons est beaucoup plus large que ceux à un photon, jusqu à quatre marqueurs distincts peuvent être excités avec un seul laser. Vers l imagerie diagnostique Au niveau de la recherche en biologie, le développement de la microscopie à deux photons permet la transposition in vivo d études aujourd hui uniquement possibles sur des échantillons fixés. Les applications médicales sont également nombreuses. Deux microscopes biphotoniques ont été construits à l Institut Curie. Le premier est dédié à la recherche fondamentale et tout particulièrement à l'étude de l architecture des tissus épithéliaux (peau, intestin, œil, etc.), sorte de barrières isolant notre organisme du milieu extérieur. Le second, plus puissant, entièrement développé par l équipe de François Amblard 13 en 2002, est destiné à l imagerie diagnostique. Doté d un laser supplémentaire et d un spectrographe, il permet d observer les tissus plus en profondeur (jusqu'à 0,5 mm dans des tissus denses). Les premières images obtenues en collaboration avec le Service d Anatomopathologie de l Institut Curie Avantages Matériel vivant Bonne pénétration Résolution équivalente à la microscopie confocale : 1 µm Faible toxicité Inconvénients Seulement 3 marqueurs en simultané Lenteur Coût élevé 13 Equipe «Physique du cytosquelette et fonctions membranaires» UMR 168 CNRS/Institut Curie 11

13 donnent des informations sur la structure des tissus à l échelle subcellulaire et sur leur métabolisme. Avec la microscopie à deux photons, le diagnostic pourrait, dans un proche avenir, être instantané sans biopsie, ni étape de coloration. FRAP et microscopie à deux photons : un mariage réussi En associant la M2P au FRAP (voir p. 9), l'équipe de François Amblard à l'institut Curie a pu suivre in vivo les mouvements de l ezrine, une des protéines responsables de l «architecture» des cellules épithéliales 14. Sa localisation spatio-temporelle étudiée avec une extrême précision (à 10 ms et 1 µm près) obéit à une dynamique très rapide : l ezrine se déplace sans cesse entre la membrane cellulaire et le cytoplasme. Les recherches continuent maintenant afin de mieux comprendre l organisation des tissus épithéliaux et les défauts pouvant entraîner la perte de cohésion des cellules qui les composent. L enjeu est de taille puisque chez l homme près de 90 % des cancers se forment dans les tissus épithéliaux. La microscopie à deux photons constitue un outil idéal pour élucider les mécanismes conduisant une cellule à quitter son tissu d origine pour aller envahir d autres tissus, comme c est le cas des cellules tumorales qui quittent leur site initial pour aller former des foyers cancéreux à distance. Cet outil est également employé par l équipe de François Amblard pour étudier les phénomènes de migration cellulaire liés aux processus infectieux et à la réponse immunitaire. 4-5D rapide à déconvolution et photoblanchiment : mariage annoncé Parmi les projets en cours, figure le développement de deux microscopes combinant l acquisition rapide d images 3D avec les techniques dérivées du laser, le photoblanchiment et la photoactivation. Ces dernières techniques ne sont actuellement accessibles que sur l un des microscopes confocaux et sur le microscope à deux photons, donc limitées en termes de rapidité par la nécessité de «balayer» l échantillon. Pour pallier cette limite, les chercheurs de l'institut Curie veulent combiner les technologies assistées par laser avec l'imagerie 3D rapide obtenue avec un microscope à épifluorescence à déconvolution. Deux postes de vidéomicroscopie 4-5D rapide à assistance laser sont en cours de développement à l Institut Curie sous la direction de François Amblard, Jean Salamero et Jean Baptiste Sibarita. L'un est associé à un laser un photon, l'autre à un laser deux photons. Le laser permettra de faire du photoblanchiment ou de la photoactivation en 3D. De tels outils seront irremplaçables pour l étude de la morphogenèse et du trafic cellulaire. 14 Molecular analysis of microscopic ezrin dynamics by two-photon FRAP. PNAS. 99 pp ,

14 LA MICROSCOPIE IONIQUE Inventée au début des années soixante par deux chercheurs de l Université d Orsay, Raymond Castaing et Georges Slodzian, la microscopie ionique a connu un développement spectaculaire notamment en physique des solides, en géologie et en métallurgie. Elle est même devenue un outil incontournable à l étude des semi-conducteurs. En revanche, son utilisation en biologie est restée relativement marginale. Il a fallu attendre une nouvelle génération de microscope ionique avec une meilleure résolution spatiale pour que l observation du monde cellulaire soit désormais d actualité. L Institut Curie, qui suit de longue date les évolutions de cette technologie, a su anticiper les progrès récents de cette technique. Pour preuve, un microscope ionique de nouvelle génération, le quatrième dans le monde a été installé sur le site d Orsay en mai Cette plate-forme nationale est unique, dans la mesure où pour la première fois en Europe, un microscope ionique de pointe est entièrement dédié à la recherche en biologie et à la cancérologie en particulier 15. Quand les ions racontent la matière Le principe de base de la microscopie ionique peut se résumer comme suit : arracher des fragments à la matière pour en établir la composition chimique. Une cartographie de la matière qui fait appel à des disciplines aussi variées que l optique électromagnétique, l ultra-vide ou encore la physique des phénomènes d ionisation et la spectrométrie de masse. Concrètement, un faisceau d ion primaire bombarde un échantillon. Sous le choc, de minuscules fragments de matière sont arrachés. La collision des ions primaires avec l échantillon entraîne la rupture des liaisons chimiques qui maintenaient la cohésion de la matière, libérant des atomes et des combinaisons d atomes neutres ou chargés (ions). L ensemble d ions distincts qui s échappe reflète la composition de la matière à l endroit bombardé. Il suffit ensuite de balayer l échantillon. Un spectromètre de masse permet de trier et d identifier les ions selon leur masse et leur charge. L intensité du signal sur l image est proportionnelle à la concentration de l ion observé. En pratique, les distributions de cinq ions de masse différente peuvent être simultanément enregistrées. Ces ions proviennent approximativement d un volume de à litre sur une épaisseur de quelques nanomètres, correspondant à deux ou trois couches atomiques de l échantillon. 15 En France, il existe 3 microscopes de la génération précédente, dédiés à la biologie. Il existe maintenant dans le monde une dizaine de microscopes de dernière génération. Seuls ceux de Harvard Medical School à Boston et de l Institut Curie sont dédiés à la biologie. 13

15 Toute la précision de l analyse dépend de la taille de la micro-sonde qui balaye l échantillon et de la capacité du spectromètre à séparer les ions de masse très proche. En effet, le bombardement de l échantillon conduit, en raison de sa structure complexe, à la formation de nombreux ions de masse extrêmement proche, nécessitant une très haute résolution pour les distinguer. Les progrès Avantages Cartographier 5 éléments chimiques dans une cellule Résolution jusqu à 50 nm Inconvénients Coût élevé Longue préparation des échantillons Cellule fixée dans ce domaine ont donné le jour au microscope ionique de nouvelle génération et ainsi ouvert la voie à l étude ultra-structurale de la cellule. Un système d imagerie de très haute résolution La microscopie ionique offre désormais une solution à un problème majeur en biologie : localiser avec précision dans la cellule une molécule étrangère, une drogue anticancéreuse par exemple. Grâce à sa sensibilité très supérieure aux techniques classiques, elle permet d'obtenir des images de résolution ultrastructurale (50 nm) intermédiaires entre celles de la microscopie confocale et celles de la microscopie électronique. Elle produit ainsi une image de chaque point de la cellule et permet de localiser 5 éléments chimiques simultanément. Ces informations sont complémentaires des données dynamiques obtenues par la microscopie à fluorescence sur cellules vivantes. En revanche, le vide régnant à l intérieur du microscope ionique rend impossible l observation de la matière vivante et nécessite une longue préparation des échantillons (voir encadré ci-contre). Une longue préparation Les contraintes liées à l observation en microscopie ionique nécessitent de figer les structures cellulaires et les éléments constitutifs dans l échantillon par des cryotechniques. L échantillon est fixé par congélation ultrarapide (<1ms) à 100 C, puis déshydraté à cette température (sublimation). En fonction de l échantillon, cette étape peut durer plusieurs semaines. Les échantillons sont ensuite inclus dans une résine, puis découpés par ultramicrotomie. Les coupes sont déposées sur un support métallique parfaitement lisse pour l analyse. Un laboratoire ouvert sur l extérieur Placée sous la direction d Alain Croisy et Jean-Luc Guerquin-Kern 16, la plate-forme de microscopie ionique de l Institut Curie est ouverte à l ensemble de la communauté scientifique sur la base de programmes principalement dédiés à la cancérologie. Plusieurs projets scientifiques sont d ores et déjà identifiés dans le cadre de collaborations internes ou extérieures (INSERM, Université Paris-Sud, Aventis, Museum National d Histoire Naturelle, Hôpital Saint-Louis ). 16 Equipe «Microscopie Ionique et Pharmacologie Cellulaire», Unité 350 Inserm/Institut Curie dirigée par Daniel Lavalette. 14

16 Parmi ces projets figurent : - Localisation intracellulaire de nouveaux médicaments antitumoraux - Etude du trafic intracellulaire de l'adn plasmidique (thérapie génique non virale) - Recherche sur les chromosomes - Diagnostic et traitement du mélanome - Diagnostic de l'ischémie myocardique et du diabète de type II Repérer des molécules Les chercheurs de l Institut Curie utilisent la microscopie ionique dans quatre grandes applications : la pharmacologie antitumorale, l'analyse cytogénétique de cellules cancéreuses et de la transformation tumorale, la radiotoxicologie et la médecine nucléaire. Alain Croisy et Jean-Luc Guerquin-Kern utilisent notamment les formidables possibilités de la microscopie ionique pour localiser certains médicaments dans les cellules et ainsi mieux comprendre leur fonctionnement. La microscopie ionique devrait ainsi devenir un allié de choix pour les pharmacologues. Jusqu à maintenant et au prix de nombreuses incertitudes, les mécanismes d action des médicaments antitumoraux étaient étudiés sur des modèles reproduisant, plus ou moins fidèlement, leur cible supposée. Grâce à la microscopie ionique, il est dorénavant possible de les suivre tout au long de leur parcours réel dans la cellule. Concrètement, on utilise comme marqueur soit un atome présent dans le médicament et naturellement absent ou rare dans la matière vivante, soit on remplace un atome de carbone ou d azote du médicament par l isotope 17 stable correspondant. Ce marquage, tout en conservant la nature chimique de la molécule médicamenteuse, lui confère une masse légèrement différente. Donnant lieu à l émission d ions spécifiques, ce marqueur atomique ou isotopique va permettre de repérer la substance étudiée. Ainsi la localisation de médicaments, candidats à la mise au point de nouvelles chimiothérapies, a déjà permis de lever certaines zones d ombre quant à leur mode d action, ce qui devrait rapidement permettre d améliorer leur efficacité, et pourquoi pas de découvrir de nouvelles molécules. En collaboration avec Philippe Maillard de l équipe de David Grierson 18, le laboratoire utilise les capacités de la microscopie ionique pour étudier la spécificité des molécules qu il synthétise vis-à-vis des cellules tumorales. Il cherche notamment à développer la photothérapie dynamique pour le traitement du rétinoblastome, une tumeur rare de la rétine chez l enfant. Cette technique qui repose sur l activation de molécules photosensibilisantes par la lumière visible ne provoque pas d altérations génétiques. L utilisation de traitements non-génotoxiques est un enjeu particulièrement important notamment chez les patients présentant une prédisposition génétique et pour lesquels il faut limiter la survenue de toute nouvelle mutation qui pourrait provoquer un second cancer. 17 Eléments de même numéro atomique mais de masses différentes. 18 Equipe «Conception, synthèse d'agents thérapeutiques» dans l UMR 176 CNRS/Institut Curie «Conception, synthèse et vectorisation de biomolécules» dirigée par David Grierson. 15

17 LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE Quand les chercheurs veulent voir plus de détails dans une structure cellulaire, «zoomer» en quelque sorte sur de petits organites, ils utilisent la microscopie électronique. De meilleure résolution que la microscopie optique, elle permet d accéder à l échelle moléculaire. Mais comme pour la microscopie ionique, les contraintes liées à la technique sont incompatibles avec l observation de matériel vivant. Des électrons pour voir la matière La microscopie électronique est née avec la découverte de la mécanique ondulatoire par Louis de Broglie (1923) : aux particules qui constituent la matière peut être associée une longueur d'onde très petite. Dans les microscopes électroniques, la source lumineuse est remplacée par une source qui émet des électrons par chauffage. Un système de lentilles, électromagnétiques ou électrostatiques, permet de condenser le faisceau. Dans la microscopie électronique à transmission, le faisceau traverse l'échantillon et perd au passage un certain nombre d'électrons. C est cette «absorption» des électrons qui donne ensuite une image de l échantillon. En raison du très faible pouvoir de pénétration des électrons, seuls des échantillons très fins peuvent être observés. Dans la microscopie électronique à balayage, le faisceau d électrons balaye l'échantillon qui émet alors des électrons secondaires dont le nombre dépend de la nature de la surface étudiée. Ce sont ces électrons qui sont collectés et détectés. Le faisceau d électrons est ensuite recueilli au niveau d une plaque électro-sensible ou d un détecteur d'électrons qui permet la visualisation de l image. Les molécules que l on souhaite étudier sont marquées avec des sels de métaux lourds, ce qui permet de «filtrer» un grand nombre d électrons et ainsi de les observer. A l Institut Curie, un laboratoire 19 entier est consacré à la microscopie électronique en biologie cellulaire. Les chercheurs y étudient notamment la biogenèse des différents compartiments cellulaires et le trafic membranaire. Ils possèdent des équipements spécialisés hautement performants qui permettent l analyse ultrastructurale et immunocytochimique de molécules dans le milieu cellulaire. A travers des thématiques originales ou par des collaborations à l intérieur et à l extérieur de l Institut Curie, ils participent à la compréhension du fonctionnement des cellules normales ou pathologiques. En préparant les échantillons à très basse température en les plaçant rapidement dans l azote liquide il est possible de figer les composants cellulaires. Ces techniques cryogéniques permettent ainsi de préserver au maximum les compartiments cellulaires et le cytosquelette tout en autorisant le marquage des protéines in situ sur les coupes. Une partie significative des projets développés dans le laboratoire de microscopie électronique de l Institut Curie concerne les mécanismes de formation et de sécrétion des lysosomes les sacs membranaires contenant les enzymes nécessaires à la digestion des cellules et autres organites apparentés, notamment les mélanosomes, organites dans lesquels a lieu la synthèse de la mélanine. Ces travaux ont permis d approfondir les connaissances sur la formation des 16

18 mélanosomes dans les mélanocytes. Cette vision plus étendue de la fonction des lysosomes ouvre des perspectives nouvelles pour la compréhension des bases cellulaires de la transformation cellulaire, de maladies dites lysosomales et des interactions d agents pathogènes et des cellules hôtes. L un des exemples en la matière est la mise en évidence de la sécrétion d exosomes par les cellules du système immunitaire. Voir les protéines en 3D Pour élucider l organisation des protéines qui assurent le fonctionnement de la cellule et mieux les comprendre, il faut avoir recours à des techniques d observation de haute résolution. La microscopie électronique 3D connaît un développement spectaculaire et occupe dorénavant une place privilégiée en biologie structurale. La cristallographie électronique permet d analyser la structure des protéines membranaires reconstituées sous forme de cristaux 2D. Les progrès de cette technique permettent dorénavant de déterminer les structures tridimensionnelles, à un niveau quasi atomique, de plusieurs protéines membranaires. Cette approche, développée dans l'équipe de Jean-Louis Rigaud 20, est devenue une alternative incontournable à la cristallographie X pour l étude des protéines membranaires. Depuis peu, l équipe de Jean-Louis Rigaud développe également la tomographie électronique pour l étude de matériel biologique, de la protéine à la cellule, en passant par les complexes macromoléculaires et les organelles cellulaires. Son principal avantage est qu elle donne accès à la structure 3D d objets biologiques de taille supérieure à 10nm et cela, sans les cristalliser. La tomographie moléculaire consiste à photographier «sous toutes leurs coutures» les molécules isolées orientées de manière aléatoire sur les grilles servant à l observation en microscopie électronique. A partir de ces images, les chercheurs reconstruisent la structure des protéines en 3D. Pour des molécules de taille inférieures à 100nm, le volume peut être calculé avec une résolution de 1-3 nm. Bien que la résolution soit loin du niveau atomique, la tomographie moléculaire permet d obtenir rapidement des informations sur la structure d objets biologiques nanométriques qui, de par leur taille ou de par leurs difficultés de cristallisation ne sont pas analysables par cristallographie. Grâce à cette technique, les chercheurs de l Institut Curie ont déterminé, avec une précision de 1,7 nm, la structure tridimensionnelle de deux transporteurs membranaires (l un chez une bactérie et l autre chez un champignon), homologues du transporteur conférant une résistance aux drogues chimiothérapeutiques chez l'homme. 19 «Laboratoire de microscopie électronique des compartiments cellulaires» dirigée par Graça Raposo dans l UMR 144 CNRS/Institut Curie «Compartimentation et dynamique cellulaires». 20 Equipe LRC-CEA «cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires» dans l unité mixte 168 CNRS/Institut Curie «physicochimie Curie» dirigée par Jean-François Joanny. 17

19 Au cours de ces dernières années, l automatisation du processus d acquisition de données en microscopie électronique a permis l émergence de la tomographie cellulaire. Cette nouvelle approche vient d'être implantée par Sergio Marco dans l équipe de Jean-Louis Rigaud. Elle utilise un ensemble de projections d un objet unique obtenues en l inclinant à différents angles sous le faisceau d électrons pour reconstruire sa structure 3D. Les évolutions des microscopes et l apparition de nouvelles techniques de préparation d échantillons permettent d élargir les possibilités de la tomographie cellulaire à l étude de molécules de tailles comprises entre 100 et 500 nm. Parallèlement, Sergio Marco développe la cartographie chimique 3D. Cette toute nouvelle application de la tomographie développée initialement dans la physique de matériaux donne des informations sur la distribution 3D de différents éléments chimiques suffisamment concentrés dans des cellules. Avec le développement de ces techniques de pointe, la microscopie électronique prend une toute nouvelle dimension en biologie. Étant donné la très rapide évolution de la tomographie électronique, la détermination des structures de complexes macromoléculaires à des résolutions allant jusqu'à 5 Å et d organites cellulaires très complexes à des résolutions nanométriques sera prochainement envisageable. L Institut Curie est le seul centre de recherche en France à développer toutes ces approches de microscopie électronique 3D et le premier à utiliser la tomographie cellulaire. La protéine ARF6, nettoyeur cellulaire Florence Niedergang dans l équipe de Philippe Chavrier 21 a pu mettre à jour la fonction précise d un acteur clé du nettoyage cellulaire, la protéine ARF6. Pour se débarrasser des agents pathogènes comme des bactéries ou des déchets cellulaires nocifs, les cellules les repèrent, les ancrent à leur membrane puis les enrobent progressivement par de la membrane jusqu à les absorber. Cette ingestion, essentielle à la réponse immunitaire et inflammatoire, porte le nom de phagocytose. Les chercheurs de l Institut Curie ont observé grâce à la microscopie électronique à balayage 22 dans des cellules exprimant une forme mutante de ARF6 que l apport en membrane nécessaire pour enrober les intrus était bloqué 23. Avantages Détermination de structure 3D Résolution pouvant aller jusqu à l Angström Inconvénients Cellule et objet fixés Extrêmement coûteuse Lorsque ARF6 est déficiente, les cellules ne peuvent donc plus éliminer les déchets et les pathogènes. Cette défaillance du système de "nettoyage cellulaire" peut alors conduire à des dysfonctionnements importants (infections, inflammations) voire compromettre l intégrité de l organisme (risque de tumeur). 21 Unité mixte 144 CNRS/Institut Curie "Compartimentation et dynamique cellulaires" dirigée par Jean Paul Thiery. 22 Les observations de microscopie électronique à balayage ont été réalisées en collaboration avec Michèle Grasset du Service de microscopie électronique de Paris VI (Institut Fédératif de Recherche en biologie intégrative, IFR 2062 CNRS). 23 ARF6 is activated and controls membrane delivery during phagocytosis in macrophages. Florence Niedergang et coll. J. Cell. Biol. vol. 161, pp ,

20 L IMAGERIE PAR RESONANCE MAGNETIQUE La spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), née dans les années 50, a tout d abord été utilisée en chimie pour déterminer la structure des molécules. Basée sur les propriétés magnétiques des noyaux (voir ci-contre), elle permet d'identifier la structure de composés en milieu liquide ou solide, de caractériser leur enchaînement atomique, et d'obtenir des informations sur l'environnement (nature des voisins proches) des noyaux atomiques. En résumé c est une méthode d analyse puissante et très performante pour établir une cartographie des atomes constituant les molécules. De la structure des protéines à l imagerie in vivo Depuis le début des années 80, la RMN s'est considérablement améliorée et offre désormais de nombreuses perspectives en biologie. A l Institut Curie, les équipes de Gil Craescu et de Daniel Lavalette 24 cherchent à élucider les relations entre la structure et l activité des Le magnétisme des noyaux Les noyaux de certains atomes peuvent se comporter comme des aimants microscopiques : placés dans un champ magnétique statique, ils s orientent dans l espace. C est cette propriété qu exploite la résonance magnétique. En effet, soumis, en plus, à un champ magnétique oscillant, les différents noyaux vont émettre un signal, une émission d énergie, qui leur est propre : ce sont les pics de résonance des noyaux qui forment le spectre RMN. Leur position (fréquence de résonance) dépend à la fois du noyau considéré et de son environnement électronique. L'interprétation des signaux (position, aspect, intensité) conduit à un ensemble d'informations qui permet d établir la structure du composé analysé. La RMN détecte notamment les noyaux d hydrogène ( 1 H), de phosphore ( 31 P), de carbone ( 113 C) de fluor ( 19 F), de sodium ( 23 Na) et d'azote ( 15 N). protéines. La RMN est devenue un outil essentiel pour la détermination de la structure des protéines et l'étude de leurs interactions au sein de complexes en solution. Associée à la modélisation et à la dynamique moléculaire, la RMN à haute résolution permet de déduire la structure de protéines comportant jusqu'à 250 acides aminés. La caractérisation moléculaire des nouvelles protéines impliquées dans la signalisation cellulaire, le contrôle du cycle cellulaire, le développement et la différenciation fournissent des données utiles pour une meilleure compréhension des désordres pathologiques et pour la conception de nouveaux outils thérapeutiques et diagnostiques. 24 Equipes "Structure, Dynamique et Interactions des Protéines en Solution" et "Dynamique Réactionnelle des Protéines" dans l'unité 350 INSERM/Institut Curie «Biophysique moléculaire» dirigée par Daniel Lavalette. 19