VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines. VI.1 Diffusion latérale théorique

Transcription

1 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V.1 Propriétés des lipides V.2 Fluidité membranaire V.3 Formation des rafts V.4 Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique

2 Déplacements latéraux des lipides et des protéines => distances relativement longues => 2 dimensions (plan de la membrane) Coefficient de diffusion latérale mesuré : DL => 2 dimensions DL = < ℓ2 > 4t <ℓ2> : parcours libre moyen (m2) t : temps (s) => unité : m2/s

3 Pour un lipide : DLlipide m2/s DLlipide 1 µm2/s => ℓ (4 t DL) => ℓ 2 µm en 1 seconde (taille d'une bactérie) => tour d'une cellule sanguine en 12 s DL des lipides et protéines est relié à la fluidité de la membrane => Approximation : membrane = continuum => Equation de Einstein-Stockes DL = kt 4πηa k : Constante de Boltzmann η : viscosité (1/fluidité) T : T K a : rayon d'une particule sphérique

4 Pour une protéine : protéine assimilée à un cylindre de section a avec a proportionnel à 3 MM => une partie de la protéine dans la membrane une partie de la protéine dans le milieu aqueux DLprot = kt 4 π ηm h x [ ln ηm h ηw a -γ] h : hauteur de la membrane ηm : viscosité membrane ηw : viscosité milieu aqueux γ : constante d'euler => Pour une protéine de 100 kda cylindre de section 5 nm la membrane : h = 10 nm et ηm = 10-1 N.s / m2 le milieu aqueux : ηw = 10-3 N.s / m2 => DLprot = m2/s DLlipide DLprot peu dépendant de la masse molaire

5 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.2 1. Théorie

6 Processus de luminescence : Emission de lumière après excitation : Chimique Mécanique (Friction) Physique Absorption de la lumière Photoluminescence : Fluorescence Phosphorescence

7 Fluorescence et Phosphorescence => Excitation d'électrons puis retour à l'équilibre λ1 λ2 => Durée de vie Fluorescence Phosphorescence => Différent de par le système excité => Phosphorescence : durée de vie plus longue Diagramme d'énergie de Jablonski

8

9

10

11

12

13

14

15 Photoblanchiment : Après plusieurs cycles excitation - émission un fluorochrome ne fluoresce plus => il est «photoblanchi» (photobleached)

16 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V.1 Propriétés des lipides V.2 Fluidité membranaire V.3 Formation des rafts V.4 Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.2 1. Théorie VI.2 2. Fluorochromes - fluorophores

17 Molécules fluorescentes = Fluorochromes => Petites molécules seules en solution = sonde fluorescente, ou colorant Fluorochromes liés à une macromolécule = Fluorophores => Fluorophores intrinsèques : naturels Acides aminés aromatiques (Trp), GFP, porphyrine => Fluorophores extrinsèques : synthétiques

18

19 La bioluminescence : La GFP (protéine fluorescente verte)

20 Protéines solubles de la famille de la GFP : tonneau β

21

22

23 Gly 67 Ser 65 Tyr 66 fluorochrome de la GFP

24 Différentes protéines fluorescentes provenant de divers organismes Discosoma

25 Différentes protéines fluorescentes modifiées par biotechnologie

26 Applications : protéines membranaires fusionnées GFP lipides fusionnés GFP => localisation par microscopie confocale ou colocalisation

27

28 Présence de Tyr (jaune) Trp (bleu) et Phe (rouge) dans les protéines membranaire => Fluorescence modifiée par l'environnement hydrophobe + quenching => renseignements sur la structure et l'insertion dans la bicouche

29 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V.1 Propriétés des lipides V.2 Fluidité membranaire V.3 Formation des rafts V.4 Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.2 1. Théorie VI.2 2. Fluorochromes-fluorophores VI.2 3. Expériences de FRAP

30 FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment Marquage par un fluorochrome

31 FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment Microscopie de fluorescence

32 FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment Rayon laser

33 FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment

34 FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching Réapparition de Fluorescence Après Photoblanchiment => Coefficient de diffusion

35

36 τd= ω γ / 4 DL 2 ω : rayon du laser γ : facteur de correction

37 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V.1 Propriétés des lipides V.2 Fluidité membranaire V.3 Formation des rafts V.4 Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.2 1. Théorie VI.2 2. Fluorochromes-fluorophores VI.2 3. Expériences de FRAP VI.2 4. Expériences de FLIP

38 FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment

39 FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment

40 FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment

41 FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment

42 FLIP : Fluorescence Lost In Photobleaching Perte de Fluorescence par Photoblanchiment => Coefficient de diffusion => Microdomaines

43 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes V.1 Propriétés des lipides V.2 Fluidité membranaire V.3 Formation des rafts V.4 Fusion membranaire VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.2 1. Théorie VI.2 2. Fluorochromes-fluorophores VI.2 3. Expériences de FRAP VI.2 4. Expériences de FLIP VI.2 5. Expériences de FRET

44 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

45 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

46 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

47 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

48 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

49 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

50 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

51 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

52 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

53 FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfert Transfert de Fluorescence par Résonance

54 => Utilisation de protéines de fusion GFP ou autres => FRET sur Trp (Quenching par Cys ou Met)

55 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.3 Diffusion latérale des lipides

56 Diffusion latérale des lipides => études par la méthode de FRAP Exemple : Etude de l'influence du cholestérol sur la diffusion du DMPC dans des liposomes géants = GUV (Giant unilamellar vesicles) => Sonde NBD - PE GUV DMPC GUV DMPC + Cholestérol

57 Limites à la diffusion des lipides : Microdomaines (rafts) Présence de protéines (=> contournement)

58 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.3 Diffusion latérale des lipides VI.4 Diffusion latérale des protéines VI.4 1. Première expérience 1970

59

60 Ac marqués vert (fluorescéine) et rouge (rhodamine) => Suivi de la redistribution des protéines au cours du temps

61

62

63 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.3 Diffusion latérale des lipides VI.4 Diffusion latérale des protéines VI.4 1. Première expérience 1970 VI.4 2. Single particle tracking (SPT)

64 Couplage protéine bille d or colloïdal ou autre particule fluorescente via des anticorps spécifiques

65 Microscopie confocale

66 Suivi de la trajectoire avec une caméra CCD

67 => MSD Mean Square displacement = fonction de déplacement quadratique moyen

68

69 Suivi d un récepteur membranaire Couplé à un fluorophore

70 ± Cholestérol

71 ± Cholestérol + inhibiteur de l actine

72 FRAP à l échelle de la particule unique

73 FRAP sur la population entière

74 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.3 Diffusion latérale des lipides VI.4 Diffusion latérale des protéines VI.4 1. Première expérience 1970 VI.4 2. Single particle tracking (SPT) VI.4 3. FRET

75 Récepteurs du «non-soi» Toll-like => récepteur du LPS lipopolysaccharide bactérien

76 FRET : donneur = TOLL-LIKE Accepteur = ganglioside

77 => Ganglioside excité (dans les rafts) => Proximité des 2 molécules => Le recepteur est confiné dans les rafts au moment de son activation

78 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.3 Diffusion latérale des lipides VI.4 Diffusion latérale des protéines VI.4 1. Première expérience 1970 VI.4 2. Single particle tracking (SPT) VI.4 3. FRET VI.5 Limitation à la diffusion latérale des protéines

79

80 Formation d agrégats, de rafts Intéraction avec le glycocalix Ou avec le cytoskelette À cause des jonctions cell.

81 Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines membranaires V. Dynamique des membranes VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines VI.1 Diffusion latérale théorique VI.2 Spectroscopie de fluorescence VI.3 Diffusion latérale des lipides VI.4 Diffusion latérale des protéines VI.5 Limitation à la diffusion latérales des protéines VII. Diffusion transversale des lipides

82 => Enzyme qui permet le maintien des différences de composition entre feuillet membranaire interne et feuillet externe

83 Flippase = translocase

84 PC SM PE PS Flippase = translocase

85