TABLE DES MATIÈRES INTRODUCTION 1 CHAPITRE 1. IMMUNOGLOBULINES 2. A. Historique 2

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3 TALE DES MATIÈRES INTRODUCTION 1 CHAPITRE 1. IMMUNOGLOULINES 2 A. Historique 2. Structure générale des immunoglobulines 2 1. Analyse par électrophorèse 2 2. Paraprotéines 3 3. Analyse après réduction et alkylation 4 4. Digestion par la papaïne ou la pepsine 5 5. Microscopie électronique 6 6. Séquence des chaînes lourdes et légères, organisation en domaines 8 7. Segments hypervariables 9 C. Hétérogénéité des immunoglobulines Hétérogénéité des parties constantes: isotypie 11 Chaînes légères 11 Chaînes lourdes Hétérogénéité des parties variables : idiotypie Polymorphisme allélique des gènes d immunoglobulines: l allotypie 15 D. Propriétés biologiques des immunoglobulines IgM IgG 17 Taux sérique et catabolisme 17 Transfert transplacentaire 17 Activité des IgG dans la phagocytose et la cytotoxicité 19 Activation du complément IgA IgD IgE 23 E. Anticorps monoclonaux Choix des cellules de plasmocytome Obtention des anticorps monoclonaux Utilisation pharmaceutique 27 F. Évolution des Ig 28 CHAPITRE 2. ANTIGÈNES ET RÉACTIONS AVEC LES ANTICORPS 30 A. Structure des antigènes reconnus par les anticorps Hétérogénéité Haptène et notion d immunogénicité Taille et notion d épitope Rigidité Accessibilité Conformation Epuisement ou adsorption des antisérums Réactions croisées et parentés antigéniques 33

4 1. Types de liaisons entre antigène et anticorps Mesure de la constante d association des anticorps Cinétique de la réaction antigène-anticorps Précipitation Agglutination Mise en évidence au moyen de marqueurs 44 Dosage radio-immunologique (Radioimmunoassay : RIA) 45 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 46 ELISPOT 48 Immunohistochimie 50 Western lot 51 CHAPITRE 3. DÉVELOPPEMENT DES LYMPHOCYTES 52 A. Notions générales Sélection clonale 53. Génétique des immunoglobulines Découverte du réarrangement des gènes d Ig Encodage de la région V par plusieurs segments d ADN réarrangés Plusieurs mécanismes expliquent la diversité des anticorps 60 C. Génération des récepteurs des lymphocytes Divers stades de développement Contrôle des réarrangements 62 D. Sélection des lymphocytes 64 E. Différenciation extramédullaire des lymphocytes Sécrétion d immunoglobulines Commutation isotypique Mutations somatiques 71 F. Marqueurs et localisation histologique des lymphocytes 73 CHAPITRE 4. RÉCEPTEUR DES LYMPHOCYTES T Anticorps anti-clonotypiques Clonage des gènes codant le récepteur T Reconnaissance de l antigène par les hétérodimères ou 2. Activation cellulaire par le complexe CD Etude des greffes Existence d un locus majeur d histocompatibilité 88

5 3. Analyse sérologique du locus H Analyse génétique du locus H Structure des molécules H Complexe HLA Polygénisme et polymorphisme du complexe HLA Typage HLA Structure des molécules HLA 99 CHAPITRE 6. PRÉSENTATION DES ANTIGÈNES AUX LYMPHOCYTES T Découverte du mécanisme de présentation d antigènes aux T cytolytiques Structure du complexe peptide-hla de classe I Motifs d ancrage des peptides antigéniques Apprêtement des peptides présentés par les molécules MHC de classe I Découverte du mécanisme de présentation d antigènes aux T auxiliaires Structure des molécules HLA de classe II Apprêtement des peptides présentés par les molécules MHC de classe II 110 D. Distribution des molécules HLA et cellules présentatrices d antigènes 112 E. Implications du phénomène de la restriction MHC 112 F. Présentation croisée d antigènes exogènes 113 CHAPITRE 7. DÉVELOPPEMENT DES LYMPHOCYTES T Sélection positive Sélection négative Marqueurs de la lignée T Marqueurs de différenciation des lymphocytes T Tétramères 119

6 1 INTRODUCTION L immunité est «L état d un organisme qui résiste, sans manifestations pathologiques, à une infection à laquelle un autre organisme, placé dans les mêmes conditions, réagit par une évolution morbide» (Littré). un impôt ou une maladie. L immunologie est la branche de la biologie qui traite des phénomènes d immunité et leurs conséquences prophylactiques ou thérapeutiques. On considère souvent que Thucydide fut le premier à formuler ce concept d immunité en décrivant la résistants lors d une seconde épidémie. Nous verrons plus loin, en abordant la vaccination, comment les contributions de Jenner et Pasteur permirent d établir les fondations de l immunologie. Remarquons déjà que l immunologie traite non seulement des mécanismes de notre système de défense contre des agents

7 2 CHAPITRE 1. IMMUNOGLOULINES A. HISTORIQUE En 1890, Emil ehring et Shihasaburo Kitasato, chercheurs à l Institut des Maladies Infectieuses de erlin, Clostridium tetani atténués par chauffage à 65 C. Plus tard ils préparèrent du sérum à partir du sang de ces lapins et en injectèrent 0.2 ml dans la cavité abdominale de 6 souris. Après 24 h, ils infectèrent les souris avec du bacille tétanique virulent. Toutes les souris contrôles, c est-à-dire qui avaient reçu du sérum de lapin normal ou pas de sérum du tout, moururent en 48 h. Par contre toutes les souris traitées survécurent et, de plus, immunisation apparaissent dans le sérum des substances qui peuvent protéger un animal contre une infection. Ensuite que cette protection peut être transférée par le sérum. On parlera d antisérum, contenant immunité humorale. Dans d autres cas le transfert de l immunité requiert des cellules plutôt que du sérum: on parlera alors d immunité cellulaire. sérologie, qui était l étude de l activité des antisérums. Si un produit, comme du lait ou du blanc d œuf, était injecté à répétition à un lapin, on constatait qu au bout de quelques semaines l addition du sérum de l animal à une solution du produit d inoculation précipitines présentes dans l antisérum furent appelées anticorps les anticorps sont des protéines, et celles-ci furent appelées -globulines ou immunoglobulines, pour lesquelles on utilise généralement l abréviation Ig.. STRUCTURE GÉNÉRALE DES IMMUNOGLOULINES 1. Analyse par électrophorèse En 1936, Michael Heidelberger a découvert que l activité anticorps était liée à des protéines. Il les retrouvait dans le précipité formé par l interaction d un antisérum anti-pneumocoque et de polysaccharides capsulaires de ces bactéries. Un peu plus tard, A. Tiselius et E. Kabat (1938) ont montré que, dans l antisérum, c était la fraction électrophorétique la plus lente, la fraction dite gamma ( ), qui diminuait nettement après précipitation avec l antigène, d où le nom de zone il est préférable de parler d immunoglobulines.

8 3 En électrophorèse à ph 8,6 en gel d agarose ou sur des membranes d acétate de cellulose, les protéines du sérum se répartissent selon leur charge électrique en diverses bandes. Les protéines sont révélées avec un colorant, comme dans la Fig. 1-1, et les quantités de protéines présentes peuvent être estimées par une lecture optique de la densité de coloration de ces bandes au moyen d un scanner (Fig. 1-2). La protéine la plus abondante, qui migre vers l anode, est l albumine. Derrière elle, le tracé est divisé en zones désignées par les lettres grecques 1, 2, et (Fig. 1-1). Elles contiennent les principales protéines : l 1-antitrypsine, l haptoglobine, la transferrine, le facteur C3 du complément et les Ig. Dans le plasma, à la jonction de la zone et Alb sérum Fig Electrophorèse en gel d agarose de plasma et sérum humains normaux. On distingue cinq fractions majeures désignées selon leur mobilité électrophorétique. Les protéines principales constituant ces fractions sont dépôt de sérum dans le gel antitrypsine haptoglobine transferrine C3 fibrinogène immunoglobulines plasma Les Ig ont une distribution particulière. Alors que les autres protéines migrent sous la forme d une bande homogène, elles se répartissent en une zone diffuse qui s étend de la zone à la zone. Ce caractère diffus indique que les molécules correspondantes ont une grande hétérogénéité de charge. On comprend dès lors proportions respectives de chacune des protéines principales. Les Ig représentent 15 à 20 % de l ensemble. 2. Paraprotéines Une étape capitale dans l étude des Ig a été la découverte, par Kunkel et ses collaborateurs (1958), de la nature des paraprotéines, qui apparaissent à l électrophorèse du sérum de certains malades (Fig. 1-2). Celles-ci sont des Ig produites en quantité anormalement importante. La plupart de ces malades souffrent soit de myélome multiple, appelé aussi maladie de Kahler, soit de macroglobulinémie de Waldenström. Le myélome multiple est une affection cancéreuse des plasmocytes, alors que le processus néoplasique de la macroglobulinémie affecte surtout les lymphocytes, qui sont les précurseurs des plasmocytes. Les paraprotéines constituent un matériel abondant et parfaitement homogène, particulièrement adéquat pour l étude de la structure des Ig. Le terme de paraprotéine, tombé en désuétude, est remplacé par Ig monoclonale ou composant monoclonal. L adjectif monoclonal provient du fait que la prolifération néoplasique n affecte qu un seul clone de lymphocytes ou de plasmocytes, qui produisent tous la même Ig. Le myélome multiple survient aussi chez certaines races de souris (AL/c et NZ) et chez le rat. Il peut être provoqué par l injection intrapéritonéale d une huile minérale appelée pristane (tétraméthylpentadécane).

9 4 Composant monoclonal Myélome Sérum normal Fig Electrophorèse en gel d agarose. A droite un sérum normal et à gauche celui d un malade atteint de myélome densitométriques correspondants. 3. Analyse après réduction et alkylation La plupart des paraprotéines ont une taille de l ordre de 150 kda. Ceci peut se déterminer au moyen de la poids moléculaire. Les plus petites protéines diffusent à l intérieur des particules, ce qui retarde leur sortie de la colonne, alors que les protéines de plus grande taille, ne pouvant pénétrer dans les pores des particules, circulent entre celles-ci et sortent les premières. En 1961, Gérald Edelman a montré que des paraprotéines étaient composées de l association de plusieurs chaînes, obtenues après rupture des ponts disulfure et dissociation des ponts hydrogène. Pour rompre les ponts disulfure, on utilise généralement des agents réducteurs comme le mercaptoéthanol ou le dithiothréitol, qui agissent comme suit : R1-S-S-R2 + 2 R3-SH --->R1-SH + R2-SH + R3-S-S-R3. En présence de Heavy, d environ 50 kda et des chaînes légères, ou L pour Light, d environ 25 kda (Fig. 1-3).

10 5 Immunoglobulines chaînes lourdes (H) réduction alkylation [ protéine ] chaînes légères (L) fractionnement sur gel 50 kda 25 kda poids moléculaire Fig Fractionnement d immunoglobulines après réduction et alkylation. gel, on mesure en continu la concentration en protéines, par absorption de la lumière dans l UV, en général à 280 nm où se situe le pic d absorbance des acides aminés tryptophane et phénylalanine. 4. Digestion par la papaïne ou la pepsine Pendant qu à New York, Edelman s efforçait d isoler les différentes chaînes d Ig, Rodney Porter, à Londres, abordait leur analyse au moyen d une technique toute différente, la protéolyse limitée. Les Ig possèdent de pleinement leur activité que si les Ig - c est le cas d ailleurs pour la plupart des protéines - sont préalablement protéases ont libre accès. Porter a travaillé sur des Ig de lapins qui avaient subi une forte immunisation contre des pneumocoques. Dans ces circonstances, l animal produit des anticorps dont la diversité est restreinte. En électrophorèse, ils n ont pas l aspect diffus habituel, mais apparaissent sous forme de quelques bandes bien délimitées. On dit que ces bandes sont oligoclonales, faisant ainsi référence au petit nombre de clones lymphocytaires dont elles proviennent. mais pas de le précipiter. La précipitation est ici l apparition de composés insolubles, souvent visibles à l oeil nu, dans un mélange d Ig et d antigènes. Comme nous le verrons plus loin, la précipitation ne survient que doivent être multivalents, c est-à-dire avoir plusieurs sites de liaison. Le fragment en question se comportait donc comme un anticorps monovalent. Il fut appelé fragment Fab (ab pour antigen binding). Quant au second fragment, il fut appelé Fc, car il cristallisait spontanément à froid. Comme la cristallisation ne survient que si les molécules sont homogènes, ce fragment avait peu de chance d être impliqué dans l hétérogénéité des Ig

11 6 Porter a immunisé des chèvres avec les fragments Fab ou Fc de ces Ig de lapin, et testé ensuite la réactivité des anticorps de chèvre anti-fab ou anti-fc vis-à-vis de chaînes lourdes ou légères d Ig de lapin, obtenues comme l avait fait Edelman. Il en conclut que le fragment Fab contenait de la chaîne H et de la chaîne L, tandis que le fragment Fc ne contenait que de la chaîne H. Une autre protéase, la pepsine, fut utilisée par Alfred Nisonoff (1960). Une digestion modérée (ph 4,5) des IgG a donné, à côté de multiples peptides, un fragment majeur d un poids moléculaire de 110 kda (Fig. F(ab ) 2 donné à ce fragment. Il contient de la chaîne L et de la pepsine. SS SS antigène papaïne Fab 50 kd SS Fc SS SS SS pepsine SS Fig Protéolyse limitée d une IgG de lapin. immunogloguline 150 kd SS SS F(ab')2 100 kd 5. Microscopie électronique DNP-(CH 2 ) n losanges ou de triangles, dont chaque coin comporte un épaississement correspondant à la région Fc des

12 A C Fig Microscopie électronique de l IgG groupements dinitrophényle unis par 8 CH 2. Les molécules sont révélées par la technique dite de coloration négative à l acide 2 : l épaississement correspondant au fragment Fc, à chaque coin des formé par l antigène bivalent et les anticorps. Å, et une région Fc Å. La longueur et la composition de la charnière varient nettement d une classe et même d une sous-classe d Ig microscope électronique. Semblable à un Y dans certaines circonstances, un anticorps IgG peut prendre la NH 2 NH 2 NH 2 chaîne lourde NH 2 SS SS chaîne légère SS Fig Représentations d une molécule d immunoglobuline. études de la structure des molécules d anticorps ont porté sur la classe d Ig la plus abondante, l IgG. Celle-ci est constituée de

13 8 6. Séquence des chaînes lourdes et légères, organisation en domaines La détermination de la séquence des acides aminés et la diffraction des rayons X, appliquées à des Ig monoclonales, ont révélé que les chaînes L et H étaient constituées de parties semblables, les domaines d Ig. Ils se ressemblent par leur conformation en feuillet plissé ( pleated sheet) et l homologie de leur séquence de 110 à 120 acides aminés. (Fig. 1-6 et 1-7). A s-s V H s-s s-s C H 1 V L s-s s-s C H 2 C H 3 s-s s-s s-s s-s s-s s-s s-s s-s s-s s-s s-s C L V L V H C L C H 1 C H 2 C H 3 C D E C N Fig Domaines d Ig. A et : schémas d IgG1 humaine. La région charnière est située entre C H 1 et C H 2. Chaque boucle correspondant à un domaine est stabilisée par un pont disulfure. C et D : conformation en feuillet plissé constitué de chaînes anti-parallèles. L image d un feuillet plissé vient du fait que les anti-parallèles, puisque la séquence dans chaque brin voisin progresse en sens opposé. Près de la moitié des acides aminés d un domaine sont impliqués dans la constitution de ces feuillets. Le reste des acides aminés constitue les boucles connectant les segments antiparallèles. E. Régions V L et C L d une chaîne légère

14 9 Dans les Ig, le domaine situé du côté N-terminal se caractérise, tant dans les chaînes L que dans les chaînes H, par une grande variété dans sa composition en acides aminés. Il fut donc appelé région variable ou domaine V L ou V H région constante ou région C L ou C H. C L ne comporte qu un seul domaine, alors que C H se divise en trois ou quatre domaines selon la classe des Ig. La région charnière est située entre les domaines C H 1 et C H Segments hypervariables La comparaison des séquences des parties variables (110 résidus) d anticorps différents a été particulièrement instructive. On a trouvé des segments, dits hypervariables, où la diversité des séquences entre les anticorps est très grande (Fig. 1-8). Toute région variable, qu elle appartienne à une chaîne L ou une chaîne H, contient trois segments hypervariables appelés CDR1, CDR2 et CDR3 pour Complementarity-Determining Regions. En effet, ils constituent les points de contact avec l antigène (Fig. 1-8). Les séquences qui séparent les trois CDR constituent le chassis (framework rares.

15 10 A CDR1 N CDR3 CDR2 Variabilité S S Acides aminés C CDR1 CDR2 CDR3 FR1 FR2 FR3 FR4 N C CDR3 D V L CDR1 C CDR2 Gly 29 Asn 30 V L E L1 105 Ser 93 L3 Tyr H3 O CH 3 Arg Leu 94 Trp 54 Glu 35 H1 O HO CH 3 H 3 C CH 2 (CH 2 CH 2 CHCH 2 ) 2 H2 ue. A : variabilité des résidus d acides aminés dans la région V de chaînes humaines. aminés différents présents à une position divisé par la fréquence de l acide aminé le plus fréquent à cette position. Les régions V contiennent des zones hypervariables (CDR) et des segments constituant la charpente (FR). : localisation des régions hypervariables dans un domaine variable de chaîne légère. C : modèle en trois dimensions du domaine variable. D : régions variables dans les chaînes légères d une molécule d IgG.. L1, L3, H1, H2 et H3 indiquent les positions des

16 11 C. HÉTÉROGÉNÉITÉ DES IMMUNOGLOULINES les regrouper en 2 types que l on a appelés ou. De même, sur base des séquences des domaines C des pour IgG, pour IgA, pour IgM, pour IgE et pour IgD. Une telle variation portant sur les classes (chaînes H) ou sur les types (chaînes L) est dite isotypique. La variation idiotypique Que les différences soient isotypiques ou idiotypiques, la plupart ont été mises en évidence par des de chaque chaîne H (,,,, ) ou de chaque chaîne L (, ), mais aussi des parties variables de chaque anticorps (idiotypes). Si l on prépare un antisérum de lapin contre une Ig humaine d une classe donnée, par ou ) qui peut être associée à d autres chaînes H que celle de l IgA. 1. Hétérogénéité des parties constantes: isotypie Chaînes légères Les séquences des chaînes et chaînes de l homme et de la souris qu entre les et humaines. Contrairement à ce que l on constate pour les chaînes H, les différences entre et portent non seulement sur les parties constantes mais aussi sur et V. Les gènes des chaînes et se trouvent sur des chromosomes différents. Dans la plupart des espèces animales, c est la chaîne qui prédomine. Chez l homme, elle est présente dans environ 65 % des Ig. Qu un anticorps soit fait d une chaîne ou importe apparemment peu pour pouvant constituer un domaine C de chaînes légères. La protéine de ence-jones D un point de vue médical, les chaînes légères offrent un intérêt diagnostique. En effet, leur présence dans les urines est un symptôme du myélome. La tumeur produit non seulement des Ig monoclonales mais également altéré. Cette protéinurie dite de ence-jones est connue depuis La présence de protéines dans les urines se manifeste par l apparition d un trouble au chauffage (50 à 60 ) suite à la précipitation des protéines dénaturées. Or, ence-jones a constaté que, dans les cas de myélome, le précipité qui apparaissait dans les urines après chauffage tendait à se dissoudre à l approche du point d ébullition. Actuellement, pour la détecter, on concentre et anti-.

17 12 Chaînes lourdes IgG Les IgG humaines se répartissent en quatre sous-classes, dont les proportions respectives sont les suivantes: % pour l IgG1, % pour l IgG2, 5-8 % pour l IgG3 et 1-5 % pour l IgG4. L homologie de séquence entre les domaines C des sous-classes d IgG humaines est grande avec 95 % d acides aminés principales portent sur la taille et la séquence de la région charnière, ce qui a des conséquences sur les C1q, premier facteur de la voie classique du complément, dans le domaine C H 2 de la molécule d IgG4 soit moins accessible. Particularité de l IgG3 : une longue région charnière La région charnière de l IgG3 contient au moins 13 ponts disulfure, d où un poids moléculaire de 165 kda au lieu de 146 pour les autres sous-classes. Ceci semble favoriser son agrégation spontanée à froid. C est ainsi que des malades atteints d un myélome producteur d IgG3 monoclonale souffrent d obstruction vasculaire dans les dite cryoglobuline, et sa présence dans la circulation est appelée cryoglobulinémie. Certaines IgM monoclonales charnière. Des agrégats dans les préparations d IgG à usage thérapeutique peuvent déclencher des réactions IgM L IgM circulante, dont le poids moléculaire est de 970 kda, contient cinq unités de base (Fig. 1-9) et un polypeptide supplémentaire, la chaîne J (15 kda). Les chaînes, qui comportent quatre domaines constants (C ), sont pratiquement dépourvues de charnière, mais possèdent une séquence particulière de 19 acides aminés en position C terminale. Cette séquence contient un résidu cystéine qui forme un pont S-S avec l unité l action de faibles quantités de mercaptoéthanol ou de dithiothréitol, qui coupent les ponts disulfure, l IgM se dissocie facilement en ses cinq unités. être insérées dans la membrane des lymphocytes, où elles servent de récepteurs pour les antigènes. En tant que récepteur, l IgM est monomérique. La différence entre les structures primaires de l IgM sécrétée et de remplacés dans l IgM membranaire par une séquence de 41 résidus dont la moitié C-terminale hydrophobe dans toutes les Ig servant de récepteurs.

18 13 J J CS Fig Molécules d IgM pentamérique et d IgA sécrétoire. J : chaîne J, CS : composante sécrétoire. Les petits cercles présents sur certains domaines Ig représentent des hydrates de carbones. Les ponts disulfure entre chaînes sont représentés par IgA des IgM. On l y trouve sous une forme particulière dite IgA sécrétoire chaîne J et une glycoprotéine de 70 kda appelée composante ou pièce sécrétoire IgD et IgE L IgD est principalement présente à la surface des lymphocytes, et ne se retrouve dans le sérum qu à l état de traces. L IgE, nous le verrons plus loin, joue un rôle important dans la défense contre les parasites, et dans les allergies.

19 14 Table 1-1. Structure des immunoglobulines humaines Isotype Formes Constituants Poids Sous-classes Domaines particulières particuliers moléculaire (kda) constants IgG IgM circulante chaîne J membranaire IgA monomérique dimérique chaîne J 340 sécrétoire chaîne J et pièce sécrétoire 400 IgD IgE Hétérogénéité des parties variables : idiotypie La réaction anti-idiotypique a été découverte par Jacques Oudin en L antisérum d un lapin (A) anti- même groupe allotypique que le premier. Jacques Oudin a observé que le sérum immun du lapin : - précipitait des Ig du sérum immun du lapin A immunisé contre les salmonelles, - ne précipitait pas les Ig du sérum prélevé chez A avant l injection de la salmonelle (sérum pré-immun), - ne précipitait plus les Ig de l antisérum de A débarrassé des anticorps anti-salmonelle par incubation avec les bactéries. d anti-idiotypiques : propre, particulier), puisqu ils étaient dirigés contre des anticorps qui n apparaissaient que chez un individu donné et lors d une immunisation contre la salmonelle. À la même époque, Henry Kunkel a observé un phénomène similaire en injectant à des lapins des IgM monoclonales humaines provenant de patients atteints de la maladie de Waldenström. Il a constaté que certains antisérums réagissaient encore avec l IgM monoclonale, même après leur incubation avec un pool de sérums donné, les déterminants correspondants devaient être situés dans les régions variables. Ceci a été établi par des études de précipitation faites avec des fragments d Ig. Les anticorps anti-idiotypiques réagissent avec les isotype ont montré que les différences idiotypiques sont bien localisées dans la région variable et que la plupart d entre elles se trouvent dans les zones hypervariables, c est-à-dire les CDR. Dans une théorie dite du réseau idiotypique proposée par Niels Jerne (1974), l interaction idiotype-anti-idiotypes interviendrait dans la régulation de la réponse immunitaire. En cours d immunisation contre un antigène donné, (anticorps auto-anti-idiotypiques). Jerne a alors émis l hypothèse, qui reste très controversée, que ces anticorps auto-anti-idiotypiques limiteraient la prolifération des lymphocytes producteurs des premiers anticorps. Cette Des anticorps de lapins anti-polysaccharides de pneumocoque (Ac1) sont absorbés sur une colonne d antigène par absorption sur les Ac1 insolubilisés. Si un troisième lapin est immunisé alors contre les Ac2, on constate

20 15 moins une partie des anticorps Ac2 porte un déterminant très semblable à celui de l antigène initial. C est pourquoi, on parle d image interne. de l insuline, on peut obtenir des anticorps anti-idiotypiques qui réagissent non seulement avec les anticorps Ac2 Ac2 insuline Ac1 Ac3 Fig Réseau idiotypique diverses dont certaines (Ac1) correspondent au site d interaction de l insuline avec son récepteur cellulaire. Par la suite, initial. 3. Polymorphisme allélique des gènes d immunoglobulines: l allotypie de petites différences d acides aminés entre les Ig d individus différents d une même espèce. Dans certains cas, l injection d Ig d un individu dans un autre de la même espèce peut induire la production d anticorps reconnaissant une de ces différences, qu on appelle alors un déterminant allotypique. Historiquement, l allotypie D. PROPRIÉTÉS IOLOGIQUES DES IMMUNOGLOULINES Les fonctions effectrices des anticorps sont médiées par leur région Fab, qui reconnaît l antigène, et par les régions constantes des chaînes lourdes. sur les lymphocytes naïfs, et des autres isotypes sur les lymphocytes mémoire. Les Ig qui sont à la surface des lymphocytes sont un peu différentes des Ig sériques: elles contiennent un segment hydrophobe à protéines (Ig et Ig

21 16 signal d activation (comme CD3 sur les lymphocytes T). L ensemble constitute le récepteur des lymphocytes (CR: cell receptor). La seconde est la principale fonction des anticorps : la neutralisation la surface de bactéries et de virus, les anticorps empêchent la liaison avec les récepteurs de surface cellulaire, et donc empêchent l infection des cellules. Lorsqu une cellule est infectée et que des pathogènes libérés fragments Fab ou F(ab ) 2. L organisme dispose de mécanismes qui, déclenchés par la réaction antigène-anticorps, viennent compléter l action neutralisante des anticorps. Les parties constantes des chaînes lourdes jouent un rôle capital dans le déclenchement de ces mécanismes. Elles conditionnent également le catabolisme des anticorps et leur transfert dans les divers compartiments de l organisme. Ici les fonctions varient donc en fonction de l isotype de la chaîne lourde des anticorps. 1. IgM Les anticorps IgM sont les premiers qui apparaissent à la surface des lymphocytes en voie de différenciation, par leur polyvalence. Un changement de conformation 4 à l IgM de se lier à C1 et d activer ainsi le complément par la voie classique. L IgM ne peut pas traverser le placenta. En cas d anomalies congénitales, les pédiatres recourent au dosage d IgM dans le sang du nouveau-né. Si ces malformations IgM sérique (mg / ml) ont été provoquées par un agent rubéole, le virus de l herpes, un Années Fig Taux d IgM sérique en fonction de l âge et du sexe. Les lignes représentent la moyenne géométrique. Chez l adulte, il y a une différence de

22 17 doit se faire très tôt après la naissance, dans la semaine, car le nouveau-né se met à produire rapidement ses propres IgM (Fig. 1-11). Si des symptômes suggestifs de l une de ces infections apparaissent chez une femme enceinte, il importe si l infection est en cours ou ancienne : répéter les titrages et titrer séparément les anticorps IgM et IgG. Si les titres augmentent, et que les anticorps sont principalement de nature IgM, il est probable que l infection est récente ou en cours. 2. IgG Taux sérique et catabolisme staphylocoques ou les streptocoques. Les enfants atteints d agammaglobulinémie congénitale (maladie de ruton) souffrent d infections bactériennes répétées que l on peut prévenir par des injections d IgG humaines. La demi-vie de l IgG est de 18 à 23 jours, du moins lorsque sa concentration plasmatique est normale. normalement par un récepteur dit FcRn, que l on a d abord découvert sur les cellules épithéliales du rat nouveau-né (d où la lettre n), mais qui est également présent dans plusieurs tissus de l adulte, en particulier l endothélium vasculaire. Quand l IgG est liée à ce récepteur, elle est endocytée mais protégée contre la dégradation lysosomiale. Elle peut ainsi retourner à la circulation. Mais l effet protecteur s atténue avec la saturation progressive du récepteur, et de plus en plus de molécules d IgG sont dégradées. Transfert transplacentaire Si l on injecte à une lapine gravide une IgG marquée par un radioisotope, on retrouve celle-ci dans le foetus. Si au lieu de l IgG intacte, on injecte soit le fragment Fab de l IgG marquée, soit son fragment Fc, seul ce dernier passe dans le placenta et le foetus. On en conclut que l IgG traverse le placenta en se liant d abord à un récepteur placentaire qui reconnaît un site particulier dans la région Fc de la molécule d IgG. Le récepteur est le FcRn leur région Fc constitue donc la première étape du transfert transcellulaire vers le fœtus qui, à sa naissance, a dans son sang autant d IgG que sa mère. Souvent même, la concentration d IgG dans le sang du cordon

23 18 IgG sérique (mg / ml) ,5 % des IgG maternelles, mais lui-même commence à produire ses propres IgG d IgG sérique, atteint entre le 2e et 6e mois (Fig. 1-12) sera d environ 4 mg/ml. L hypogammaglobulinémie caractéristique de cet âge s accompagne d une plus grande bactériennes. L IgG est la seule classe transférée activement Années à travers le placenta, qui constitue une Fig Taux d IgG sérique en fonction de l âge. barrière étanche à la plupart des protéines entre les circulations maternelle et fœtale. C est une conclusion que l on peut tirer des différences génétiques (allotypiques) de certaines protéines plasmatiques comme la transferrine et l haptoglobine : la plupart des protéines du sang du cordon, sauf les IgG, sont encodées par des gènes de l enfant. vont se retrouver dans le sang foetal à partir de la 20e semaine de grossesse. La prudence est donc de mise, et l administration réservée à des pathologies qui font courir à la patiente des risques importants. FcRn Dans les années 70, l observation curieuse que le catabolisme des IgG était d autant plus rapide que leur récepteur Fc et qui protégeait les IgG de la dégradation. C est le caractère saturable d un tel mécanisme utilisant rat, qu en Curieusement, sa structure est proche de celle des molécules d histocompatibilité de type I (voir chapitre 5), avec une chaîne lourde contenant un segment transmembranaire, associée à la ß2-microglobuline. La particularité de la liaison des IgG au FcRn est la dépendance du ph. La liaison s opère à ph légèrement acide (< 6.5) mais pas à ph 7.4. Lorsque les IgG pénètrent dans les cellules par pinocytose, elles se retrouvent dans les endosomes où le ph acide permet leur liaison au FcRn. Celui-ci va diriger son chargement vers des endosomes qui retournent vers la surface cellulaire, au lieu de subir la dégradation dans les lysosomes. Lorsque le ph remonte lors de la fusion de la vésicule avec la membrane plasmique, les IgG sont libérées. Ce mécanisme permet le transport contre un gradient de concentration. D un point de vue moléculaire, c est la titration de résidus histidine présents dans la jonction CH 2 -CH 3 des IgG qui leur permet d interagir avec des résidus acides (GLU) à la surface du FcRn. La stoechiométrie est presque certainement 2 FcRn:1Fc. Le FcRn est présent à la vasculaires qui rende compte de son effet sur le catabolisme des IgG. Celui-ci est important: chez des souris Il est connu depuis 1965, grâce à des études menées avec des injections d albumine marquée à l iode-131, que le catabolisme de l albumine, de loin la principale protéine du plasma (40 mg/ml), est lui aussi d autant plus important que la concentration en albumine est élevée. La demi-vie de l albumine injectée est d environ 20 de production d albumine par le foie). En 1966, J. Heremans supputa qu un mécanisme similaire à celui proposé pour les IgG pouvait s appliquer aussi à l albumine. Ceci ne fut en fait démontré qu en 2003, lorsque

24 19 des chercheurs travaillant sur l interaction IgG-FcRn observèrent par hasard qu une protéine de 67 kd était protection de la dégradation semble donc bien le même pour les IgG et l albumine. On a calculé que, chez la souris, il y a chaque jour autant d albumine protégée de la dégradation par le FcRn que synthétisée par le foie. changements d acides aminés dans la région CH 2 -CH 3 cette liaison au ph acide, la demi-vie sérique sera prolongée, autorisant des injections moins fréquentes dans le cadre d un traitement de longue durée. Protéines du sérum IgG FcRn IgG maternelles lysosome circulation maternelle syncytiotrophoblaste circulation foetale cellule endothéliale Fig Fonctions du FcRn. A gauche, transfert d IgG de la mère vers le foetus, à travers le syncytiotrophoblaste. A droite, protection des IgG du catabolisme dans les cellules endothéliales. Le recyclage vers la surface des vésicules contenant le FcRn, et la dissociation [IgG/FcRn] qui survient lorsque le ph de la vésicule revient vers 7, sauve les IgG de la dégradation lysosomiale. Le schéma ne comprend pas l albumine, qui se lie elle aussi à FcRn, sur un autre site que les IgG. Activité des IgG dans la phagocytose et la cytotoxicité L IgG3 et l IgG1 sont des opsonines : elles induisent l endocytose des antigènes sur lesquels elles se sont C H R de type I ou CD64) impliqué dans la phagocytose a une Sur les leucocytes neutrophiles ainsi que sur les lymphocytes, on trouve un récepteur dit de type II (Fc RII a une fonction particulière : antigènes-anticorps. (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity ou ADCC). Par leurs récepteurs Fc (Fc RIII ou CD16), ces

25 20 Table 1-2. Récepteurs leucocytaires pour les IgG Fc -8 M Macrophages Phagocytose et activation des Fc -7 M Macrophages, Phagocytose, régulation de la (IgG1 > 3 = 4>> 2) neutrophiles, production d anticorps par les éosinophiles, plaquettes, lymphocytes et certains T Fc -6 M Cellules NK, ADCC (IgG1 = 3; pas IgG2, 4) macrophages et granulocytes ou trois domaines Ig typiques. Cluster of Differentiation plus forte que pour retenir des IgG agrégées, qui peuvent interagir avec plusieurs récepteurs en même temps. Activation du complément active et l IgG4 est sans effet. Ces différences fonctionnelles tiennent à l accessibilité d un site particulier du domaine C H H 2 quand ils ont été isolés de la molécule après digestion protéolytique. Mais, dans la molécule d IgG4, le domaine C H 1 serait disposé de telle manière qu il gêne l accès du facteur C1 au domaine C H 2. naturellement quand les anticorps se lient à des antigènes qui sont multivalents, c est-à-dire capables de lier plusieurs anticorps. 3. IgA À sa naissance, l homme n a pratiquement pas d IgA dans son sérum, car elle ne traverse pas le placenta. des IgG, mais contrairement à celle-ci, elle n est pas protégée du catabolisme. Dès lors, sa demi-vie n est que de 5 à 6 jours. L origine de l IgA sérique est double, une fraction est produite dans la moelle osseuse, la de constater une augmentation nette de l IgA sérique en cas d infection des muqueuses. Les anticorps IgA macrophages (Fc R) et favoriser ainsi la phagocytose des antigènes qu ils ont liés.

26 21 propre au tractus gastro-intestinal. Dès les années vingt, ils avaient constaté que l administration orale de shigelles à des lapins les protégeait contre une dose létale de ces bacilles, et qu en cas de dysenterie bacillaire les anticorps apparaissaient dans les selles (coproanticorps) avant qu ils ne soient décelés dans le sérum. Une électrophorèse de certaines sécrétions muqueuses (Fig. 1-14) montre de manière évidente la présence plasmocytes sécréteurs d IgA. Les proportions respectives de plasmocytes sécréteurs d IgA, d IgM et d IgG y sont de 85 %, 10 % et 5 %. A 5 IgA sérique (mg / ml) Années Fig A. Taux d IgA sérique en fonction de l âge.. Electrophorèse en gel d agar de sécrétions intestinales. Produit d une tumeur villeuse du rectum. Dans le tracé des sécrétions, notez l abondance de la bande correspondant à et la concentration sont très variables au cours du temps. Aussi est-il préférable de rapporter le IgA/IgG dans le sérum est de 0,15 à 0,30 mais, dans des sécrétions comme le lait, la salive, les larmes, le mucus bronchique et le suc gastrointestinal, ce rapport dépasse l unité. IgA attachée à l IgA polymérique présente dans la sécrétion, mais c est la microscopie électronique avec marquage migrent vers le pôle apical de la cellule épithéliale, la fusion de ces vésicules avec la membrane et la libération de l IgA sécrétoire dans la lumière (Fig. 1-15). La composante sécrétoire n est autre qu un morceau du Les lymphocytes T et mémoire de l intestin ont tendance à coloniser d autres muqueuses. C est ainsi que la glande mammaire et la muqueuse bronchique contiennent des anticorps IgA dirigés contre des antigènes du tractus digestif. On peut donc protéger l ensemble des surfaces muqueuses par administration orale de l antigène. Autre conséquence de cette observation, le lait est riche en anticorps IgA actifs contre les agents

27 qui ont infecté les muqueuses maternelles. Le nourrisson sera donc doublement protégé par le système immunitaire de sa mère : les IgG qui traversent le placenta et l IgA sécrétoire présente dans le lait. 22 IgA IgA sécrétoire poly-ig récepteur pièce sécrétoire pôle basal vésicule de transport pôle apical (lumière intestinale) Fig Transport de l IgA à travers un épithélium muqueux. Le récepteur poly-ig est constitué d une succession de cinq domaines typiques de la superfamille des Ig. La fonction principale des IgA sécrétoires est d assurer ce que l on appelle l exclusion immune des antigènes. Ces épithéliales, première étape de l infection. On retrouve ici l activité neutralisante des anticorps. Comme les le lysozyme qui lyse l acide muraminique, constituant de la paroi de certaines bactéries, et la lactoferrine, pour les ions ferriques. L action agglutinante de l IgA sécrétoire inhibera encore davantage l adhérence et le risque de pénétration des germes tout en favorisant leur élimination mécanique par le mouvement des cils vibratils ou le péristaltisme. caucasienne. Il est souvent asymptomatique. Mais certains patients présentent des infections répétées de seconde est la vaccination orale contre la polyomyélite par le vaccin dit Sabin, contenant des poliovirus vaccinales présentes dans les sécrétions.

28 23 4. IgD Avec l IgM monomérique, elle constitue le récepteur antigénique de tous les lymphocytes qui ont atteint l IgD de surface que par l absence de la séquence d ancrage de la molécule dans la membrane du lymphocyte. Jusqu à présent, aucune observation n a permis d attribuer un rôle précis à l IgD plasmatique, dont la concentration est d ailleurs faible. 5. IgE courte : 2,5 à 4 jours. De plus, une fraction importante de l IgE se trouve non pas dans le sérum mais leucocytes basophiles et les mastocytes (Fc RI). Ce récepteur reconnaît un site particulier des domaines C H 2 de l IgE. L antigène (allergène), en réagissant avec l IgE recouvrant les basophiles et les mastocytes, ponte les Fc RI, ce qui déclenche la dégranulation et la libération des médiateurs responsables des symptômes : c est l hypersensibilité immédiate (anaphylaxie, allergie). dans les infestations par des helminthes, et il a été bien démontré que les anticorps IgE sont nécessaires à l attaque de ces parasites par les leucocytes éosinophiles. Les éosinophiles contiennent dans leurs granules du parasite. Découverte de l IgE Nous verrons plus loin quels sont les mécanismes des réactions allergiques, découvertes au début du XXème siècle par Charles Richet et Paul Portier. La première indication qu un facteur sérique pouvait transférer l allergie nécessitant un traitement d urgence. Ramirez retrouve le donneur du sang transfusé à son patient et apprend poisson cru, tandis que Prausnitz ne l est pas. Une petite quantité ( l) de sérum de Küstner est injecté dans le bras de Prausnitz. Le lendemain, Prausnitz est testé avec 20 endroit. Pour la première fois de sa vie, il présente un test cutané positif au poisson, avec papule (oedème) et capable d entraîner une réaction cutanée immédiate. Ce facteur sera appelé plus tard réagine, par référence au fait qu il fait réagir la peau. Cette démonstration que le sang de sujets sensibles contenait une substance capable de ces réagines. En 1966 à Denver, Teruko et Kimishige Ishizaka travaillent avec des sérums de sujets allergiques au pollen d ambroisies (Ambrosia artemisiifolia, ragweed). Ils immunisent des lapins avec les sérums d un sujet fortement allergique. Ensuite ils épuisent cet antisérum avec des préparations d Ig de toutes les classes connues à l époque:

29 24 IgM, IgG, IgA et IgD. L épuisement consistait ici à faire passer l antisérum à travers des colonnes dans lesquelles étaient insolubilisées des immunoglobulines monoclonales (paraprotéines) de classes IgG, IgA, IgM et IgD. Les anticorps de l antisérum qui reconnaissent ces Ig sont retenus dans la colonne. L antisérum, après épuisement, réagissait encore avec des anticorps d un isotype inconnu. Lorsque cet antisérum était mélangé avec un peu de sérum d un individu allergique, la réaction de Prausnitz-Küstner n était plus observée. L isotype reconnu fut appelé IgE, par référence à l antigène E du pollen d ambroisies. Myélomes IgE Sans l apport des IgE monoclonales d origine myélomateuse, l étude de cette Ig aurait été impossible. donc s attendre à ce que les IgE monoclonales soient particulièrement rares. C est le cas, puisqu on n a recensé jusqu à présent que quelques dizaines de myélomes IgE dans le monde. Certaines souches de rat se caractérisent Louvain, car c est à la Faculté de Médecine de l UCL que, d une part, la souche a été développée, et que, d autre sécrètent de l IgE monoclonale. Table 1-3. Propriétés biologiques des Ig humaines Isotype Conc. sérique Demi-vie Réaction Activités leucocytaires déclenchées Passage (mg/ml) (jours) avec C1 par les anticorps transplacentaire IgA 2 6 Non Phagocytose Non IgM 1 5 Oui Non IgD traces 3 Non Non IgE < Non Dégranulation des mastocytes Non E. ANTICORPS MONOCLONAUX Fc en font un outil pour des applications de diagnostic, de thérapeutique ou de recherche. Comme nous l avons vu plus haut pour des lapins immunisés contre le pneumoccoque, les immunoglobulines produites en réponse à un antigène sont généralement hétérogènes et on parle de réponse oligoclonale ou polyclonale. Cette hétérogénéité a l avantage pour l organisme de faciliter certaines fonctions comme l opsonisation, plus homogène, constitué de molécules identiques et possédant toutes les mêmes propriétés biochimiques et biologiques. En 1975, Georges Kohler et Cesar Milstein ont obtenu, par fusion somatique d un myélome (plasmocytome) de souris avec des splénocytes de souris immunisées, des hybrides somatiques ou hybridomes, dont chaque clone produisait des molécules d anticorps identiques. Ces anticorps dits monoclonaux ont la même structure

30 contre un antigène donné. de plasmocytome. Celui-ci devait avoir perdu sa capacité de produire sa propre Ig monoclonale. En effet, le mélange aléatoire de chaînes H et L du plasmocytome avec celles des anticorps induits réduisaient à 1/4 les Les splénocytes ne prolifèrent pas spontanément en culture. Aussi, s ils n ont pas fusionné, ils disparaissent. Par contre, les cellules cancéreuses non fusionnées continuent à se multiplier, et gênent ainsi la croissance des hybridomes. Pour éviter cet inconvénient, on a sélectionné des cellules de plasmocytome qui, suite à des que l on appelle le salvage pathway ou voie de récupération. hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT), nécessaire à la récupération de la 6-thioguanine. L HGPRT la transforme en thio-gmp qui tue la cellule en inhibant la guanylate kinase et en HGPRT résistent à la 6-thioguanine puisque le thio-gmp ne peut se former. Les cellules HGPRT - ont besoin pour survivre de la voie de synthèse de novo des purines. Cette voie est bloquée par l aminoptérine, qui inhibe la dihydrofolate réductase, nécessaire pour obtenir du tétrahydrofolate à partir de l acide folique. L aminoptérine va aussi bloquer la synthèse du dttp, parce que le tétrahydrofolate intervient comme cofacteur pour la thymidilate synthétase. Des cellules HGPRT - vont donc mourir en présence d aminoptérine, parce qu elles ne peuvent plus utiliser ni la voie de synthèse de novo ni la voie de récupération pour la synthèse des purines. En plus, elles ne peuvent plus produire de dttp. Après une fusion cellulaire entre des cellules d un plasmocytome HGPRT - et des lymphocytes, on utilise la culture parce qu ils ne prolifèrent pas, et les cellules hybrides qui ont incorporé une partie du génome des HGPRT, continuent à proliférer grâce à la voie de récupération, 25 PURINES phosphoribosylpyrophosphate PYRIMIDINES carbamylphosphate glutamine FH4-CHO FH4 APRT : adénine phosphorybosyltransférase HGPRT : hypoxanthine guanine phosphorybosyltransférase TK : thymidine kinase TS : thymidilate synthétase DHFR : dihydrofolate réductase carbamylaspartate dihydroorotate aspartate FH4-CHO FH4 orotate FH4 aminoptérine DHFR FH2 FH4-CH3 OMP AMP IMP GMP dtmp TS dump UMP ADP GDP dudp UDP APRT HGPRT TK ATP datp GTP dgtp dttp dutp UTP CTP dctp Adénine Hypoxanthine Guanine Thymidine Fig Synthèse des nucléotides.

31 26 Hybridation cellulaire véritable fusion. On peut augmenter considérablement la fréquence de ce processus en traitant les cellules avec l hybride. La fusion (Fig. 1-17) est obtenue par addition de polyéthylène glycol (PEG) au mélange des cellules. Après de jours, les hybrides somatiques peuvent être facilement repérés parce qu ils sont les seuls à proliférer, puisque les lymphocytes de la rate ne se multiplient pas in vitro et que les cellules du plasmocytome non fusionnées sont tuées par l aminoptérine. On peut alors tester la capacité des anticorps présents dans le milieu de culture à reconnaître l antigène. Si le test est positif, les cellules sont soigneusement clonées, c est-à-dire que la suspension cellulaire est diluée tellement que, lors de l ensemencement, chacun des puits ne contient statistiquement qu une seule cellule au plus (voir le principe du clonage par dilution limite, chapitre 10). L hybridome producteur de de culture. Fig Obtention d anticorps monoclonaux. d intervalle, avec de l adjuvant, par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. Si le sérum contient des anticorps 15 j plus tard, une dernière injection est pratiquée par voie intraveineuse, ce qui augmente le nombre de lymphocytes immuns dans la rate. Après 3 ou 4 j, les splénocytes sont prélevés et mélangés dans 0,4 ml de milieu ( MOPC21 HGPRT - 5 cellules par puits). de On recherche les anticorps dans le surnageant des puits positifs, et les cellules correspondantes sont clonées, puis maintenues en culture.

32 27 3. Utilisation pharmaceutique reconnus comme étrangers et suscitent une réponse anticorps. Les anticorps humains anti-souris induits antigénique, qui est déterminée par les domaines variables, dérive de l ADN de souris ; son isotype, qui est déterminé par les domaines constants, dérive de l ADN humain. Etant donné que leurs domaines constants sont codés par des segments de gènes humains, ces anticorps chimériques sont beaucoup moins immunogènes, mais les régions variables de souris peuvent encore induire une réponse anticorps chez l homme. On peut encore réduire cette immunogénicité en remplaçant, Ac murin Ac chimérique Ac humanisé Ac humain... momab...ximab...zumab...mumab rituximab (Rituxan R ) anti-cd20 trastuzumab (Herceptin R ) anti-her-2/neu panitumumab (Vectibix R ) anti-egfr infliximab (Remicade R ) anti-tnf bevacizumab (Avastin R ) anti-vegf adalimumab (Humira R ) anti-tnf omalizumab (Xolair R ) anti-ige ipilimumab (Yervoy R ) anti-ctla-4 Fig Humanisation d anticorps monoclonaux. ou entièrement humains sont représentés schématiquement avec les régions d origine murine ou humaine représentées à son origine : momab pour un anticorps entièrement murin ; zumab pour un anticorps humanisé ; mumab pour un anticorps entièrement humain.

33 28 à l intérieur des domaines variables, les séquences qui codent pour les parties framework (ou chassis) par des reconnaissent l antigène, proviennent de la souris. On obtient alors un anticorps humanisé. En introduisant des mutations ponctuelles dans les séquences qui codent pour les boucles CDR, on peut encore parvenir à Une approche totalement différente pour produire des anticorps qui ne soient pas reconnus comme étrangers par le système immunitaire humain consiste à utiliser des souris dont les loci des chaînes lourdes et des chaînes légères des immunoglobulines ont été délétés et remplacés par de grands fragments du génome humain contenant des segments géniques de chaînes lourdes et de chaînes légères humaines. Lorsqu on les cette méthode est que ces anticorps totalement humains sont produits par des lymphocytes de souris dont des hybridomes sécréteurs d anticorps sont facilement obtenus par fusion cellulaire avec un plasmocytome murin. F. ÉVOLUTION DES IG aminés. L IgM, présente chez tous les vertébrés, est considérée comme l Ig la plus primitive. Parfois, elle a une chez certains crapauds. La première classe d Ig de petit poids moléculaire, autre que les monomères d IgM, apparaît chez les dipneustes, poissons avec poumons primitifs, précurseurs des amphibiens, qui ont aussi les la variété isotypique n est pas plus grande, tandis que chez les tortues, une troisième classe fait son apparition. Alors que tous les gnathostomes (vertébrés à mâchoires) possèdent des anticorps composés d associations de type IgG mais sans chaîne légère. Le site de reconnaissance de l antigène est donc entièrement contenu dans un seul domaine variable. certaines molécules d adhérence et divers récepteurs. L ensemble de ces protéines est groupé sous le nom de superfamille des immunoglobulines.

34 29 MHC de classe I MHC de classe II CD3 TCR CD3 CD4 CD8 CD28 Fig Membres de la superfamille des Ig. dont nous verrons le rôle plus loin, mais qui et qui contiennent des domaines d Ig. IgG 7 FcγRII ICAM-1 VCAM-1 p-igr

35 30 CHAPITRE 2. ANTIGÈNES ET RÉACTIONS AVEC LES ANTICORPS A. STRUCTURE DES ANTIGÈNES RECONNUS PAR LES ANTICORPS 1. Hétérogénéité par une immunoglobuline ou un récepteur de lymphocyte T. Parmi les molécules d antigènes reconnues par les anticorps, on trouve des protéines, des polysaccharides, des acides nucléiques, des phospholipides et une grande variété de molécules organiques. 2. Haptène et notion d immunogénicité Dans les années vingt, Karl Landsteiner a fait les constatations suivantes. - Une solution d acide sulfanilique injectée telle quelle à un lapin n induit pas d anticorps. d anticorps capables de précipiter toutes les protéines sulfanilées, quelle que soit l origine animale de ces protéines. - Si l on ajoute de l acide sulfanilique libre à ces anticorps, ils deviennent incapables de précipiter le conjugué. On pouvait en conclure que la précipitation était inhibée suite à la compétition entre l acide sulfanilique libre et les résidus sulfanilés du conjugué. Ce qui indiquait que les anticorps étaient bien dirigés contre l acide sulfanilique, mais que par ailleurs cette substance était incapable, à elle seule, d induire la production d anticorps. Ainsi est né le terme d haptène ( = je m attache), qui désigne toute substance reconnue par anglais carrier). Une molécule qui peut induire une réponse immunitaire est dite immunogène. Un haptène est donc un antigène mais pas un immunogène. 3. Taille et notion d épitope La réaction d anticorps avec des molécules de la taille de l acide sulfanilique (0,173 kda) a suggéré que, dans les antigènes macromoléculaires, les anticorps reconnaissaient une structure relativement petite, qui a été appelée, en 1929, déterminant antigénique. Nous utiliserons indifféremment les termes déterminant antigénique ou épitope, un terme introduit en 1960 par Jerne. Dans le cas de l acide sulfanilique, l épitope a Mais dans beaucoup d autres cas l épitope est nettement plus grand. Dans une protéine il peut comporter

36 31 2-1). Dans les oligosaccharides constituant les groupes sanguins AO, il comporte trois résidus d hydrates d une surface plane qui aura plusieurs points de contacts avec l épitope. Fig Inhibition par des oligosaccharides de la précipitation du dextran. L usage thérapeutique du peut induire la formation d anticorps et donner lieu à des accidents anaphylactiques. Elvin Kabat a recherché quel était le nombre minimum de résidus glucosidiques nécessaire à la on recommence en ajoutant des quantités croissantes des différents sucres, qui vont entrer en compétition avec le et l inhibition augmentait avec la taille de l oligosaccharide % INHIITION Isomaltoheptaose 7 6 Isomaltohexaose 5 Isomaltopentaose 4 Isomaltotétraose 3 Isomaltotriose 2 Isomaltose INHIITEUR (μmoles) 4. Rigidité pour être reconnu par l anticorps, doit avoir une structure rigide et stable. Ce qui peut être assuré par des HOOC COOH HOOC H HOOC H C C C C H C C H H H H COOH H COOH Acide maléique (cis) Acide fumarique (trans) Acide succinique Acides butène-dioïques Acide butane-dioïque Fig Effet d une double liaison sur la reconnaissance d une molécule par un anticorps. Dans une liaison saturée, différents. 5. Accessibilité t à la surface compétition entre peptides et protéine entre les antigènes protéiques et leurs anticorps peut être bien plus large et correspondre à une quinzaine de résidus.

37 32 un antisérum de lapin préparé contre de l albumine humaine chauffée pendant 30 min à 80 C à ph 7 reconnaît la protéine dénaturée mais peut ne pas reconnaître l albumine native. Inversement, l albumine dénaturée peut ne pas contre des Ig d une autre espèce ne réagissent avec les chaînes L des Ig que si celles-ci sont détachées des Fig 2-3. Epitopes continus ou discontinus au sein d une protéine. 6. Conformation Un épitope reconnu par un anticorps est une forme. La conformation de la protéine intervient donc dans ses caractéristiques antigéniques. C est pourquoi on distingue dans les protéines les épitopes continus segments ou boucles (Fig. 2-3).

38 33 par la chaleur ou des agents chimiques comme le formol. On parle alors d anatoxine. Cette inactivation est délicate, car une dénaturation trop poussée peut entraîner la destruction des épitopes discontinus et donc la perte des propriétés vaccinales. 7. Epuisement ou adsorption des antisérums Très souvent, un animal immunisé produit des anticorps non seulement contre l antigène principal mais également contre l un ou l autre contaminant présent à l état de traces ou contre des antigènes apparentés à l antigène principal. Ces anticorps non souhaités peuvent être une cause d erreur dans des dosages ou analyses, et il est souvent utile de les écarter, ce que l on peut faire en épuisant ou adsorbant l antisérum. En général on passe l antisérum à travers des colonnes d antigènes insolubilisés qui retiendront ainsi les anticorps indésirables. Lorsqu on veut épuiser un antisérum avec un autre antigène que celui qui a été utilisé pour l immunisation, cela ne sera utile que si l antisérum contient, à côté des anticorps contre l épitope commun, des anticorps dirigés contre des épitopes propres à l antigène ayant servi à l immunisation (Fig. 2-4). Si celui-ci ne possède totalement l antisérum. Ce sera le cas si l épitope partagé est identique. S il est simplement ressemblant, 8. Réactions croisées et parentés antigéniques Réaction croisée veut dire qu un anticorps préparé contre un antigène donné peut se lier à un autre antigène. Pour qu une réaction croisée survienne, une parenté antigénique, c est-à-dire une similitude de forme, doit dinitrophényle (Fig. 2-4). CH CH CH NH CO NH CO NH CO Fig Réaction d anticorps anti-dnp avec le groupement TNP. Les anticorps ont été induits par l injection d une

39 Une parenté antigénique s observe assez souvent avec des antigènes de grande taille comme une cellule, une contre l albumine bovine, il est possible que certains des anticorps produits réagissent avec de l albumine de d un tissu normal. Des parentés antigéniques ont ainsi été décrites pour des antigènes ciblés par des auto- sclérose en plaques, etc. Mais jusqu à présent aucune de ces observations n est totalement convaincante. 34. AFFINITÉ ET CINÉTIQUE DE LA RÉACTION ANTIGÈNE-ANTICORPS 1. Types de liaisons entre antigène et anticorps Antigène x Tampon neutre Tampon acide Antisérum Protéines + anticorps anti-y, z... Anticorps anti-x LIAISON LAVAGE ELUTION anticorps ainsi que toutes les autres protéines traversent la colonne sans être retenus. Ensuite les anticorps liés dans la colonne sont détachés, le plus souvent en diminuant le ph. Le type de liaison entre anticorps et antigène varie en fonction de la nature de l antigène (Fig. 2-6). Des antigènes électropositifs (polylysine) induisent préférentiellement la synthèse d anticorps de mobilité électrophorétique rapide (donc de charge nette négative). L inverse est vrai pour des antigènes électronégatifs (p-phénylarsonate).

40 35 de l antigène à l anticorps. Des solutions concentrées d urée (8 M) ou de chlorhydrate de guanidine (4 M) haptènes de caractère hydrophobe (stéroïdes), l élution des anticorps peut nécessiter des solvants organiques ou des détergents. Augmenter la température (37 à 45 ) et réduire la force ionique facilitent l élution. Ce type de liaison intéresse surtout les chaînes aliphatiques d acides aminés comme la leucine, l isoleucine, la Chaîne polypeptidique de l'antigène Chaîne polypeptique de l'anticorps Tyr Ser Glu Ile Val Trp CH 2 O H N CH 2 His N CH 2 O H O C CH 2 Asp Ponts hydrogène OH CH 2 CH 2 C O - NH + C NH2 NH (CH 2 ) 3 Arg O CH 3 Liaison électrostatique CH CH 3 CH 3 CH 3 CH 2 CH 3 CH CH 2 CH 3 CH CH 2 CH 3 CH 2 Ala Phe Leu Liaisons hydrophobes N Fig Exemples d interactions entre un anticorps et un antigène polypeptidique faisant intervenir les trois types possibles de liaisons. en considération que la réaction d un seul site. Comme toutes les réactions réversibles, la réaction antigèneanticorps Ag + Ac AgAc obéit à la loi d action des masses, avec vitesse d association = ka[ag][ac], vitesse de dissociation = kd[agac], ka et kd étant les constantes de vitesse d association et de dissociation et à l équilibre, ka[ag][ac] = kd[agac]. Ka = [AgAc] ka ou [Ag][Ac] kd où [AgAc] est la concentration molaire en antigène lié ou en site d anticorps occupé, [Ag] la concentration molaire d antigène libre et [Ac], la concentration molaire de sites d anticorps libres.

41 36 situent généralement entre 10 5 et 10 9 litres/mole ou M -1 il détermine la concentration d anticorps nécessaire à l élimination in vivo de l antigène. a = 10 5 M -1. Une concentration de -5 M (puisque le poids moléculaire des anticorps de classe IgG est de 150 kda), correspond donc à 10-5 égale à a = 10 5 M -1 et [Ac] = M, et que la concentration en haptène reste nettement -9 9 M -1. Avec une concentration de sites -7 M, l haptène restant à Mesure de la constante d association des anticorps passer l antigène de petite taille mais pas les anticorps. On utilise un antigène radioactif pour pouvoir déterminer quelle quantité est présente de chaque côté de la membrane de dialyse. Si l antigène est seul, il même concentration d antigène libre, et le compartiment contenant l anticorps contient en plus une certaine concentration d antigène lié. on peut dresser une courbe de saturation (Fig. 2-7). La concentration d antigène lié augmente avec la concentration d antigène libre jusqu à atteindre un plateau correspondant à la saturation de l anticorps. Si la lié, de connaître la valence de l anticorps. Cette concentration molaire d anticorps peut être connue pour molaire en sites d anticorps.

42 37 A A [Ag] A Etat initial Equilibre Temps (h) A A 100 [Ag] 50 Ag lié à l anticorps A Ag libre Etat initial Equilibre Temps (h) Concentration d'antigène lié mi-saturation Concentration d'antigène libre [AgAc] [Ag] K a [Ac tot] Représentation selon Scatchard: pente = -K a [Ac tot] [AgAc] Fig Dialyse d équilibre et courbe de saturation d un anticorps par son antigène. A mi-saturation des sites, c est-à-dire quand [AgAc] = [Ac] ou [AgAc] = 1, [Ac] Ka = 1 [Ag] La constante d association est donc égale à l inverse de la concentration d antigène libre correspondant à La plupart des constantes d association d anticorps ont été établies sur la base d interactions avec des

43 38 transformation de l équation d équilibre, [AgAc] = K [Ag] a[ac] dans laquelle [Ac] est remplacé par [Act] - [AgAc] l antigène libre en fonction de la concentration d antigène lié. [AgAc] = K a[act] - Ka[AgAc] [Ag] [AgAc] dans le système de chambre de dialyse décrit plus [Ag] haut en conservant la même concentration d anticorps total [Act] mais en modi tités d antigène total. Pour un anticorps monoclonal, en représentant les résultats en graphique, on obtiendra une droite dont la pente sera égale à -K a. on obtient une valeur de [AgAc] = K a [Act]. [Ag] Si on [AgAc] tend vers 0, [Ag] [AgAc] est égale à [Act]. Fig Calculs selon trois anticorps monoclonaux et d anticorps polyclonaux dirigés contre l hormone de croissance (hgh). Les anticorps, insolubilisés par adsorption dans les puits d une plaque de microtitrage en plastic, sont incubés avec l antigène marqué à l iode radioactif. Dans les puits tous couverts de la même quantité d anticorps sont [AgAc] [Ag] K a [Act] 10D5 3C11 pente = -K a 10D [AgAc] (x 10-9 M) [Act] [AgAc] [Ag] POLYCLONAL [AgAc] (x10-9 M) la quantité totale d antigène introduit [Ag + AgAc], on calcule [Ag]. Les résultats sont reportés sur un graphique selon Scatchard, avec [AgAc] en fonction de [AgAc]. La pente des droites correspond à la constante d association. [Ag] 7 M -1, 11,1 7 M -1 7 M -1.

44 39 4. Cinétique de la réaction antigène-anticorps La vitesse d association, qui est proportionnelle à la concentration d antigène et d anticorps, est nettement constantes de vitesse d association et de dissociation et que la constante de vitesse d association varie peu pour des antigènes de même taille, la valeur de K dépend surtout de la vitesse de dissociation. Ce qui à certaines contraintes stériques, l interaction simultanée de toutes les valences n est pas toujours possible. A Fig Avidité des anticorps. Comparaison de la liaison d un antigène porteur de déterminants antigéniques répétitifs par une immunoglobuline monomérique (A) ou pentamérique (). La stabilité de l interaction globale entre antigène et Ig nécessaires pour que l Ig pentamérique se détache de l antigène. La résonance des plasmons de surface (Surface Plasmon Resonance, SPR) permet de mesurer en temps réel des antigène-anticorps. Cette technique optique utilise le phénomène d onde évanescente pour mesurer les changements d indice d or d épaisseur variant de 2,5 à quelques dizaines de nm peuvent être utilisés. Le phénomène de résonance (pas de réfraction parce que l angle d incidence est plus grand que l angle limite de réfraction), frappe une le verre (indice de réfraction élevé) et l air (indice de réfraction bas) dans la Fig A, le verre et un liquide dans la Fig A un angle d incidence du faisceau qui dépend du métal utilisé, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l onde évanescente, se propage perpendiculairement à l interface sur une distance équivalente à sa longueur d onde. La zone balayée par l onde est appelée champ évanescent. L onde évanescente entre en résonance avec les électrons délocalisés de la couche électronique périphérique du métal l angle de résonance. Il varie en fonction de l indice de réfraction du milieu présent dans le champ évanescent.

45 40 A air Plasmons de surface métal 50 nm verre Rayon incident Rayon réfléchi Circuit microfluidique or verre lumière polarisée incidente prisme 1 2 capteur Intensité lumière réfléchie 1 2 laser Détecteur: barette de diodes Angle C 800 Resonance Unit C = 100 K D C = 10 K D C = K D C = 0.1 K D Equilibre Saturation 0 0 Ligne de base Temps (sec) Fig Résonance plasmonique de surface. A. supérieures à l angle limite de réfraction du dioptre verre-air. Donc dans tous les cas il n y a pas de réfraction et. Capteur biologique d un appareil de résonance plasmonique de surface, en place dans l appareillage de mesure. C. Sensorgrammes des interactions ligand-analyte pour des injections de 4 concentrations (C) différentes d un même analyte. interactions ligand-analyte à la surface du capteur. Ce capteur est un support en verre recouvert d or (50 nm)

46 41 ligand, le plus souvent une protéine. Le capteur est pris en sandwich entre un prisme de verre et un circuit 2 de résonance en fonction du temps lors d une injection d analyte dans le capteur (Fig C). Lorsqu on immobilisés. A remarquer que la lumière ne pénètre pas jusqu à l échantillon, c est pourquoi les analyses peuvent être réalisées sur des échantillons opaques, colorés et turbides. C. MISE EN ÉVIDENCE DE LA RÉACTION ANTIGÈNE-ANTICORPS : TESTS IMMUNOLOGIQUES tests immunologiques. - soit de rechercher la présence d anticorps contre un antigène particulier dans le sérum d un individu. des antigènes de groupes sanguins. Dans ce cas, on doit disposer d une source d anticorps pour réaliser le test. L interaction des anticorps avec leur antigène peut être suivie par marquage de l un des partenaires de la 1. Précipitation La liaison des anticorps à leur antigène peut se manifester in vitro par une précipitation si l antigène est soluble. Lorsque à un volume donné d antisérum sont ajoutées des quantités croissantes d une solution peut devenir visible au bout de quelques minutes, parfois de quelques heures, ou n apparaître qu à froid.

47 42 A 15 Equivalence Précipité (μg protéine) 10 5 Excès d'anticorps Excès d'antigène Anatoxine ( μg) 8 10 Excès d'anticorps Equivalence Excès d'antigène C Anticorps divalent Porteur + haptènes Précipité Haptène Haptène (μg/ml) Fig Réaction de précipitation. A.. C. Dosage d un haptène par son activité inhibitrice sur la précipitation d une macromolécule porteuse de résidus hapténiques par des anticorps anti-haptène. La formation du précipité est due à la constitution d un réseau dont la stabilité dépend des proportions l anticorps avec une molécule qui n est pas liée à un autre anticorps. Dans cette zone, la composition des On peut mesurer la quantité de précipité par turbidimétrie, qui mesure l absorbance dans l infrarouge, ou par néphélométrie, qui mesure la diffraction de la lumière, celle-ci étant proportionnelle au carré de la masse des particules. Ces techniques sont utilisées en biologie clinique pour le dosage des principales protéines du sérum. l antigène. On peut utiliser un anticorps monoclonal si celui-ci reconnaît un épitope qui est présent à plus

48 43 du conjugué haptène-protéine, la quantité de précipité sera inversement proportionnelle à la concentration en haptène libre. Antigène: myoglobine myoglobine hémoglobine Anticorps: polyclonaux monoclonal monoclonal précipitation pas de précipitation précipitation Fig Précipitation de complexes Antigène-Anticorps. La précipitation nécessite soit la reconnaissance de plusieurs et la répétition de l épitope sur l antigène. 2. Agglutination La liaison des anticorps à leur antigène peut se manifester par une agglutination si l antigène est particulaire, comme des globules rouges, des bactéries, ou de minuscules billes de polystyrène (1 micron de diamètre), couvertes d un antigène. Les particules forment alors des agrégats visibles à l œil nu. Une application importante est l hémagglutination Pour le titrage d anticorps, les particules sont incubées avec des dilutions croissantes de la solution d anticorps, d anticorps, l agglutination ne survient pas ou est plus faible. On parle alors de prozone. Ce phénomène

49 44 pour des résultats faussement négatifs. Certains anticorps, dits complets, agglutinent directement les particules porteuses d antigène. Ce sont des anticorps (IgM) qui doivent à leur grande taille et à leur nombre de valences plus élevé de pouvoir établir petite, sont moins agglutinants, surtout si la densité des antigènes à la surface des particules est faible. Pour détecter ces anticorps dits incomplets, il faut utiliser un second anticorps (réaction indirecte) qui se lie au premier (Fig. 2-13), et facilite ainsi l agglutination. Ce second anticorps est appelé réactif de Coombs. IgG IgM Ac2 Fig Réaction d agglutination. À gauche, agglutination directe par des anticorps IgM complets. À droite, agglutination lapin dirigé contre les IgG humaines. Nous verrons plus loin ce que sont les antigènes appelés AO et Rh, présents sur les globules rouges et très importants pour l appariement des groupes sanguins pour les transfusions. L hémagglutination est utilisée pour détecter les antigènes présents sur les globules rouges : des globules rouges de l individu à tester sont mélangés sur une lame de verre avec des sérums qui contiennent des anticorps contre l un ou l autre antigène. Une agglutination, visible à l oeil nu, indique la présence de l antigène correspondant sur les globules rouges. On peut aussi détecter la présence d anticorps chez un individu : dans ce cas, on mélange son sérum avec différents types de globules rouges, porteurs de l un ou l autre antigène. Dans ce cas, l agglutination indique la présence dans le sérum d anticorps contre l antigène en question. 3. Mise en évidence au moyen de marqueurs des enzymes ou des particules, la lecture se faisant au moyen d instruments fournissant des résultats qualitatifs ou quantitatifs (Table 2-1).

50 45 l ordre de 1 μg/ml, les techniques utilisant des marqueurs ont des seuils de détection d environ 0,1 ng/ml (10-10 g/ml). immunohistochimie (repérage d antigènes sur des coupes de tissus) mais aussi pour des dosages d anticorps ou d antigènes dans le sérum. Table 2-1. Mise en évidence de la réaction antigène-anticorps par marqueurs Marqueurs Instruments Applications Radio-isotopes : 125 I, 3 H, etc. Compteurs et RIA, autoradiographie, western blot Micr. optique ou électronique Trieur de cellules Caractérisation de cellules Fluorimètre Dosages Photomètre ELISA et Western blot Or colloïdal Micr. électronique et optique Immunohistochimie Dosage radio-immunologique (Radioimmunoassay : RIA) En 1965, les dosages radio-immunologiques (radioimmunoassay, RIA) des hormones furent introduits par élargissant le spectre des substances dosables et en permettant d uniformiser les techniques de dosage. Par les hormones thyroïdiennes ; en cancérologie, l -fœtoprotéine ou l antigène carcino-embryonnaire ; en hématologie, la ferritine et la vitamine 12 ; en pharmacologie, des médicaments à la posologie délicate demi-vie relativement courte des marqueurs radio-isotopiques, ils sont de plus en plus souvent remplacés techniques d agglutination avec lecture instrumentale. Le RIA reste utilisé pour le dosage d antigènes (hormones, protéines virales, médicaments), en utilisant un principe de compétition qui a été proposé dans les années 60 par les endocrinologistes erson et Yalow. (Fig. 2-14). La compétition s opère entre l antigène à doser et un antigène marqué dont la concentration l antigène à doser, ou des anticorps anti-ig, sont insolubilisés par couplage à la surface de godets d une plaque de microtitrage. Après une incubation de plusieurs heures, le simple lavage de ces surfaces élimine

51 46 courbe d étalonnage établie préalablement avec diverses quantités connues d antigène non marqué. Ce type anticorps, et pour lesquels l ELISA sandwich (voir plus bas) est donc impossible. A Anti-HsAg 125 I-HsAg Sérum non infecté 125 I-HsAg Sérum infecté, contenant HsAg radioactivité liée au puits (%) Partie de la courbe approximativement linéaire niveau maximal de 125 I lié diminution de 125 I lié [HsAg] (ng/ml) Fig Radio-immunodosage en phase solide pour la détection du virus de l hépatite dans les prélèvements sanguins. A. l HsAg, l antigène de surface des virions de l hépatite. Un échantillon de sérum et du HsAg marqué à l iode-125 sont ensuite mélangés et ajoutés. Après incubation, le surnageant est éliminé et la quantité de radioactivité liée à l anticorps est déterminée. Si le prélèvement est infecté, la quantité de marqueur lié sera inférieure à celle du témoin avec un sérum non infecté.. Une courbe standard est obtenue en ajoutant des concentrations croissantes d HsAg non marqué à une quantité 125 de la concentration d antigène non marqué, la concentration de l HsAg dans les échantillons de sérum inconnu peut être déterminée en utilisant la partie linéaire de la courbe. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) L ELISA dépend d un enzyme et non pas d un marqueur radioactif. Un enzyme conjugué à un anticorps réagit avec un substrat incolore pour donner un produit de réaction coloré. Un tel substrat est dit chromogène. de raifort et la ß-galactosidase. De nombreuses variantes d ELISA ont été développées, pour doser des ELISA indirect Un anticorps peut être détecté ou dosé grâce à un ELISA indirect. Le sérum, ou tout autre échantillon, contenant un anticorps primaire (Ac1) est déposé dans un puits d une plaque de microtitration où est adsorbé l antigène; Ac1 réagit alors avec ce dernier. Après que l Ac1 non lié ait été éliminé par lavage, la présence d Ac1 lié à l antigène est détectée en ajoutant un anticorps secondaire qui peut se lier à l anticorps primaire et qui est couplé à un enzyme. Les anticorps secondaires sont des anti-ig humaines obtenus chez l animal (lapin, chèvre). des régions constantes de la chaîne ou des Ig. L Ac2 libre est éliminé par lavage et un substrat de l enzyme est ajouté. La quantité de produit coloré de la réaction qui se forme est mesurée par un lecteur de plaque spectrophotométrique approprié, qui mesure l absorbance de tous les puits d une plaque de 96 puits.

52 E E 47 l HIV sont adsorbées en tant qu antigènes en phase solide dans les puits d une plaque de microtitration. Les individus infectés par l HIV produisent des anticorps sériques contre les épitopes de ces protéines virales. semaines qui suivent l infection. ELISA indirect S S E E lavage lavage Puits avec l'antigène adsorbé Ajouter l'anticorps spécifique à mesurer Ajouter l'anticorps secondaire conjugué à un enzyme Ajouter le substrat (S) et mesurer l'intensité de la coloration ELISA sandwich S S E E E E lavage lavage lavage Puits avec l'anticorps adsorbé Ajouter l'antigène à mesurer Ajouter l'anticorps secondaire conjugué à un enzyme Ajouter le substrat (S) et mesurer l'intensité de la coloration Fig Dosage d anticorps par la technique ELISA. (ELISA indirect) ou un antigène (ELISA sandwich). Chacune de ces méthodes peut être utilisée qualitativement (détection: présence ou absence de l anticorps ou antigène) ou quantitativement (dosage). Pour un dosage il faut comparer le résultat La mesure est effectuée par un spectrophotomètre qui détecte l absorption de la lumière à une longueur d onde donnée, test sont identiques. ELISA sandwich Cette technique est souvent utilisée pour détecter ou doser des antigènes. Elle n est applicable qu à des antigènes porteurs de plusieurs épitopes différents. Ici c est l anticorps, et non pas l antigène, qui est immobilisé dans un puits de microtitration. Un échantillon contenant l antigène est ajouté; il réagit avec épitope différent de l antigène, est ajouté; il réagit avec l antigène lié. Après que le second anticorps libre ait été éliminé par lavage, le substrat est ajouté et le produit de la réaction coloré est mesuré. Le dosage avec

53 48 indispensable dans les techniques de compétition et dont la préparation peut être laborieuse. L inconvénient de la méthode avec double anticorps est la limitation de son application à des antigènes porteurs de plusieurs Table 2-2. Exemple de mise au point d un ELISA pour doser des IgG humaines. Densité Optique Concentrations des étalons (ng/ml) IgG IgA ,956 1, ,950 0, ,845 0, ,523 0, ,834 0,268 3,3 0,498 0,245 1,1 0,265 0,243 Densité optique IgG IgA 0,3 0,251 0,233 0,1 0,242 0, Concentration (ng/ml) La surface des cupules est couverte d anticorps de lapin anti-igg humaines. Ensuite incubation avec des étalons d IgG ou d IgA humaines à des concentrations décroissantes. Après lavage, incubation avec des anticorps de lapin anti-igg humaines marqués par l enzyme. On voit que les anticorps marqués anti-igg humaines ne sont communs à l IgG et à l IgA. Il ne peut s agir que de la chaîne légère, seule structure commune sur le plan ELISPOT l antigène (antigène de capture) reconnu par l anticorps auquel on s intéresse, soit l anticorps (anticorps de ensuite ajoutée à ces plaques qui sont mises à incuber. Les cellules se disposent sur la surface de la plaque et les molécules sécrétées, qui sont susceptibles de réagir avec les molécules de capture, se lient à ces dernières Le développement ultérieur du dosage par addition d un substrat approprié, chromogène ou producteur de chimioluminescence, révèle la position de chaque cellule productrice d un anticorps ou d un antigène sous

54 49 Fig Dosage ELISPOT. pour la détection de cellules qui sécrètent (S) une cytokine. Les cellules qui ne sécrètent pas (NS) la cytokine en question ne donnent lieu à aucun signal. Les anticorps «de capture» et «de la cytokine. En comptant le nombre de taches colorées, il est possible de déterminer combien de cellules sécrétrices de cytokine étaient présentes dans la suspension cellulaire ajoutée. CS: substrat chromogène soluble, CP: produit coloré insoluble. S NS Puits avec l'anti-cytokine adsorbé S NS Incuber à 37 C Ajouter la population de cellules à tester Eliminer les cellules, Laver la plaque Ajouter l'anticorps anti-cytokine lié à un enzyme CS CS E E E CP CP phycoérythrine, une protéine d algues. Les suspensions de cellules ou les coupes de tissu sont incubées avec d un dispositif optique qui arrête la lumière transmise à travers la coupe mais laisse passer la lumière émise de la lumière incidente diffusée par la cellule, ce qui donne une information indirecte quant à sa taille. Les

55 nécessaire, isolées (Fig. 2-18). 50 Les anticorps dirigés contre l antigène à repérer sont directement couplés à des ou sont révélés par des anticorps anti-ig marqués. La technique est appliquée à des cellules isolées et vivantes (coloration limitée à la membrane) ou à des coupes ou la moins dénaturante possible. solution tampon saline laser collier de charge électrique plaques de déflection tubes de récupération échantillon - déchet + système de vibration miroirs dichroïques diffusion aux petits angles (TAILLE) fluorescence rouge fluorescence verte diffusion à 90 (GRANULOSITE) (Fluorescence Activated Cell Sorter ou FACS). Les dont la diffusion permet des mesures indirectes de la taille et de la granularité des cellules. Ces mesures sont faites à des longueurs d onde identiques à celles de la lumière incidente (généralement une raie à 488 nm d un laser Argon). Lorsque la cellule est marquée par des colorants ou 575 nm pour la phycoérythrine. Après passage par chaque longueur d onde. Ce qui permet la mesure de une même cellule. Le jet de liquide contenant les cellules est fractionné en gouttelettes par la vibration d un cristal piézoélectrique intégré dans la buse d éjection. Le débit cellules/sec, soit une cellule toutes les 10 gouttes. Une différence de potentiel est appliquée à la suspension, ce qui va charger électriquement les gouttelettes peu avant leur formation et permettre ainsi leur séparation dans un champ électrique. Immunohistochimie Pour la mise en évidence d antigènes sur des coupes histologiques, on utilise des anticorps couplés à des enzymes, comme dans les tests ELISA. Après incubation de la coupe avec ces anticorps, on lave la coupe et on l incube avec le substrat de l enzyme, qui révèlera une coloration à l endroit de la coupe où l anticorps

56 51 Western lot préparation contenant les antigènes dans un gel qui va séparer les protéines selon leur taille (Fig. 2-19). Après électrophorèse, une feuille de nitrocellulose est appliquée sur le gel, d où les protéines sont transférées sous La réaction avec le substrat fait apparaître des bandes colorées. Si le marquage est radioactif, les bandes sont autoradiographie). La position de chaque bande est fonction de la taille de la protéine correspondante. Une application classique du Western blot en déterminer si le patient possède des anticorps contre une ou plusieurs protéines virales. électrophorèse en gel transfert sur filtre de nitrocellulose autoradiographie ou révélation de l'enzyme-marqueur incubation du filtre avec anticorps marqués PM (kda) Fig Western blot. filtre gel électrodes

57 52 CHAPITRE 3. DÉVELOPPEMENT DES LYMPHOCYTES A. NOTIONS GÉNÉRALES Avant de poursuivre l analyse des interactions entre les anticorps et leurs antigènes, précisons quelques notions générales. L étude des anticorps a rapidement mis en évidence reconnaissent cet antigène mais pas un autre (sauf si ce dernier est apparenté au premier). L observation ou des bactéries, simples comme le dinitrophénol ou l acide sulfanilique. De plus, on observe que l on d oeuf, mais une poule n en produira pas. Quantité d'effecteurs Réponse secondaire anti-x Réponse primaire anti-x Réponse primaire anti-y Antigène X Antigène X Antigène Y Temps (semaines) Fig Développement de la réponse immunitaire. Par effecteurs, on peut entendre aussi bien la quantité d anticorps, que le nombre de lymphocytes ou de lymphocytes T. La notion de mémoire est la suivante. La réponse immunitaire observée lorsqu un organisme est mis en contact avec un antigène pour la première fois porte le nom de réponse primaire. Celle que fera le même organisme suite à un contact ultérieur avec le même antigène est appelée réponse secondaire. Celle-ci est plus l élimination de l agent pathogène. Une réponse de type secondaire a lieu même lorsque le temps écoulé

58 53 observée que lorsque l antigène injecté la seconde fois est le même que le premier, mais elle ne requiert pas systémique. 2. Sélection clonale Comment concilier toutes ces observations? Le premier qui proposa un modèle cohérent, vers 1950, est Introduction de l'antigène, et réponse primaire Introduction de l'antigène, et réponse secondaire cellule souche lymphocytes précurseurs lymphocytes activés lymphocytes mémoire lymphocytes activés Fig Sélection clonale. antigènes potentiels. Les cellules porteuses d un récepteur qui reconnaît un antigène du soi sont éliminées. L introduction d un antigène étranger est suivie de l activation et de la prolifération de la cellule porteuse du récepteur correspondant. Parmi les cellules qui résultent de cette prolifération, certaines vont persister dans l organisme. Ce sont les lymphocytes mémoire, qui peuvent à leur tour être activés et proliférer lors d une nouvelle immunisation contre le même antigène. Dans le cas des lymphocytes, le récepteur à l antigène est un anticorps, qui est sécrété par les cellules activées. Dans le cas des lymphocytes T, le récepteur à l antigène n est pas sécrété. moléculaire identique à celle des anticorps qui seront produits plus tard contre cet antigène. Le répertoire avec ces antigènes. - Lors d une immunisation primaire, les récepteurs de certains lymphocytes vont se lier à l antigène. Ce qui a pour conséquence de stimuler la prolifération de ces lymphocytes. La population de cellules obtenue au départ de la prolifération d un seul lymphocyte s appelle un clone. Nous aurons donc une sélection clonale des lymphocytes porteurs des récepteurs adaptés à l antigène.

59 54 - Ces clones lymphocytaires vont non seulement proliférer mais également se différencier en cellules antigénique correspondant à son récepteur. - Lorsque la stimulation antigénique cesse, certaines cellules des clones lymphocytaires sélectionnés retournent à l état non-proliférant des précurseurs. Ce sont les lymphocytes mémoire. Leur nombre accru par - Lors d une immunisation secondaire, ces lymphocytes mémoire se remettent à proliférer et à se différencier en cellules productrices d anticorps. La théorie de la sélection clonale posa d emblée un problème, qui n échappa d ailleurs pas à urnet. Si tous les récepteurs possibles sont générés dans le répertoire, comment éviter que certains de ces récepteurs reconnaissent nos propres antigènes, c est-à-dire les constituants de notre organisme? urnet conçut l idée que, lors de la différenciation des lymphocytes, les cellules qui portaient un récepteur reconnaissant un susceptibles de reconnaître des antigènes étrangers. C est ce qu il a appelé la délétion clonale. Ici aussi, la c est-à-dire le fait que nous ne réagissions pas contre nos propres antigènes, sauf dans les maladies dites auto-immunitaires. Le principe essentiel de la théorie de la sélection clonale est que des lymphocytes précurseurs portant des récepteurs dirigés contre un antigène sont présents dans l organisme avant tout contact avec cet antigène. Ceci peut être démontré de la façon suivante (Fig. 3-3). Des lymphocytes isolés de la rate de souris normales ont été déposés sur des colonnes contenant un antigène insolubilisé: de l albumine bovine ou des Ig bovines (Fig. 3-3). Les antigènes insolubilisés peuvent retenir dans la colonne les lymphocytes qui les reconnaissent par leurs immunoglobulines de surface. Les lymphocytes qui ont traversé la colonne, c est-à-dire qui n y ont pas été retenus, ont été injectés à des souris ont produit des anticorps contre des Ig mais pas contre l albumine. Dans le cas où la colonne contenait des colonne qui contenait l antigène correspondant. naïves, c est- de l albumine humaine marquée à l iode 125 lymphocytes ont servi à rétablir on dit généralement reconstituer - le système immunitaire de souris dont la

60 immunisés contre divers antigènes, ils se sont avérés incapables de produire des anticorps contre l albumine humaine, alors qu ils répondaient à d autres antigènes. 55 rate lymphocytes SA (ovine Serum Albumin) GG (ovine Gamma Globulins) iv iv iv SA GG SA GG SA GG Production d'anticorps Fig Expérience montrant l existence de lymphocytes tout contact avec celui-ci.. GÉNÉTIQUE DES IMMUNOGLOULINES Les lymphocytes se différencient dans la moelle osseuse, au contact des cellules stromales et sous l action de diverses cytokines, à partir de cellules souches dite lymphoïdes. Au cours de cette maturation, survient ce que l on appelle le réarrangement des gènes d immunoglobulines. lourdes et des chaînes légères d immunoglobulines. Or, comme nous sommes capables de produire des anticorps dirigés contre à peu près n importe quelle substance, le répertoire contiendrait de 10 6 à de séquences peptidiques différentes, et donc un très grand nombre de séquences nucléotidiques différentes, si l on admet les données de base de la génétique moléculaire disant que toute séquence de protéine est avancées. Nous verrons que chacune contenait une part de vérité. Présence de tous ces gènes dans la lignée germinale. Dans cette hypothèse, on supposait que tous les gènes d Ig étaient présents dans la lignée germinale, c est-à-dire dans les gamètes, dans le zygote et par conséquent dans toutes les cellules, y compris les

61 56 des produits de gènes de chaînes H et de gènes de chaînes L aboutirait ainsi à un million d anticorps. Une chaîne L étant faite de 210 acides aminés et une chaîne H de 450, l ADN correspondant contiendrait au moins 0,6 et 1,3 kb ou près de kb pour gènes, c est-à-dire moins d un millième du génome haploïde d un mammifère, estimé généralement à kb. Cette hypothèse n était donc pas absurde. Création de la diversité par recombinaison. des recombinaisons somatiques ou réarrangements, c est-à-dire des transferts de segments d ADN qui surviendraient non pas dans les cellules germinales mais dans les lymphocytes. Dans ce cas, le nombre de gènes des chaînes H et L dans la lignée germinale et donc dans les précurseurs lymphocytaires serait relativement faible. À un moment de la différenciation d un lymphocyte, une recombinaison entre segments A et 33 segments pour produire gènes de chaînes H. Si on y ajoute le même nombre différents. Création de nouvelles séquences par mutation. Des mutations, dites somatiques parce que survenant ailleurs que dans la lignée germinale, constituent la base de la troisième hypothèse, Cette théorie impliquait qu à un certain moment de la différenciation des diversité des anticorps. 1. Découverte du réarrangement des gènes d Ig Dès les années 60, on avait constaté des recombinaisons entre allotypes de parties variables et de parties constantes. Cette observation impliquait que les séquences d ADN correspondantes étaient séparées par au moins 0,3 centimorgans ou 900 kb, alors que la longueur de la plupart des gènes se situe entre 1 et 10 kb. et constante, étaient contigus (Fig. 3-4). Il fallait donc imaginer soit qu une très longue séquence nucléotidique était éliminée lors de la maturation de l ARN nucléaire en ARN cytoplasmique suite au processus d épissage (en anglais, splicing), soit qu une recombinaison somatique était survenue au niveau de l ADN. En 1976, Tonegawa a démontré que les régions V et C d une chaîne L étaient codées par des segments d ADN qui étaient largement séparés dans toutes les cellules sauf dans les lymphocytes, où un réarrangement cellules non lymphocytaires après digestion au moyen d une enzyme de restriction. Les fragments obtenus ont

62 57 5' 5'UT V C 3'UT AAAA-3' 150 nt 51 (signal) nt 321 nt 200 nt séquences nucléotidiques traduisibles en séquences connues de parties variables d'immunoglobuline séquences nucléotidiques traduisibles en séquences connues de parties constantes d'immunoglobuline Fig Structure d un ARNm d une Ig. nt : nucléotides; 5 UT et 3 UT (untranslated) : régions régulatrices en 3 et 5, non traduites. Milstein a isolé l ARNm d une chaîne L d un plasmocytome de souris et a synthétisé l ADN complémentaire (ADNc) au moyen d une amorce constituée d une dizaine de nucléotides dt. Cet oligo-dt, apparié à la zone poly-a, servait de point de départ à l action de la transcriptase réverse. En séquençant l ADNc, Milstein a repéré, sur la base de la séquence peptidique déjà connue, les séquences nucléotidiques qui au sein de cette molécule unique, 5' V C Synthèse ADNc: AAAA 3' ARNm TTTT sonde C sonde V+C ADN d'embryon - sonde C sonde V+C 10 kb 6 kb amh1 + ADN de MOPC kb amh1 + DIGESTION SEPARATION HYRIDATION Fig Détection par Southern blot du réarrangement des segments de gènes d une chaîne L. L ARNm de la à partir d amorces poly-t et sont marquées par incorporation de nucléotides radioactifs. L ADN est digéré par une enzyme de restriction, et les fragments séparés selon leur taille par électrophorèse en gel d agarose. Après transfert sur qui leur sont complémentaires dans l ADN dénaturé. Après lavage, la membrane est séchée et mise au contact d un

63 58 fragments d ADN dénaturé, c est-à-dire monocaténaire ou monobrin. La première sonde était une molécule l autoradiographie n a mis en évidence qu une seule bande aussi bien avec la première sonde qu avec la seconde. Ce qui indiquait que dans l ADN des lymphocytes il n y avait pas de sites de restriction pour l enzyme utilisée entre les séquences V et C. Par contre, à l analyse de l ADN des cellules non lymphocytaires, la sonde V + C C n en donnait qu une. Il y a donc au moins un site de restriction présent entre les séquences V et C dans cet ADN. Le même genre de résultat fut obtenu avec d autres enzymes de restriction. 2. Encodage de la région V par plusieurs segments d ADN réarrangés aminés, soit la plus grande partie du domaine variable. Le segment J (pour jonction) code pour la dizaine d acides aminés restants. Ces séquences J sont proches de celles qui codent pour la région constante. La partie intermédiaire correspond à un intron qui sera éliminé lors de l épissage de la molécule d ARN nucléaire. ADN germinal recombinaison somatique ADN réarrangé transcription V J C introns exons ARNm nucléaire épissage AAAA ARNm cytoplasmique AAAA traduction Protéine V L C L Fig Synthèse d une chaîne L. La J, auquel il sera accolé lors de l épissage. L Ig étant destinée à la sécrétion ou à la membrane, la séquence nucléique de la chaîne L, comme celle de la chaîne H, débute par une séquence signal codée par Pour la région variable de la chaîne lourde, intervient un segment supplémentaire, appelé D pour diversité, l épissage de l ARN nucléaire. Les différents domaines de la région constante d une chaîne lourde sont codés

64 59 ADN germinal recombinaison somatique V D J C ADN réarrangé DJ recombinaison somatique ADN réarrangé VDJ transcription ARNm nucléaire AAAA épissage ARNm cytoplasmique AAAA traduction C H 3 C H 2 C H 4 Protéine V H C H 1 Fig Synthèse d une chaîne H. par épissage. ou J. Chaque copie est légèrement différente des autres. L organisation précise de ces familles diffère pour chaque chaîne d Ig (Fig. 3-8). Pour la chaîne légère, il y a un groupe de V, puis un groupe de J, et un seul C. Pour la chaîne légère, le groupe de V est suivi de quatre paires J - C. Pour la chaîne lourde (chaîne H), le groupe de V H est suivi d un groupe de D, puis d un groupe de J H, et H. Pour les segments V, chacun est précédé d un promoteur. Chaîne (chromosome 2) V 1 V 2 V 40 J 1 à J 5 C Chaîne (chromosome 22) V 1 V 2 V 29 J 1 C 1 J 2 C 2 J 3 C 3 J 4 C 4 Chaîne lourde (chromosome 14) V H 1 V H 2 V H >100 D1 à D27 J H 1à J H 6 C C Fig Disposition dans trois chromosomes différents des segments de gène encodant les chaînes H et L. Le polymorphisme allélique.

65 60 3. Plusieurs mécanismes expliquent la diversité des anticorps Quatre mécanismes contribuent à la diversité des anticorps. 1. iste plusieurs copies des segments V, D, et J, qui tous trois interviennent dans l élaboration des régions variables, différentes combinaisons lors des réarrangements sont possibles. Pour, 40 V et 5 J peuvent fournir 200 chaînes différentes. Pour 29 V et 4 J peuvent générer 116 chaînes Ce qui donne un total de 316 régions V de chaînes L. Pour la chaîne H, >100 V H, 27 D et 6 J donneraient H > chaînes lourdes différentes. peuvent être ajoutés ou retirés de manière aléatoire à l endroit où les fragments se rejoignent. Ceci produit des codons différents et donc des acides aminés différents dans la partie hypervariable CDR3. 4. Plus tard, dans le lymphocyte arrivé à maturité et se multipliant lors d une réponse secondaire, un dernier mécanisme augmente encore la diversité. Ce sont les mutations somatiques qui affectent l ensemble des segments réarrangés de la région variable, aussi bien pour la chaîne H que pour la chaîne L. 50 CDR1 CDR2 CDR3 40 FR1 FR2 FR3 FR4 Variabilité N CDR3 CDR1 10 CDR Acides aminés C CDR1 CDR2 CDR3 C H 1 C H 2 C H 3 C H 4 VVH DJ Fig Localisation des régions hypervariables dans une Ig, et correspondance avec les segments de gènes V, D, et J. Les 3 régions hypervariables CDR1, CDR2, CDR3 (CDR=Complementarity-Determining Region) sont localisées dans le domaine V et correpondent à 3 boucles qui relient des chaînes anti-parallèles d un feuillet ß (voir Fig. 1-8). Les régions CDR1 et CDR2 sont codées complètement par un segment de gène V. La région CDR3 est codée par la région du réarrangement VDJ dans une chaîne lourde (représentée ici), ou VJ dans une chaîne légère. La région CDR3 est donc beaucoup plus hypervariable

66 61 C. GÉNÉRATION DES RÉCEPTEURS DES LYMPHOCYTES Dans la vie d un lymphocyte, on distingue la phase qui précède tout contact avec un antigène étranger (le lymphocyte est dit naïf) et celle qui fait suite à cette interaction. Les organes lymphoïdes où se passe la primaires ou centraux secondaires ou périphériques. Les organes primaires sont la moelle osseuse et le thymus, alors que les secondaires (MALT pour Mucosal Associated Lymphoid Tissue). particuliers des gènes d Ig, il acquiert progressivement son récepteur antigénique de surface. Il atteindra ainsi le stade dit mature. Cette différenciation s accompagne d une sélection qui mène à l élimination des qui reconnaissent des antigènes du soi. 1. Divers stades de développement Pendant toute la vie d un individu, des lymphocytes se développent dans la moelle osseuse au contact des cellules stromales et sous l action de diverses cytokines ou facteurs de croissance. En fonction du stade du réarrangement des différents segments d ADN qui vont constituer le gène d une chaîne L ou H, on distingue cinq phases dans le développement des lymphocytes (Fig. 3-10). Moelle Périphérie cellule souche pré-pro- pro- pré- immature mature naïf IgM IgD Gènes Gènes chaîne lourde chaîne légère Configuration germinale réarrangement D-J réarrangement V-DJ épissages μ et δ Configuration germinale réarrangement V-J antigène Fig Développement des lymphocytes dans la moelle. Les précurseurs des lymphocytes sont attachés moelle par des molécules d adhérence, parmi lesquelles l intégrine VLA-4 (CD49d) sur le pro- et son ligand VCAM-1 (CD106, un membre de la la cellule stromale. Les facteurs de croissance indispensables sont le SCF (Stem-Cell Factor), qui est une protéine de membrane sur les cellules stromales qui se lie au récepteur Kit porté par le pro-, et l IL-7 produite par les cellules stromales et qui agit sur le pré-. Après un réarrangement productif V-DJ pour la chaîne lourde, la protéine s associe à la pseudochaîne légère (représentée en blanc), ce qui lui permet d aller à la surface de la cellule.

67 1. Au stade dit pré-pro-, la cellule est reconnaissable à quelques marqueurs typiques des, mais le réarrangement n a pas encore commencé Au stade pré-, la jonction des segments V-D-J est faite et on trouve des chaînes dans le cytoplasme et en surface. Mais le réarrangement intéressant la chaîne L n a pas encore eu lieu. Aussi, dans la membrane, la chaîne est associée à une protéine particulière, qui ressemble à une chaîne L. C est une pseudo-chaîne que la stimulation du pré- par l intermédiaire de ce récepteur assure la survie de la cellule et même sa prolifération. 4. Au stade immature, le gène de la chaîne L a été réarrangé, et celle-ci fait partie du récepteur IgM de surface. qu il quitte la moelle osseuse pour aller coloniser les tissus lymphoïdes secondaires. 2. Contrôle des réarrangements sur trois de préserver la phase de lecture correcte. Donc un grand nombre de réarrangements ne sont pas productifs, c est-à-dire génèrent une séquence d ADN dont l ARNm transcrit ne pourra pas être traduit en Ig. Cependant, si un réarrangement est non productif sur un chromosome, le processus de réarrangement se poursuit sur l autre chromosome, ce qui double les chances de succès. combinée à la pseudochaîne légère va empêcher tout nouveau réarrangement V-DJ de chaîne lourde, et l IgM de surface contenant une chaîne ou inhibera tout nouveau réarrangement de chaîne L. Le résultat est qu un lymphocyte identiques. De plus tous les anticorps produits par une cellule sont dirigés contre l antigène stimulant. Il n y Une illustration classique du contrôle des réarrangements de gènes d Ig est le phénomène de l exclusion allélique

68 63 Pré-pro- Pro- Pré- immature réarrangements D-J sur les 2 chromosomes réarrangement V-DJ sur le chromosome 1 réarrangement V-DJ sur le chromosome 2 réarrangement sur le chromosome 1 réarrangement sur le chromosome 2 μ- chromosome 1 : maternel ou paternel chromosome 2 : l'autre = réarrangement non productif = réarrangement productif réarrangement sur le chromosome 1 réarrangement sur le chromosome 2 μ- Fig Etapes des réarrangements de gènes d Ig. Les réarrangements commencent pour la chaîne H et se poursuivent pour la chaîne L. Les cellules ne passent d un stade à l autre que si le réarrangement est productif, c est-à-dire conduit à ou (45 %), le pro- ne peut poursuivre sa maturation et est éliminé. Une cellule avec une chaîne H particulière engendre plusieurs cellules qui auront chacune une chaîne légère différente. Pour les réarrangements de segments de gène de chaîne légère, la proportion de succès est plus importante. En effet, l organisation des gènes de chaînes légères permet plusieurs réarrangements successifs au même locus (Fig. 3-12). V x V 2 V 1 J 1-5 C 1 e recombinaison V x V 2 V 1 J non productif 2 e recombinaison V x V 2 J Fig Réarrangements successifs pour les gènes de chaîne L. Si un premier réarrangement qui implique un V avec J autre V en amont du premier, et un autre J en aval du premier, ce qui mène à l élimination de toute la séquence impliquée dans le premier réarrangement. non productif 3 e recombinaison V x J C

69 64 Igh a/a Igh b/b Igh a/b Fig L exclusion allélique. Igh a et Ighb hétérozygote Igh a/b d immunoglobulines : dès qu un réarrangement est productif, sur l un ou l autre chromosome, le processus de réarrangement s arrête et ne se poursuit donc pas sur l autre chromosome. D. SÉLECTION DES LYMPHOCYTES Une conséquence de la richesse du répertoire des lymphocytes est la production d Ig capables de reconnaître un antigène du soi, soluble ou présent à la surface de cellules. La tolérance naturelle, c est-à-dire le fait que l organisme ne réagisse pas contre ses propres antigènes, implique l inactivation des lymphocytes au stade des immatures c est la tolérance dite centrale, soit dans les tissus lymphoïdes secondaires. On parle alors de tolérance périphérique (Fig. 3-14). comme une protéine cellulaire de surface, ils meurent par apoptose. C est le phénomène de délétion clonale. On introduit dans le génome de souris les gènes qui codent pour une IgM anti-h-2k b a contient beaucoup d IgM anti-k b. Si les H-2 a transgéniques sont croisées avec des H-2 b d IgM anti-k b b si un antigène se liait à l IgD de surface. Cet état de non-réactivité est appelé anergie.

70 65 La moelle osseuse ne contient évidemment pas tous les auto-antigènes. Aussi, la tolérance centrale est-elle en absence des costimuli (IL-4 et CD40L) fournis par les lymphocytes T H, ils ne peuvent ni proliférer et ni se différencier en sécréteurs d anticorps. La tolérance des lymphocytes T contre ces antigènes du soi contrôle donc indirectement celle des lymphocytes. Les lymphocytes matures qui lient un antigène multivalent antigène du soi, soluble Périphérie Moelle osseuse antigène du soi, porté par des cellules Délétion clonale Anergie T H 2 Délétion clonale Anergie IgD IgM Fig Principes de la sélection des lymphocytes.

71 66 E. DIFFÉRENCIATION EXTRAMÉDULLAIRE DES LYMPHOCYTES Les lymphocytes matures qui sortent de la moelle osseuse portent à leur surface des IgM et des IgD de polyadénylation, et par l épissage d un transcrit - (Fig. 3-15). ARNm AAAA IgM Fig Expression de l IgD. codent pour les domaines C 1, charnière (Hinge), C 2 et C 3, séparés par des introns, suivent le segment C de la chaîne. Les segments codant pour C et C séquence qui commande l arrêt de la transcription : un signal de polyadénylation (pa). Soit la transcription s arrête après le segment C et l épissage de l ARNm mène à la production d une chaîne soit elle se poursuit jusqu au pa qui suit C. Dans ce cas, l ARNm, plus long, subit un épissage qui élimine les séquences correspondant à C. Ce qui joint C à VDJ. ARN AAAA Signal de polyadénylation ADN VDJ Cμ1 Cμ2 Cμ3 Cμ4 Cδ1 H Cδ2 Cδ3 ARN AAAA ARNm AAAA IgD Les lymphocytes matures rejoignent les organes lymphoïdes secondaires où le contact avec l antigène conséquences. activés par leur antigène ont un volume cytoplasmique plus important que celui des lymphocytes au repos, ils sont parfois appelés lymphoblastes.

72 67 La différenciation vers la sécrétion d IgM ou d autres isotypes, et vers les mémoire. Cette différenciation différenciation des lymphocytes sont : - la sécrétion d immunoglobulines - la commutation isotypique - l apparition de lymphocytes mémoire La Figure 3-16 schématise ce développement des lymphocytes en dehors de la moelle osseuse. Il est populations cellulaires. mature naïf antigène IgM IgD lymphoblaste sécrétion d'igm Fig Développement des lymphocytes en périphérie. commutation isotypique plasmocyte IgE IgA IgG antigène lymphoblaste sécrétion d'ig prolifération et mutations somatiques IgE IgA IgG IgE IgA IgG mémoire plasmocyte 1. Sécrétion d immunoglobulines L activation antigénique du lymphocyte déclenche la sécrétion d IgM. Le passage de la forme membranaire et sont remplacés par une séquence qui ne code que pour quelques acides aminés non hydrophobes. De ce fait, la protéine n est plus ancrée dans la membrane du réticulum endoplasmique et reste donc libre dans la lumière de celui-ci, pour être ensuite transférée dans la lumière du Golgi puis sécrétée dans le

73 68 même immunoglobuline, appelée aussi «récepteur des lymphocytes». La différentiation terminale des lymphocytes en plasmocytes, qui sécrètent de grandes quantités d anticorps, s accompagne cependant IgM membranaire ARNm AAA ARN AAA ADN VDJ Cμ1 Cμ2 Cμ3 Cμ4 M ARN S AAA ARNm AAA IgM sécrétée Fig Epissage alternatif de l ARNm de la chaîne. 1 à C 4 codent chacun pour l un des domaines de la partie C de l IgM membranaire. 2. Commutation isotypique commutation isotypique. région de commutation (switch region). Lors d une rejoint celle qui se trouve devant C signal de polyadénylation, de telle sorte que la transcription du gène en ARN s arrête dès que le premier

74 69 membranaires en même temps. Plusieurs commutations isotypiques peuvent se succéder, la possibilité de produire tel isotype après tel autre étant dictée par l ordre des segments C dans le génome (Fig. 3-19). Par une commutation d IgM à IgA2 ne permet plus d autre changement. J H C C C 3 C 1 C C 1 C 2 C 4 C C 2 C 1 C 2 C 3 C 4 S région de recombinaison (switch region) C 1 H 1 H 2 C 2 C 3 C 1 H C 2 C 3 S C 1 H C 2 C 3 S C 1 C 2 C 3 C 4 S Fig Organisation des segments de gène codant pour la partie C des chaînes H. Chaque segment C H contient des qui mène à la production d une Ig membranaire ou sécrétée. C est un pseudogène, c est-à-dire un gène altéré qui ne code On relève plusieurs différences entre les commutations isotypiques et les recombinaisons des segments qui codent pour les parties variables. 1. Au contraire des réarrangements des parties variables, les recombinaisons de commutation isotypique sont toujours productives, car les régions de recombinaison sont situées dans des introns, ce qui mène à la ne s accompagne pas d addition ou soustraction de nucléotides. impliquées dans chaque processus. 3. Les recombinaisons VDJ se passent dans la moelle osseuse pendant le développement des lymphocytes, alors que la commutation isotypique a lieu dans des lymphocytes matures, en périphérie, après la rencontre avec l antigène. 4. Les recombinaisons VDJ s effectuent apparemment au hasard, alors que la commutation isotypique est un processus contrôlé par les lymphocytes T : la commutation d IgM vers tel ou tel isotype dépend de lymphokines produites par les lymphocytes T.

75 70 A VDJ C C C 3 C 1 C C VDJ C 3 Switch regions C + C 3 C 1 C recombinaison somatique IgE VDJ C C C 3 C 1 C C 2 C 4 C recombinaison somatique IgM recombinaison somatique IgG 3 IgE région de recombinaison (switch region) Fig A. Excision d ADN lors d une commutation isotypique d IgM vers IgG3.. Exemples de commutations isotypiques d IgM à IgE, ou consécutives d IgM à IgG3 puis d IgG3 à IgE.

76 71 V H 1 V H 2 V H n D J H n C C C C C C C C C VDJ transcription AAAA VDJ C VDJ C AAAA IgM chaîne μ : V H 1, Dn, J H 6, Cμ chaîne 2 : V H 1, Dn, J H 6, C 2 chaîne : V 2, J 3, C IgG2 AAAA transcription V 1 V 2 V n J C Fig Récapitulation des réarrangements de segments de gènes précédant la transcription d ARNm puis la traduction d une IgM puis d une IgG2 dans un lymphocyte. 3. Mutations somatiques Nous avons vu que la diversité des anticorps trouve son origine dans les recombinaisons entre des collections de gènes V, D, et J, et dans l imprécision de ces recombinaisons. Tous ces mécanismes interviennent lors de la maturation des lymphocytes dans la moelle osseuse, bien avant que les lymphocytes ne rencontrent leur antigène. Il y a un mécanisme supplémentaire qui augmente la diversité des anticorps, et qui intervient après l activation des lymphocytes par leur antigène. Il s agit de mutations dans les gènes de parties variables des chaînes légères et lourdes d immunoglobulines. toutes encodées par les mêmes segments V H et V L. À divers moments après les immunisations, on a produit

77 72 et que leur nombre augmentait lors des réponses secondaire et tertiaire. Les mutations se retrouvent surtout, mais pas seulement, dans les régions hypervariables des anticorps, CDR1, CDR2 et CDR3. Anticorps anti-2-phényl-5-oxazolone Jour 0 IP CDR1 CDR2 VH CDR3 CDR1 VL CDR2 CDR3 Ka (x10 6 M -1 ) IgM 3.6 IgM IgM IgM 2.7 Jour 7 H IgM IgM IgM 3.0 IgM 2.0 IgM 1.6 IgM 2.9 IgM 14.3 Jour 14 H IgM IgG IgG 50.0 Jour 50 IV IgG Jour 53 H IgG IgG 9.1 Jour 400 Jour 403 IV H IgG IgG > 333 > 333 IgG > 333 Mutation silencieuse : changement de nucléotide sans changement d'acide aminé Changement de nucléotide entraînant un changement d'acide aminé Fig Mutations somatiques dans les régions V d un anticorps anti-haptène. Certaines mutations sont silencieuses, c est-à-dire qu elles n entraînent pas de changement dans la séquence protéique. On observe une corrélation entre l augmentation La fréquence de ces mutations est d environ 10-3 par paire de bases à chaque division cellulaire. Ce qui est 700 paires de bases sont impliquées dans la production d un site antigénique, on estime qu une mutation survient par division cellulaire dans un lymphocyte. Soulignons dès à présent qu elles n interviennent pas dans la diversité des récepteurs des lymphocytes T. où ont lieu les mutations somatiques, il y a une compétition pour l antigène entre les anticorps sécrétés et seront stimulés par l antigène.

78 73 F. MARQUEURS ET LOCALISATION HISTOLOGIQUE DES LYMPHOCYTES Des Ig sont présentes soit sur la surface, soit dans le cytoplasme de tous les lymphocytes qui ont dépassé le stade de la cellule souche lymphocytaire. Elles ne sont produites par aucune autre cellule. On peut les molécules d Ig de surface portées par un lymphocyte est de l ordre de La demi-vie de ces Ig dans la membrane est d environ 20 h pour les lymphocytes qui ne se multiplient pas activement. Après stimulation antigénique, le lymphocyte perd son récepteur IgD. D autres classes de récepteurs membranaires, IgG, IgA ou IgE, viennent alors remplacer l IgM. Lors d études immunohistochimiques, les récepteurs Fc portés par diverses cellules - c est le cas des lymphocytes - peuvent être une cause d erreur. En effet, les anticorps marqués sont captés par leur région constante et marquées mais dépourvues d activité anticorps contre les antigènes recherchés. Pour éviter ce piège, on peut également éliminer la région Fc des anticorps utilisés par digestion à la pepsine et travailler avec des fragments F(ab )2. quasiment dépourvue de lymphocytes T. Dans les organes lymphoïdes secondaires, les lymphocytes sont qui ont un aspect homogène, sont constitués essentiellement de lymphocytes naïfs reconnaissables en à leur double structure : le centre germinatif qui contient surtout des lymphocytes en prolifération après avoir été stimulés par leur antigène, et le manteau, qui forme une couronne cellulaire de lymphocytes. Dans les ganglions lymphatiques, les follicules primaires et secondaires occupent la région périphérique où ils forment le cortex ou zone corticale. Dans la rate, ils se trouvent dans la pulpe blanche en périphérie des manchons périartériolaires, constitués principalement de lymphocytes T. Marqueurs Ig de surface CD40 CD32 ou Fc RII Table 3-1. Les principaux marqueurs des lymphocytes Fonctions Transmission du signal par l intermédiaire de molécules appelées Ig et Ig H, capitale pour la coopération T- Molécule de costimulation dont le ligand se trouve sur les T H Ce récepteur Fc des IgG inhibe la transmission du signal provenant du récepteur antigénique CD21 ou récepteur pour le facteur C C3dg du complément la co-stimulation des. CD45 Phosphatase commune à tous les leucocytes. En déphosphorylant les kinases tribue à l activation des lymphocytes.

79 74 Lymphatiques afférents Follicule secondaire Centre germinatif Cortex (follicule primaire) Paracortex Médullaire Lymphatique efférent Veine Artère Fig Structure d un ganglion lymphatique. Centre germinatif Follicule lymphoïde Artériole centrale Artère et veine trabéculaires Manchon périartériolaire Fig Structure de la rate. Pulpe rouge

80 75 CHAPITRE 4. RÉCEPTEUR DES LYMPHOCYTES T antigènes. Les immunoglobulines constituent le premier, spécialisé dans la reconnaissance d antigènes solubles, et les récepteurs des lymphocytes T sont le second, spécialisé dans la reconnaissance de peptides antigéniques présentés à la surface des cellules par les molécules MHC. A. IDENTIFICATION DU RÉCEPTEUR DES LYMPHOCYTES T 1. Anticorps anti-clonotypiques Chez la souris, des lymphocytes T provenant d un animal immunisé peuvent être fusionnés avec les cellules d une lignée permanente d une tumeur lymphocytaire T appelée lymphome T. Un tel hybridome T, c est-à- autre hybridome. Des souris immunisées contre un hybridome T produisent des anticorps qui reconnaissent cet hybridome et aucun autre. Ce qui suggère qu ils reconnaissent le récepteur T. De tels anticorps furent idiotypiques qui reconnaissent les anticorps produits par un seul clone de lymphocytes. et ) d environ 40 kd furent ainsi détectées. L analyse des peptides obtenus par digestion à la trypsine de chaînes obtenues à partir d hybridomes différents a montré que certains peptides étaient communs mais que d autres différaient d un hybridome à l autre. Ces résultats suggéraient que les chaînes a des TCR contenaient, comme les Ig, des parties constantes et des parties variables. Les mêmes résultats furent obtenus avec la chaîne. Les quantités de protéines obtenues par immunoprécipitation étant trop faibles pour moléculaire. 2. Clonage des gènes codant le récepteur T La technique utilisée s appelle hybridation soustractive (Fig. 4-1). L hypothèse de départ était que l ARNm du a été passé sur une colonne portant des séquences polyt, qui retient l ARN polya, c est-à-dire l ARNm (1 à 2 % de l ARN total). Cet ARNm a été copié en un brin d ADN complémentaire (ADNc) par la transcriptase reverse, avec incorporation de nucléotides marqués au 32 P. Après hydrolyse de l ARN par du NaOH, qui laisse récupéré en trop faible quantité pour pouvoir établir une séquence nucléotidique, il a été utilisé comme sonde hybridome T et clonée dans des plasmides. Par la suite, lorsque ces clones d ADNc ont été hybridés sur de l ADN génomique digéré par des enzymes de

81 76 Ceci indiquait que le gène correspondant à cet ADNc avait subi un réarrangement dans l hybridome T. Puisqu il était déjà établi, comme nous l avons vu au Chapitre 3, que les gènes d Ig subissaient des réarrangements pendant la différenciation des lymphocytes, ce résultat était attendu si l ADNc correspondait au récepteur T, qui pouvait lui aussi être le produit de gènes réarrangés. Hybridome T ARNm ADNc 32 P * ARNm * Lymphome Hybridation * * * Hydroxyapatite ARNm * * ADNc simple brin Hybridation ADNc double brin Plasmides E. Coli Colonie * NaOH... Amplification... Récupération des plasmides Séquençage Fig Préparation de clones d ADNc du TCR. En haut, hybridation soustractive. En bas, préparation d une la sonde (adapté de Hedrick, Cohen, Nielsen et Davis, 1984, Nature, 308 : 149). L ADNc, préparé à partir de l ARNm, est rendu bicaténaire par une ADN polymérase et inséré dans des plasmides, introduits à leur tour dans des bactéries, à raison d un par bactérie. Suite à la réplication des plasmides, chaque colonie bactérienne produit un grand nombre de copies de la séquence d ADNc. Une bibliothèque d ADNc est donc constituée de plusieurs milliers de colonies bactériennes produisant chacune une séquence correspondant à un ARNm des cellules de départ. Ces colonies sont s hybride avec les séquences homologues. Les colonies correspondantes, récupérées sur l empreinte, constituent une comme sonde sur de l ADN génomique digéré par une enzyme de restriction et fractionné par électrophorèse.

82 77. STRUCTURE DU RÉCEPTEUR DES LYMPHOCYTES T 1. Reconnaissance de l antigène par les hétérodimères ou et est identique pour les récepteurs de tous les lymphocytes T. Le domaine distal est variable: sa séquence diffère d un lymphocyte T à l autre. α Reconnaissance de l'antigène V C β Fig Structure du récepteur TCR. ITAM : Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif. L organisation des domaines Ig des chaînes et est similaire à celle d une région Fab d immunoglobuline. Membrane plasmique ITAM Cytoplasme ε γ ζ ζ δ ε CD3 CD3 CD3 Transmission du signal d'activation Environ 5% des lymphocytes T portent un autre récepteur que le TCR : le TCR formé des chaînes appelées et, dont la structure générale est semblable à celle d et. La reconnaissance de leurs antigènes par les lymphocytes T ne présente pas de restriction HLA: dans des souris qui ne possèdent pas de 2-microglobuline ( 2m -/- ), les lymphocytes T CD8 + disparaissent alors que les lymphocytes T ne sont pas affectés. Une partie importante de ces lymphocytes T reconnaît des glycolipides ou phospholipides présentés par une molécule non polymorphe appelée CD1. Chez l homme, le principal TCR les lymphocytes T du sang reconnaît un phospholipide bactérien, le 3-formyl-1 butyl-pyrophosphate, présent dans Mycobacterium tuberculosis et d autres bactéries et parasites. La plupart des lymphocytes T sont CD4 - et CD8 -, et se trouvent dans les épithéliums, en particulier dans l intestin. MHC porteuse d un peptide particulier, il faut que les chaînes et ou et soient associées. En voici la démonstration. À partir d un hybridome T de souris anti-cytochrome c présenté par I-E k, on a isolé les ADNc des chaînes et. Ils ont été clonés puis introduits par transfection dans une lignée humaine de k -peptide du cytochrome c, alors que les transfectants qui

83 78 2. Activation cellulaire par le complexe CD3 (ou surface des cellules et sa fonction d activation des lymphocytes dépendent de son association à un ensemble de protéines appelé complexe CD3. CD3 est ancré dans la membrane cellulaire et constitué des chaînes CD3 et CD3, et d un homodimère CD3 -CD3 Fig. 4-2). Au contraire des chaînes ou polymorphes. Les chaînes CD3, CD3 et CD3 CD3 est responsable de la transmission du signal d activation résultant de l engagement du récepteur avec son antigène. Des anticorps anti-cd3 peuvent activer directement les lymphocytes T, quelle que soit la est indispensable pour l activation par le récepteur T. Elle comprend une ou plusieurs petites séquences, appelées ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif), composées de 2 tyrosines qui sont séparées par 9 à 11 acides aminés et qui peuvent être phosphorylées par des tyrosine-kinases. La transmission des etc) et l activation éventuelle de la machinerie lytique. La cyclosporine A ou le tacrolimus, très utilisés en transplantation d organes, inhibent de manière sélective l activation des lymphocytes T. L engagement du TCR a de nombreuses conséquences sur le fonctionnement du lymphocyte T : des la surface de la cellule, la sécrétion de cytokines (IL-2, IL-4, etc) ou l activation de la machinerie lytique, et la prolifération cellulaire. Toutes ces réponses sont le résultat de l activation de voies de signalisation, c est-à-dire les conséquences biochimiques, à l intérieur de la cellule, de l activation du TCR. Ces voies de signalisation ont en être des inhibiteurs puissants et assez sélectifs, et d autre part parce que des mutations dans des composants On peut distinguer plusieurs étapes de l activation par le TCR : d abord le recrutement de tyrosine kinases, puis l activation d une voie de signalisation qui implique les phosphatidylinositols et d une autre qui implique ras et et d ailleurs pas complètement élucidé. ien qu il n y en ait pas encore de preuve formelle, on considère que l activation débute par un regroupement autour du TCR de plusieurs molécules de surface, suite à l engagement de leurs ligands, tous présents sur la cellule présentatrice d antigène. Des activités enzymatiques associées à la partie intracellulaire de ces y sont associées. La molécule CD45 possède dans sa partie intracellulaire une activité phosphatase qui va déphosphoryler une tyrosine kinase, p56 lck, constitutivement associée à la partie intracellulaire de CD4 et de CD8. Cette déphosphorylation active p56 lck, qui va phosphoryler des résidus tyrosine présents dans les régions ITAM des molécules CD3. Les ITAM phosphorylés recrutent d autres tyrosine kinases, parmi lesquelles ZAP- 70 (Zeta-Associated Protein), grâce à des domaines d une centaine d acides aminés qui sont présents dans ces kinases et permettent une liaison non covalente à des phosphotyrosines. L activation de ZAP-70 requiert cette liaison à une phosphotyrosine d ITAM, et probablement aussi une autophosphorylation sur une tyrosine. Les Un premier substrat de ZAP-70 est la phosphatidylinositol phospholipase C- 1 (PI-PLC- 1), qui hydrolyse un phospholipide de la membrane plasmique, le phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP 2 ) en inositol

84 79 1,4,5-triphosphate (IP 3 ) et diacylglycérol (DAG). L IP 3 a un récepteur au niveau du réticulum endoplasmique où il provoque la libération de calcium dans le cytoplasme. Conjointement, le Ca ++ et le DAG activent la protéine kinase C (PKC), une sérine/thréonine kinase qui intervient dans l activation des T d une manière que nous ne détaillerons pas ici. Le Ca ++ se lie à la calmoduline, une protéine régulatrice ubiquitaire, et le un facteur de transcription, NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells), qui peut alors migrer dans le noyau (la CD45 CD4 TCR-CD3 DAG PIP 2 Pase p56 lck p56 lck Grb-2 Sos ZAP-70 PI-PLC- 1 IP 3 GDP ras GTP ras Réticulum endoplasmique GTP ras Ca ++ CsA MAP-KKK rac MAP-KKK raf PKC Ca ++ -calmoduline MAP-KK MAP-KK cyclophiline Jun-K MAP-K MAP-K FKP FK-506 calcineurine (Pase) CsA cyclophiline Jun Jun Elk Elk NFAT NFAT FKP FK-506 Fos noyau NFAT AP-1 Promoteur du gène de l'il-2 IL-2 Fig Mécanismes d activation des lymphocytes T. Exemple de l activation du gène de l IL-2. Seule une partie de CD3 est dessinée. Les phosphorylations qui sont représentées avec une boule noire concernent aussi bien des résidus tyrosine que sérine/thréonine, bien qu elles soient effectuées par des activités enzymatiques clairement voies métaboliques nécessaires à l activation du gène de l IL-2, et qui mènent à l activité des facteurs de trancription NFk et Oct-1, ne sont pas représentées non plus. Les voies de signalisation illustrées ne sont pas du tout propres récepteurs.

85 80 déphosphorylation démasque un site de localisation nucléaire) et se lier au promoteur de plusieurs gènes, par pour prévenir le rejet des allogreffes. Elle agit en bloquant la sécrétion de cytokines par les T activés. En absence d une production d IL-2, les T ne prolifèrent pas. La CsA se lie dans la cellule à une protéine appelée du mécanisme d action de la CsA qui a permis de découvrir le rôle de NFAT dans l activation des T. Le FK-506 ou tacrolimus (Tsukuba macrolide immunosuppressor) est un macrolide produit par Streptomyces tsukubaensis Le tacrolimus est très utilisé en prévention du rejet après transplantation d organe. ZAP-70 active aussi la voie de ras et des MAP (Mitogen Activated Protein) kinases. La protéine ras (en réalité c est une famille de protéines) est un intermédiaire dans une cascade de protéines qui mène à l activation des MAP kinases. Ras est activé lorsque le GDP qu il lie est remplacé par du GTP, et inactivé par l hydrolyse du GTP en GDP. L échange GDP-GTP est catalysé par une protéine (ici Sos) recrutée à la membrane par un Ras activé recrute à la membrane et active les MAP kinases, une série de sérine/thréonine kinases qui agissent phosphoryle une MAP kinase kinase (MAP-KK), qui phosphoryle une MAP kinase (MAP-K), qui phosphoryle kinases est activée par le TCR, via une autre GTPase que ras. La kinase au bout de cette cascade est Jun-kinase (Jun-K) qui phosphoryle le facteur de transcription Jun. Jun phosphorylé migre dans le noyau, et s associe à Fos pour fomer un facteur de transcription appelé AP-1. AP-1 et NFAT se lient à l ADN sur le promoteur du gène de l IL-2 (et d autres), et coopèrent pour stimuler la transcription du gène. C. GÉNÉTIQUE DES RÉCEPTEURS DES LYMPHOCYTES T Dans un TCR, le site de reconnaissance de l antigène est formé par l association des parties variables des chaînes et ou et. Une même chaîne associée à des chaînes différentes donnera donc des TCR segments V et J pour la chaîne ; des segments V, D, et J pour la chaîne (Fig. 4-4). Au cours de la maturation pour les Ig. Les réarrangements entre V et J, V et D, ou D et J peuvent s opérer avec une soustraction ou une addition de quelques nucléotides à l endroit de la jonction, ce qui augmente considérablement la diversité des TCR produits. La machinerie de recombinaison somatique utilisée pour les gènes de TCR est la même que pour les gènes d Ig. Chaîne (chromosome 14) V 1 V 2 V J 1 à J C Chaîne (chromosome 7) V 1 V 2 V D 1 J 1.1 à 1.6 C 1 D 2 J 2.1 à 2.7 C 2 Fig Organisation des segments de gène codant les chaînes et des TCR. Les segments de gène V sont constitués ou C, pour une courte portion intermédiaire, et pour les régions transmembranaire et intracytoplasmique. Pour la chaîne permet un nouveau réarrangement si le premier est non productif.

86 81 Le développement des T est conditionné par les réarrangements des segments de gènes qui codent pour le TCR (Fig. 4-5). Ces réarrangements ont lieu dans les thymocytes. Un premier réarrangement implique les segments D et J pour la chaîne, suivi d un réarrangement V-DJ. Si ces réarrangements sont productifs, une chaîne réarrangements successifs possibles. La chaîne est localisée d abord dans le cytoplasme puis est associée en surface à CD3 et à une chaîne non polymorphe appelée pseudo-chaîne récepteur entraîne, par un mécanisme qui n est pas connu, un arrêt des réarrangements au locus et une. Les précurseurs des lymphocytes T, aussi appelés thymocytes, CD4 et CD8. Ils sont prêts à subir les mécanismes de sélection (voir Chapitre 7). Configuration germinale α β V V J C V V D J C thymocytes CD4-8 - Réarrangement D β -J β α V V J C thymocytes CD4-8 - β V V DJ C Réarrangement V β -DJ β α V V J C thymocytes CD4-8 - β V DJ C β intracytoplasmique Surface : β + pseudo α CD3 CD4 + CD8 α β V V J C V DJ C ψαβ CD4 CD8 V J C Réarrangement V α -J α α Surface : α + β CD3 CD4 + CD8 β V DJ C CD3 α β CD3 CD4 CD8 Fig Etapes des réarrangements des gènes TCR.

87 82 par les anticorps produits par les lymphocytes. Mais les anticorps ne pénètrent pas dans les cellules, et et certains parasites. Ce sont les lymphocytes T qui sont capables de les reconnaître, et les molécules dites d histocompatibilité jouent un rôle essentiel dans cette reconnaissance. diffèrent d un individu à l autre à cause d un polymorphisme allélique et constituent ainsi les cibles antigéniques principales lors du rejet des allogreffes. Ce n est que plus tard que l on a réalisé que ces molécules avaient intracellulaires. A. MOLÉCULES D HISTOCOMPATIILITÉ DE LA SOURIS: LES MOLÉCULES H-2 1. Etude des greffes Une greffe est un transfert d organe ou de cellules isolées d un organisme donneur à un organisme receveur. Si le tissu transféré garde son intégrité fonctionnelle et les cellules leur capacité de proliférer, on dit que la greffe prend ou est acceptée. On parle aussi de compatibilité tissulaire. Dans le cas contraire, la greffe est dite rejetée mais c est surtout le transfert de tumeurs qui au départ intéressait les chercheurs. Après transfert de cellules tumorales d une souris à une autre, le cancer se développait parfois, mais le plus souvent la greffe ne prenait pas. Les chercheurs ont alors réalisé que les greffes de tumeurs réussissaient plus souvent quand le donneur et le receveur étaient apparentés, et donc génétiquement proches. Cette observation les a conduits à développer des races de souris consanguines (en anglais, inbred), obtenues par des croisements successifs entre frères et sœurs. Le principe du développement d une lignée consanguine de souris est schématisé dans la Fig Un couple de souris est choisi au hasard. Ces souris sont hétérozygotes, c est-à-dire que pour chaque paire de chromosomes, le paternel est différent du maternel. Le stade diploïde est représenté ici, avec une paire de chromosomes homologues. Les souris de la génération dite F1 peuvent avoir quatre génotypes différents. Un frère et une sœur, choisis au hasard, sont alors accouplés. En F2, un

88 83 été éliminé. En F5, toute la population est devenue homozygote et uniforme pour la paire de chromosomes identiques. En pratique, après vingt générations, l homozygotie est pratiquement totale. On obtient ainsi syngéniques ; allogéniques. Le schém ent pas compte de différents facteurs qui peuvent retarder l évolution vers la consanguinité : F1 F2 F3 F4 F5 Fig Développement d une lignée consanguine. - Le génome d une souris contient 20 paires de chromosomes alors qu une seule paire est représentée ici. - Il est évident qu il n est pas possible de choisir les accouplements qui permettent d éliminer des pour l accouplement est fait au hasard. Certaines générations ne contribuent donc pas à augmenter l homogénéité génétique. Celle-ci reste cependant statistiquement inévitable. - Le processus de la méiose qui est impliqué dans la production des ovules et spermatozoïdes s accompagne de recombinaisons entre les chromosomes. Du fait de ces recombinaisons, les chromosomes de la lignée consanguine ne seront

89 84 Une représentation schématique de la méiose est présentée dans la Fig A D a b d Gamètes (haploïdes) E e Zygote, ou cellule somatique (diploïde) Méiose sans recombinaison Méiose avec recombinaison Appariement + ou ou Après division 1 (pas de division des centromères) A E D a b e d A E d a b e D Après division 2 (division des centromères) A E D a b e d A E d a b e D A D a d A d a D A D a d A d a D b b b b E e E e e E e E Fig Schéma de la méiose. homologues. Le parent est hétérozygote. La partie gauche du schéma montre la ségrégation des allèles dans le cas d une méiose sans recombinaison. Dans ce cas, les allèles A, et E ségrègent toujours ensemble. La partie droite du schéma sur le même chromosome et très proches ; leurs allèles ségrègent ensemble, ils sont complètement liés. Les loci Aa et Ee sont sur le même chromosome mais plus éloignés ; ils sont séparés assez fréquemment par un événement de recombinaison. Ils sont incomplètement liés. l autre. Par contre, les greffes échouent toujours lorsque le donneur et le receveur appartiennent à des races différentes. Le rejet des tumeurs est donc déterminé par des facteurs génétiques. En 1936, Peter Gorer ( ) a constaté que des souris de race C57 qui avaient rejeté une tumeur provenant d une souris de race A avaient des anticorps qui reconnaissaient les globules rouges de souris de race A. Ces résultats suggéraient que la réaction de rejet de ces tumeurs n était pas dirigée uniquement contre les cellules tumorales mais bien contre toutes les cellules du donneur. La production d anticorps dirigés contre des cellules du donneur était une première indication que le rejet des greffes était un phénomène

90 85 immunitaire, causé par la présence sur les cellules greffées d antigènes propres au donneur. Ces antigènes furent appelés antigènes de transplantation ou antigènes d histocompatibilité. Si l on transfère un fragment de peau d un endroit à un autre chez le même animal (autogreffe), au bout de contre, les greffes de peau entre un donneur et un receveur génétiquement différents échouent généralement. qui a déjà rejeté un greffon d un animal A rejette beaucoup plus rapidement un second greffon provenant du même animal ou d un animal de même race A (rejet secondaire) qu un greffon prélevé chez un animal d une autre race consanguine. Cette mémoire n est pas un phénomène local : la seconde greffe est rejetée plus nature immunitaire du rejet des greffes. - le rejet des greffes est un phénomène immunitaire dû à des antigènes de transplantation. lois de la transplantation (Fig. 5-3). - Quand le donneur et le receveur appartiennent à la même race consanguine, la greffe (isogreffe) prend. - Quand le donneur et le receveur appartiennent à des races différentes, la greffe (allogreffe) ne prend pas. d accepter une greffe provenant d une race donnée est donc un caractère dominant. Par contre, les races parentales n acceptent jamais les greffes provenant de F1. backcross individu à l autre. Ils sont identiques chez les souris consanguines, mais diffèrent d une race à l autre. - Un animal réagit contre les antigènes qu il ne possède pas, et ne réagit pas contre ses propres antigènes génétiques qui ont été appelés loci d histocompatibilité, puisqu ils déterminent si un tissu est compatible avec un hôte donné.

91 86 Parent 1 Parent 2 A A A 75% 25% % + - F1 A 50% % A 1/2 ackcross (F1 x Parent 2) 1/2 F2 A A 1/4 1/4 A 1/2 Fig Les lois de la transplantation. considère que les antigènes de transplantation sont déterminés par un seul locus.

92 87 Nombre de loci génétiques impliqués La proportion de souris F2 ou de backcross qui acceptent une greffe parentale permet l évaluation du nombre essentiellement d un seul locus qui a été appelé H-2. A A A A A C C D D F1 A F1 A C D ackcross ackcross A A C D A D D C D D D Fig Analyse du nombre de loci génétiques déterminant un caractère. tère dominant requiert la présence des allèles dominants d un seul ou de plusieurs loci, il faut effectuer des croisements caractère requiert la présence des allèles dominants de plusieurs loci non liés. Elle est de 1/4 dans le cas de 2 loci, de (1/2) n trouve alors parmi les backcross 50 % de phénotypes positifs (A), 50 % de phénotypes négatifs (). En, le carac- et 75 % de phénotypes négatifs (ADD, CD, DD). porteurs du caractère est alors de (3/4) n quand n loci sont impliqués. A C + - Parent 1 A A C C D 25% D A D Parent % 1/4 1/4 A C D D D F1 A C D 25% + C 1/4 D D 1/4 D ackcross (F1 x Parent 2) Fig Les lois de la transplantation. Résultat de greffes si l on considère que les antigènes de transplantation sont

93 88 Test de dominance Les différents types de greffe Autogreffe = d un endroit à l autre chez le même individu. Isogreffe Allogreffe race consanguine à une souris d une autre race consanguine ou chez l homme d un individu à un autre, Dupont-Durand, ou frère-sœur. Xénogreffe = d un individu d une espèce animale à un individu d une autre espèce animale. 2. Existence d un locus majeur d histocompatibilité Le recours à des souris dites congéniques a permis l analyse systématique des loci d histocompatibilité (Fig. 5- d histocompatibilité (H-1, H-2, H-3) de la souris, le locus H-2 s avéra beaucoup plus important que les autres. Les d histocompatibilité. Le locus H-2 fut donc appelé locus majeur d histocompatibilité de la souris. sauf qu elles portent des allèles différents du locus qui détermine ce caractère. Elles sont dites congéniques pour plusieurs loci dont les effets s additionnent ou se remplacent. Il est possible de faire une «dissection génétique» locus. Cette méthode s est avérée cruciale pour l analyse des loci qui déterminent le rejet des greffes (loci par le même locus? Si on dispose de souris congéniques pour le premier caractère, on peut répondre tout de congéniques.

94 89 Race 1 Race 2 A A a a F1 A a ackcross 1 Race 2 A a A a a a ackcross 2 Race 2 A a A a a a Race 2 ackcross n A a A a A a A A Fig Obtention d une lignée congénique codominant et donne le phénotype positif, symbolisé ici par le rond noir. Considérons trois paires d autosomes. Au premier backcross, huit combinaisons sont possibles. Dans la plupart d entre elles un chromosome de la race 1 a été éliminé. Il faut sélectionner pour le backcross suivant un animal de phénotype +, contenant donc obligatoirement le chromosome qui porte A. Au cours de backcross ultérieurs, le processus est répété. Le résultat est que le seul chromosome de la race 1 qui reste présent est celui qui porte A. De plus, à cause des événements de recombinaison, il donc entièrement le génotype de la race 2 sauf l allèle A.

95 90 Greffe acceptée Race 1 Race 2 Greffe rejetée AA aa F1 Aa Race 2 ackross 1 Aa aa Greffe de peau AA Race 2 ackross 2 Aa Race 2 aa Greffe de peau AA ackross n (> 12 générations) Aa Aa aa aa AA Aa Aa aa Fig Obtention d une lignée congénique pour un locus d histocompatibilité. Les 2 races consanguines diffèrent, entre autres, par le locus Aa qui est responsable du rejet de greffe de peau d une race à l autre. Parmi les sont sélectionnés pour un nouveau backcross avec la race 2, et ainsi de suite pendant au moins 12 générations. Ensuite, on croise 2 souris qui acceptent les greffes AA. On obtiendra ainsi dans 25% des cas des souris homozygotes pour l allèle A. Ces souris acceptent les greffes de la race 1 mais pas de la race 2 bien qu ils sont issus de plus de 12 générations 3. Analyse sérologique du locus H-2 Le sérum de souris immunisées contre des cellules de souris d autres races contient des anticorps dirigés contre des antigènes de surface des cellules immunisantes. Ceci n est observé que lorsque le donneur et le receveur immunisées avec des cellules (pour des raisons pratiques, ce sont souvent des lymphocytes) de souris C3H (sérum AL/c anti-c3h) contient des anticorps dirigés contre des antigènes de surface présents sur les cellules C3H (Fig. 5-8), mais évidemment pas contre les cellules AL/c. On trouve aussi des anticorps dirigés les mêmes antigènes sur les cellules C3H et C57L, on pratique un test d absorption. Le sérum absorbé avec Ces analyses sérologiques ont révélé que les races de souris différaient entre elles par de très nombreuses haplotype s : simple) désigne une série

96 91 Antisérum Absorption par Résultats du test sur : C57L AL/c C3H Spécificités antigéniques définies A C C3H AL/c anti-c3h antigène A C57L + antigène C D E C57L anti-al/c - C3H antigène C antigène D AL/c C3H anti-c57l - AL/c antigène E antigène F - A E F C57L Fig Détection sérologique d antigènes de transplantation. Le test est effectué par incubation du sérum à 37 C avec des lymphocytes de la race mentionnée et en présence de complément. Les lymphocytes tués sont repérés par un colorant qu ils laissent pénétrer. Pour absorber un sérum, on l incube à 0 C pendant une heure avec une grande cellules. Après centrifugation, on récupère le sérum. En utilisant les races consanguines de souris AL/c, C3H, 4. Analyse génétique du locus H-2 a (race A), H-2 b (race C57L), H-2 k (race CA), H-2 d (races DA/2, AL/c), etc. Lorsqu un locus comporte ainsi de très polymorphe haplotype particulier pouvaient résulter soit d un grand nombre de déterminants antigéniques présents sur le produit d un seul gène, soit de la présence de plusieurs gènes. Cette question a été résolue par une analyse génétique détaillée du locus H-2 en étudiant le résultat de backcross. Table 5-1. Comment dresser une carte génétique S après backcross dans au moins la moitié des cas. chromosome mais à des endroits éloignés. Conservées dans la majorité des cas. Ils sont sur le même chromosome et proches l un de l autre. Il est 6 kb, et le plus grand 5 kilobases (kb) ou de 100 centimorgans (cm). Une fréquence de recombinaison de 1/1000 (0,1 cm) correspondrait ainsi à 300 kb. La longueur moyenne des gènes est de 10 à 15 kb.

97 92 que, dans près de 0,3 % des cas, une recombinaison survient à l intérieur du locus H-2. Cet événement de recombinaison est décelé par l apparition d une nouvelle combinaison d antigènes, c est-à-dire d un nouvel haplotype (Fig. 5-9). Cette fréquence de recombinaison suggère que les marqueurs considérés appelés H-2K et H-2D I, qui contient plusieurs gènes intéressants. On les a découverts en identiques, mais diffèrent dans la région intermédiaire. Il est apparu que des échanges de tissus entre ces déterminants sérologiques (appelés Ia pour I antigènes) reconnus par ces anticorps ne se trouvent que sur régions, I-A et I-E, séparables par recombinaison (Fig. 5-10). Puisque plusieurs gènes sont impliqués, on parlera non plus de locus H-2 mais de complexe H-2 ou complexe majeur d histocompatibilité (Major Histocompatibility Complex, MHC) réaction immunitaire qui mène au rejet d une greffe d une souris d une race consanguine à une souris d une autre race consanguine porteuse d un autre haplotype H-2. Cependant il est possible d obtenir des rejets de greffes entre souris qui partagent le même haplotype H-2. Ces rejets sont moins rapides qu entre souris d H-2 différents. C est pourquoi les antigènes de transplantation impliqués dans ces cas ont été appelés antigènes mineurs d histocompatibilité. Nous en reparlerons au chapitre Structure des molécules H-2 H-2K et H-2D, sont des hétérodimères comprenant une chaîne lourde et une protéine plus petite. La chaîne lourde, ancrée dans la membrane cellulaire, a un poids moléculaire de 44 kd. C est la protéine polymorphe qui est codée par les gènes H-2K ou H-2D et qui porte les déterminants antigéniques reconnus par les anticorps anti-h-2. La petite protéine (12 kd) s appelle 2 -microglobuline (Fig. 5-10). Elle est identique dans toutes les races de souris et n est donc jamais reconnue par les anticorps anti-h-2 obtenus chez les souris. Les molécules de classe II sont encodées par les gènes I-A et I-E. Ce sont également des hétérodimères, composés d une chaîne (A ou E ) de 33 kd et d une chaîne (A ou E ) de 28 kd. Les chaînes et sont

98 93 A A C C D D C3H AL/c F1 A C D Méiose A A C D C D RÉSULTAT DU ACKCROSS F1xAL/c GAMÈTES : 1. pas de recombinaison entre A et A C D A C D + C D C D 2. recombinaison (rare) entre A et Majorité A C A C A C D + C D C D D D Minorité (recombinants) A D C D + C C D Fig Détection de recombinants pour les antigènes sérologiques d H-2. antigènes H-2 est codominante. En pratique, on détecte environ 0,3 % de souris backcross recombinant H-2 backcross pour voir si les combinaisons alléliques parentales sont conservées. Lorsqu on se trouve en présence de trois gènes rapprochés, on peut déterminer leur Classe I Classe II Classe II Classe I ß-2m ß-2 microglobuline Fig Antigènes majeurs d histocompatibilité de la souris. K I-A I-E ß-2 microglobuline D Complexe H-2 sur le chromosome 17 Chromosome 2

99 94 H-2K H-2D + méthionine- 35 S + IgG de souris anti-h-2k + DOC - centrifugation - élimination du surnageant + IgG de lapin anti-igg de souris précipité + SDS et urée = H-2K Electrophorèse Autoradiographie Gel de polyacrylamide = ß2m Fig Immunoprécipitation de molécules H-2K. Les cellules incubées en présence de méthionine- 35 S incorporent le récupérés par centrifugation. Un détergent puissant, le sodium dodécylsulfate ou SDS, associé à un agent dénaturant (urée dans un gel de polyacrylamide. Les protéines marquées à la méthionine- 35 S sont repérées par autoradiographie, et leur poids moléculaire établi par comparaison avec la distance parcourue dans le gel par des protéines de poids moléculaire connu.

100 95. COMPLEXE HLA Durant la seconde guerre mondiale, un chercheur anglais, Peter Medawar, étonné par l échec des greffes de peau réalisées chez des aviateurs brûlés lors de la bataille d Angleterre, avait effectué des greffes de peau chez des lapins (Fig. 5-12). Ses résultats suggéraient que les globules blancs étaient porteurs d antigènes de transplantation. leucocytes 10 jours 5 jours 5 jours rejet Fig Présence d antigènes de transplantation sur les globules blancs. Une greffe de peau d un lapin à un autre non après 5 jours. On retrouve ici la capacité de mémoire du système immunitaire. Si un lapin d abord immunisé par une injection sous-cutanée de globules blancs d un animal donneur reçoit une greffe de peau de ce donneur, il la rejette en 5 jours. On en En 1954, à Paris, Jean Dausset a constaté que le sérum de personnes qui avaient subi des transfusions, même si les règles de compatibilité de groupes sanguins entre receveurs et donneurs avaient été respectées, avec des échantillons de sérum provenant de femmes multipares. La répétition des tests sur des sérums et des leucocytes provenant d un grand nombre d individus a révélé que ces antigènes étaient très divers. En 1967, on a proposé de les appeler HLA pour Human Leukocyte Antigens. À Leiden, Jan Van Rood, l un des chercheurs impliqués dans les nombreuses analyses sérologiques du millions de globules blancs d un donneur typé A1 +, A3 -, 7 + des antigènes en question) à une personne typée A1 +, A3 -, 7 -. Ensuite, il a greffé de petits fragments de peau au receveur des globules blancs. Si le greffon provenait d un donneur quelconque, il était rejeté après 11

101 96 jours, mais s il avait été prélevé chez un donneur 7 +, le rejet était beaucoup plus précoce. Par conséquent, les antigènes HLA, au même titre que les antigènes H-2 de la souris, pouvaient être appelés antigènes HLA différentes de celles du receveur. Il sera le fondateur d Eurotransplant, un réseau international qui s efforce d assurer une compatibilité HLA entre donneurs et receveurs d organes. 1. Polygénisme et polymorphisme du complexe HLA Chromosome 6 Complexe HLA (4000 kb) classe II classe III classe I RING1 RING2 DP2 DPA2 DP1 DPA1 DNA RING3 DP DMA DM DPA LMP2 TAP1 LMP7 RING9 TAP2 DQ DQA DO DQ2 DQA2 DQ3 DQ1 DQA1 DR DRA HLA- C E A G F DR1 DR2,6-7 DR3,4-5 DR8 DR9 DRA CYP21 C4 C4A f C2 HSP70 TNF HLA-DP Apprêtement de l'antigène HLA-DQ HLA-DR Fig Carte de la région HLA. Les gènes HLA importants sont en noir. La région classe I contient les gènes HLA-A, HLA- et HLA-C. Les gènes HLA-E, F, et G, parfois appelés HLA de classe I, encodent des molécules de surface qui sont aussi associées à la 2 -microglobuline. La région classe II contient tous les gènes qui codent pour les molécules HLA-DR, DP, de lecture) qui codent pour des produits de classe II non fonctionnels (DP2, DPA2,...). Les gènes DMA et DM encodent des protéines qui, à l intérieur des endosomes, jouent un rôle dans le transfert des peptides antigéniques vers les molécules de classe II. Les gènes LMP2 et LMP7 encodent des constituants du protéasome. Les protéines TAP1 et TAP2 constituent le transporteur de peptides depuis le cytosol vers le réticulum endoplasmique. La transcription de l ensemble des gènes de classe II est fortement augmentée par l IFN. La région classe III contient les gènes des composants C2, C4, et facteur du complément, et les gènes du TNF et du TNF.

102 97 La région classe I contient les gènes qui codent pour les chaînes lourdes des molécules de classe I HLA-A, HLA-, et HLA-C. Les gènes HLA-E, F, et G codent pour des molécules très semblables à HLA-A,, C, mais leurs fonctions sont encore peu connues. La région classe II et, on distingue les gènes codant pour chacune de ces chaînes : HLA-DPA et DP, DQA et DQ, et DRA et DR. La région classe III donnée de la population. Cette diversité a pour conséquence qu il est peu probable qu un individu hérite du même allèle d un gène de chacun de ses parents : la majorité des individus sont donc hétérozygotes pour les gènes HLA. HLA de classe II HLA de classe I C A DP 59 DPA 8 DQ 26 DQA 15 DR 120 DRA ±600 C1 C2 C3 C... C±100 A1 A2 A3 A... A±300 Fig Polymorphisme des gènes HLA. Tous les gènes HLA sont polymorphes, augmente encore chaque année parce par séquençage. Ils ne diffèrent parfois des allèles connus que par quelques nucléotides. douze types de molécules HLA de classe II différents (Fig. 5-15).

103 98 Haplotype d'origine paternelle Haplotype d'origine maternelle HLA de classe II Chromosome 6 Chromosome 6 HLA de classe I Fig Expression codominante des gènes HLA. Présence à la surface d une cellule des molécules HLA codées par les allèles d origines maternelle et paternelle. Pour les molécules de classe montré par le schéma. D une part D autre part des molécules de classe II qui ne sont présentes chez aucun des F1, par combinaison de chaînes et d origines distinctes. Sur lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques Sur presque toutes les cellules une chance sur quatre d avoir des molécules HLA identiques. La fréquence des allèles HLA varie sensiblement selon les populations. Dans la population européenne (caucasienne) l allèle le plus fréquent est A2 : 28 % (ce chiffre représente la fréquence de l allèle A2 parmi tous les gènes HLA de classe I trouvés dans une population). Ce qui veut dire qu environ 48 % des individus possèdent HLA-A2 à la surface de leurs cellules (soit pour le chromosome maternel : 28 % d A2, et parmi les 72 % d individus qui n ont pas A2 sur ce chromosome, 28 % peuvent l avoir sur le chromosome paternel). Certaines combinaisons d allèles présentent un déséquilibre de liaison : la combinaison est plus fréquente que ne allèles A1 et 8 dans la population. 2. Typage HLA Auparavant, la technique était sérologique. Des anticorps anti-hla provenant de femmes multipares (20% s immunisent contre un HLA de leur enfant) ou de personnes qui ont été transfusées ou qui ont rejeté une greffe servent de réactif pour le test de lyse par le complément des lymphocytes à typer. L interprétation des résultats est délicate, car la plupart des antisérums contiennent à la fois des anticorps dirigés contre une molécule HLA particulière ( ) et des anticorps qui reconnaissent un groupe de molécules HLA ( plus, les antisérums contiennent des anticorps dirigés contre des molécules de classe I et d autres contre des molécules de classe II. La sérologie a été remplacée par des techniques de biologie moléculaire appliquées à

104 99 Nomenclature HLA Le polymorphisme des molécules HLA dépasse très largement les seules différences que des anticorps peuvent reconnaître. Nous verrons que la plupart des différences correspondent à des changements d acides aminés allèle sur la base de sa séquence nucléotidique. Le nom du gène est suivi d un astérisque et de quatre chiffres. sous-types, désignent les allèles qui appartiennent au même type diffère dans les séquences nucléotidiques correspondantes. 3. Structure des molécules HLA Les molécules HLA de classe I comprennent une chaîne lourde (45 kd) associée de manière non covalente à la 2 -microglobuline (12 kd), laquelle se retrouve aussi, isolée, dans le sérum. La chaîne lourde est ancrée dans la membrane cellulaire par une région hydrophobe d une vingtaine d acides aminés : la région transmembranaire. comprend trois domaines : 1, 2 et. Le domaine, proche de la membrane cellulaire, ressemble à un domaine constant d Ig, avec un pont disulfure. Ce domaine interagit avec la domaines et, qui ont une structure similaire mais différente d un domaine d Ig, forment ensemble, comme nous le verrons plus loin, une sorte de crevasse qui contient le peptide antigénique. Lorsque les séquences protéiques des différents allèles HLA de classe I sont alignées, il apparaît clairement que le polymorphisme allélique concerne essentiellement les domaines et (Fig. 5-17). La -microglobuline, CD8 (voir plus loin) des lymphocytes T interagit avec le domaine. CD4 HLA de classe II (exemple : HLA-DQ) Chaîne β Chaîne α Chaîne lourde β1 β2 α1 α2 CD8 HLA de classe I (exemple : HLA-) α2 α3 α1 β2m Fig Structure des molécules HLA de classe I et II. Chromosome 6 DP DPA DQ DQA DR DRA Chromosome 2 C A

105 100 et membrane cellulaire par une région transmembranaire, ont la même conformation : un domaine proche de la membrane, qui ressemble à un domaine d Ig, et un domaine distal qui n y ressemble pas. Comme nous le et bordent la fente qui accueille le peptide antigénique. Le (voir plus loin) des lymphocytes T interagit avec le domaine 2. domaine α1 domaine α2 domaine α Variabilité Position dans la séquence Fig Localisation du polymorphisme allélique dans les séquences des molécules HLA de classe I. le nombre d acides aminés différents qui se retrouvent à une position donnée, divisé par la fréquence de l acide aminé le plus fréquent à cette position.

106 101 CHAPITRE 6. PRÉSENTATION DES ANTIGÈNES AUX LYMPHOCYTES T A. RESTRICTION H-2 En 1974, Rolf Zinkernagel et Peter Doherty étudiaient la réponse immunitaire de souris infectées par le virus de la chorioméningite lymphocytaire (Lymphocytic ChorioMeningitis Virus ou LCMV). La rate des observation plus étonnante, les cellules infectées n étaient lysées que si elles provenaient de la même souche de souris que celle qui avait fourni les lymphocytes T (Fig. 6-1). virus LCMV cellules cibles : fibroblastes infectés ou non par LCMV lymphocytes T spléniques AL/c (H-2 d ) CA/H (H-2 k ) 7 jours + + lyse Fig La restriction H-2 des lymphocytes T cytolytiques anti-lcmv. Les lymphocytes T lysent des cellules syngéniques infectées mais pas des cellules syngéniques non infectées, ni des cellules allogéniques infectées. Les cellules cibles blanches sont H-2d et les grises sont H-2k. Le virus représenté par un trait noir dans des cellules cibles indique que celles-ci ont été infectées (adapté de Zinkernagel et Doherty, Nature, 1974, 248 : 701). T cytolytiques et les cellules cibles devaient partager le même haplotype MHC de classe I. Il a également reconnaissance de l antigène par des lymphocytes T cytolytiques de souris est donc «restreinte» à certaines restriction H-2 ou restriction MHC. Plus tard, on a réalisé que tous les lymphocytes T qui reconnaissaient les molécules MHC de classe I portaient à leur surface un marqueur particulier, appelé CD8. Lorsque ces cellules sont capables de lyser d autres cellules, on les désigne généralement par le sigle CTL dérivé de Cytotoxic (ou cytolytic) T Lymphocyte.

107 102. PRÉSENTATION DES ANTIGÈNES AUX LYMPHOCYTES T CD8 + soit un récepteur unique reconnaît conjointement un antigène viral et les molécules MHC. 1. Découverte du mécanisme de présentation d antigènes aux T cytolytiques virale dans des cellules cibles, procédant ainsi à ce que l on appelle une transfection. C est ce qui lui permit nucléoprotéine. Celle-ci ne devait donc pas être présente telle quelle à la surface des cellules, contrairement à ce que certains croyaient (Fig. 6-2). Ce sont des séquences d une dizaine d acides aminés qui sont reconnues par les CTL. On l a constaté en incubant des cellules avec différents peptides. Pour un clone lymphocytaire donné, un seul type de peptide sensibilise les cellules à la lyse, et conformément à la règle de la restriction MHC, les cellules qui ne portent pas les molécules MHC adéquates ne sont pas lysées, même après incubation reconnaissent des peptides antigéniques associés à des molécules MHC de classe I. virus influenza cellules H-2 b C57L/6 (H-2 b ) transfection NP influenza clone F lymphocytes T cytolytiques anti-nucléoprotéine (NP) La rate de souris infectées dérivé un clone de cette population lymphocytaire, on teste son activité lytique sur des cellules transfectées soit avec le gène entier de la nucléoprotéine virale soit avec divers fragments de ce gène. Si le gène est tronqué de telle sorte que la protéine produite ne comporte que les premiers acides aminés (jusqu au 327 e ), la lyse ne survient pas. On ne l observe que lorsque la suivis immédiatement des acides aminés 328 à 498 permet la reconnaissance (d après Townsend et coll., 1985, Cell, 42 : 457).

108 103 A portion de séquence de la nucléoprotéine du virus influenza Cibles Cellules H-2D b Cellules H-2D b M Cellules H-2D b M Cellules H-2D b M Cellules H-2D b M Cellules de souris AL/c (H-2d) Cellules H-2d M LYSE par le clone de lymphocytes cytolytiques "F5" A. b, la molécule MHC qui restreint l activité lytique du clone T «F5» (Fig. 6-2). Après 1 h située entre les résidus 327 et 386. Or, seul le peptide contenant les 16 acides aminés permet une lyse par le clone F5.. Des peptides de plus en courts sont synthétisés sur la base de la séquence du peptide , et testés. Le peptide le plus nécessaire pour sensibiliser les cellules à la lyse (d après Townsend et coll., 1986, Cell, 44 : 959). 2. Structure du complexe peptide-hla de classe I suggéré par la séquence des gènes HLA de classe I et donc des protéines correspondantes, le domaine 3 possède, comme la 2 -microglobuline, la structure en tonneau caractéristique d un domaine d Ig. La structure des domaines 1 et 2 une sorte de plancher constitué de feuillets, une par domaine, délimitent une fente ou crevasse dans laquelle s insère le peptide antigénique fait d une dizaine d acides entre elles et avec le plancher (Fig. 6-4). La comparaison des séquences des molécules de classe I murines ou humaines avait montré que les variations alléliques se situent essentiellement dans les domaines 1 et 2 dans ces domaines (voir Fig. 5-17). eaucoup de ces acides aminés hypervariables sont en bordure de la fente qui contient le peptide, soit dans le plancher, soit dans les hélices. Donc le polymorphisme des molécules HLA de classe I sert à créer des variations dans les caractéristiques chimiques de la fente qui lie les peptides. La découverte de la structure tridimensionnelle d une molécule HLA de classe I démontra formellement que ce sont des peptides antigéniques qui sont reconnus par des lymphocytes T restreints par des molécules

109 104 A 1 peptide 2 NH2 1 NH2 COOH (vers 3) S-S 2m COOH S-S COOH (vers membrane) NH2 2 3 C D 45 A C F NH2 116 COOH D E Fig Structure moléculaire des molécules HLA de classe I (HLA-A,, C). A modèle en rubans est basé sur la structure cristallographique d une molécule HLA-A2 (jorkman, Saper, Samraoui, ennett, Strominger, et Wiley, Nature, 1987, 329 : 506). Les feuillets sont représentées par des spirales. Les domaines de type Ig ( 3, 2 m) sont en bas, et les domaines polymorphiques ( 1, 2 ) en haut. Le site d association du peptide correspond à la fente limitée latéralement par les hélices et en bas par la plate-forme constituée du feuillet plissé. Les domaines 1 et 2 sont vus d en haut, du point de vue du récepteur des lymphocytes T. Le peptide antigénique n est pas représenté. C. du peptide. Les poches, C, D et E sont à la jonction du plancher et d une hélice. La poche s enfonce profondément sous l hélice. D à gauche sur le dessin. La chaîne latérale de l acide aminé en position 2 du peptide (Ile) interagit avec l acide aminé 45 du HLA- interagit avec une tyrosine en position 116 de la molécule HLA.

110 105 montré clairement que le récepteur des lymphocytes T entre en contact non seulement avec le peptide antigénique lui-même, mais aussi avec la molécule HLA présentatrice. 3. Motifs d ancrage des peptides antigéniques différents. La plupart comportent 9 résidus, mais on en trouve contenant 8 ou 11 acides aminés. Rammensee et coll. (Fig. 6-5) ont relevé que la majorité des peptides antigéniques qui se lient à un type de molécules MHC de classe I ont des acides aminés communs dans certaines positions. Ils servent à l ancrage du peptide dans la fente du HLA, qui comporte, principalement dans le plancher, des poches dans lesquelles s insèrent les chaînes latérales des acides aminés d ancrage du peptide (Fig. 6-4, C et D). On comprend ainsi que la position et la composition chimique des poches qui les accueillent différencient fonctionnellement les diverses molécules HLA de classe I. séquence P815 ph acide H-2K d D d K d L d acide aminé (pmole) ALA ARG ASN ASP GLN GLU GLY HIS ILE LEU LYS MET PHE PRO SER THR TYR VAL Les cellules tumorales P815, dérivées d un mastocytome des souris DA/2 (H-2 d ), portent à leur surface les molécules MHC de classe I H-2D d, H-2K d, et H-2L d. Les cellules, lysées par un détergent, libèrent ainsi en solution la majorité de leurs protéines. La préparation est passée d. Après élimination de toutes les autres protéines cellulaires par lavage, les molécules H-2K d retenues par l anticorps sont détachées par un tampon acide, qui sépare aussi les trois constituants de la molécule : la chaîne lourde, la 2 -microglobuline et le peptide antigénique. Au moyen d une autre colonne qui sépare les molécules en fonction de leur taille, on isole l ensemble des peptides antigéniques et on au fur et à mesure de leur libération. Puisqu il s agit ici de peptides différents, chaque cycle de la dégradation libère un mélange tyrosine pour la position 2 et isoleucine ou leucine pour la position 9. On en conclut que la grande majorité des peptides liés à la molécule H-2K d, malgré la grande diversité de leurs séquences, contiennent TYR en position 2 et LEU ou ILE en position d (d après Falk, coll. et Rammensee, 1991, Nature, 351 : 290).

111 Apprêtement des peptides présentés par les molécules MHC de classe I Les peptides présentés à la surface d une cellule par les molécules de classe I proviennent de protéines synthétisées à l intérieur de cette cellule (Fig. 6-2). Pour que celles-ci puissent fournir les peptides associés aussi être la source de peptides antigéniques. Par contre si une cellule capte des protéines par endocytose, celles-ci n atteignent pas le cytosol, et ne génèrent pas de peptides présentés par des molécules de classe I. Dans ce cas, comme nous le verrons plus loin, ce sont les molécules de classe II qui s en chargent. protéasome, composé de pour certaines de ces sous-unités, LMP2 et LMP7. Mais, comment ces peptides cytosoliques rejoignent-ils TAP1 et TAP2 (Transporter du réticulum endoplasmique, elles utilisent l énergie de l ATP pour transférer des peptides depuis le cytosol vers la lumière du réticulum endoplasmique, où se retrouvent toutes les chaînes polypeptidiques destinées soit à l insertion dans la membrane cellulaire, comme c est le cas pour les molécules MHC, soit à la sécrétion. appelée séquence signal (leader sequence), qui destine ou adresse la protéine concernée au réticulum endoplasmique. Après avoir rempli sa mission, la séquence signal est clivée. Les chaînes lourdes des molécules MHC de classe I sont retenues dans le réticulum endoplasmique par 2 -microglobuline est adressée dans le réticulum endoplasmique lors de sa synthèse à cause de la présence d une séquence signal. Les peptides antigéniques potentiels rencontrent donc dans le réticulum endoplasmique la chaîne lourde des molécules HLA de classe I, et la 2 d ancrage nécessaires peuvent s insérer dans la fente des molécules de classe I. Il semble qu ensuite la 2 trimoléculaire chaîne lourde-peptide- 2 -microglobuline poursuit alors son trajet vers l appareil de Golgi, où la chaîne lourde est glycosylée, puis vers la membrane plasmique. Les chaînes lourdes vides, c est-à-dire sans peptide, sont retenues dans le réticulum endoplasmique par liaison à des protéines résidentes du réticulum (calnexine et calréticuline), de telle sorte que la plupart des molécules HLA de classe I qui atteignent la surface cellulaire contiennent un peptide antigénique. Protéolyse, transfert des peptides antigéniques et leur chargement sur les molécules MHC qui les amènent à la surface cellulaire, toutes ces étapes font partie d un mécanisme que l on appelle apprêtement antigénique (antigen processing

112 107 peptides par des molécules MHC de classe II, bien qu il soit, comme nous le verrons plus loin, tout à fait différent. TCR HLA-A,,C Lymphocyte T CD8 Fig Apprêtement des peptides antigéniques présentés par les molécules HLA de classe I. Quasi toutes les cellules de l organisme utilisent ce type de présentation d antigènes. Golgi réticulum endoplasmique ß2m peptides TAP chaîne lourde protéasome cytosol ARNm protéine "endogène" C. PRÉSENTATION DES ANTIGÈNES AUX LYMPHOCYTES T CD4 + le marqueur membranaire CD4. En anglais, le nom de ces cellules est T helper, d où l abréviation T H, utilisée fréquemment.

113 Découverte du mécanisme de présentation d antigènes aux T auxiliaires des macrophages, mais jamais dans les lymphocytes. On a constaté ensuite (Table 6-1) que les cellules de la rate d un animal immunisé contre l ovalbumine proliféraient dès qu elles étaient incubées in vitro avec l antigène, alors qu elles restaient indifférentes au lysozyme, une protéine sans parenté antigénique avec mais cette fois en éliminant l antigène par lavage après l incubation avec les macrophages, les lymphocytes T proliféraient aussi. On en concluait que les macrophages, après avoir capté l antigène, le présentent d une cellules présentatrices d antigène ou APC (Antigen Presenting Cells). Table 6-1. Rôle des macrophages dans la présentation d un antigène aux T auxiliaires Cellules de souris immunisées contre l ovalbumine (OVA) Antigène Prolifération Cellules spléniques OVA +++ Cellules spléniques Lysozyme - présentatrices du même haplotype (Fig. 6-7). Le rôle des cellules présentatrices d antigène n est pas limité à l ovalbumine. Le protocole était le même : mesure de la prolifération après mélange avec des macrophages préalablement incubés avec la protéine pendant 3 h et lavés pour qu il n y ait plus d antigène libre (Table 6-2). Si l incubation a eu lieu à 4 C ou dure 30 min au lieu de 3 h, la prolifération ne survient pas, ce qui suggère que l activité métabolique des macrophages est nécessaire. De même, si la membrane des a dénaturé partiellement les protéines membranaires, ne diminue pas la reconnaissance par le lymphocyte T, alors qu une telle dénaturation réduit nettement, comme nous l avons vu au Chapitre 3, la réactivité de ces d ovalbumine protéolysée, faisaient proliférer l hybridome. Après séparation des différents peptides, il est 30 min d incubation pour rendre les macrophages capables d activer l hybridome et cette incubation pouvait

114 soient reconnus par les lymphocytes T. 109 Race 2 ou 13 ou F1 (2x13) Race 2 ou 13 ou F1 (2x13) antigène macrophages de la cavité péritonéale antigène 7 jours ganglions lymphoïdes source de lymphocytes T race 2 race 13 F1 (2x13) source de macrophages "pulsés" : race 2 race 13 F1 (2x13) macrophages "pulsés" lymphocytes T prolifération? Fig Démonstration expérimentale de la restriction MHC dans l activation des lymphocytes T auxiliaires. Table 6-2. Présentation de l antigène par les macrophages à un hybridome T de souris anti-ova Traitement des macrophages Prolifération de l hybridome Incubation avec OVA, 3h à 37 puis lavage +++ Incubation avec OVA, 3h à 4 puis lavage - Incubation avec OVA, 30 min à 37 puis lavage - l haplotype H-2 d. Les macrophages d une souris H-2 k, après avoir endocyté OVA, étaient incapables de faire +, la restriction porte sur les molécules MHC de classe II, I-A ou I-E chez la souris. d d moyen d un peptide synthétique dans lequel avaient été incorporés des acides aminés marqués par un radioisotope. Le peptide s est effectivement associé à I-A d à I-A k ni à I-E d, et un autre peptide de l ovalbumine ne s associait pas à I-A d.

115 Structure des molécules HLA de classe II La structure générale des HLA de classe II est similaire à celle des HLA de classe I, en particulier en ce qui 1 et 1 forment un plancher avec des feuillets qui bordent la fente. Celle-ci est plus En moyenne, ils ont une longueur de 15 acides aminés. Certains de ces acides aminés servent, comme dans les molécules de classe I, de système d ancrage au peptide. Comme pour les molécules HLA de classe I, le polymorphisme allélique des molécules HLA de classe II affecte surtout les acides aminés qui bordent la tels peptides. α1 -NH2 -NH2 S-S β1 Fig Vue supérieure d une molécule HLA de classe II (HLA-DP, DQ, ou DR). Chaque chaîne de la molécule ( et ) contribue pour moitié à la constitution du plancher en feuillet plissé, et forme une paroi de la fente avec une hélice. 3. Apprêtement des peptides présentés par les molécules MHC de classe II des peptides par les molécules de classe II. Des inhibiteurs de protéases ou l augmentation de ph à l intérieur des lysosomes bloquent le processus. La vésicule d endocytose qui contient une protéine dite exogène, car elle n a pas été synthétisée dans la cellule présentatrice, fusionne avec un lysosome, dont les protéases actives à ph acide dégradent la protéine en peptides (Fig. 6-9). Les molécules HLA de classe II sont synthétisées dans le réticulum endoplasmique. système TAP, car un bout de séquence d un polypeptide appelé chaîne invariante occupe

116 111 Lymphocyte T protéine "exogène" TCR CD4 HLA-DR, DQ, DP Cellule présentatrice d'antigène Golgi endosome réticulum endoplasmique lysosome spécialisé chaîne invariante ARNm Fig Apprêtement des peptides présentés par les molécules HLA de classe II. Nous voyons donc que les principales différences entre les fonctions des molécules MHC de classe I et de classe II sont : l origine des peptides antigéniques qu elles présentent: - intracellulaire pour MHCI - CD8 + pour MHCI - CD4 + pour MHCII

117 112 D. DISTRIUTION DES MOLÉCULES HLA ET CELLULES PRÉSENTATRICES D ANTIGÈNES sont cependant variables. Par contre la présence de molécules HLA de classe II est limitée à quelques types cellulaires : macrophages, cellules dendritiques, cellules de Langerhans de la peau, lymphocytes, cellules épithéliales du thymus. La densité des molécules de classe I est forte sur les cellules du système immunitaire. Par contre, elle est Plasmodium de la malaria peut y survivre sans être détecté par des lymphocytes T cytolytiques CD8 +. Sous l action de l interféron- des molécules HLA de classe I augmente fortement. Comme nous le verrons plus loin, les molécules de classe II présentes sur l épithélium du thymus interviennent dans la sélection des lymphocytes T (thymocytes), qui viennent à maturité dans cet organe. + par leur antigène, qui, comme nous l avons vu plus haut, nécessite la présence de cellules T CD4 + parce qu elles portent des molécules HLA de classe II. Puisque les antigènes présentés par les molécules de classe II proviennent essentiellement de protéines endocytées, il n est pas étonnant de constater que les macrophages sont des cellules présentatrices d antigènes reconnaissent (voir coopération T-). Remarquons bien que pour les antigènes reconnus sur des molécules de classe I, quasi toutes nos cellules sont capables d effectuer la présentation, mais par contre seuls quelques types cellulaires peuvent présenter des antigènes sur des molécules de classe II. E. IMPLICATIONS DU PHÉNOMÈNE DE LA RESTRICTION MHC Le récepteur du lymphocyte T interagissant à la fois avec le peptide et la molécule HLA, on peut comprendre que s il est présenté par HLA-A2 et pas sur HLA-A3 (Fig. 6-10). Il faut tout d abord que le peptide ait la structure adéquate pour être capté par la molécule HLA. Si cette condition est remplie, il faut encore que le TCR soit complémentaire de la molécule présentatrice. Le polymorphisme allélique des gènes MHC de classe I et II implique que les individus diffèrent quant à leur capacité à présenter tel ou tel peptide. Ainsi tous les individus d une même espèce n ont pas nécessairement la même capacité de défense vis-à-vis d un agent pathogène donné.

118 113 récepteur de lymphocyte T HLA-X HLA-Y HLA-Z Fig Principes de la restriction HLA de classe I. Le principe est le même pour la classe II. Ce polymorphisme a été sélectionné au cours de l évolution car il a favorisé la survie de l espèce. En effet, si tous les individus d une espèce avaient le ou les mêmes gènes MHC, ils se défendraient tous contre un agent pathogène donné en reconnaissant les mêmes antigènes. Le pathogène, dont le génome est souvent très instable, pourrait évoluer vers un variant ayant des mutations dans les séquences codant ces peptides contraire, le polymorphisme des gènes MHC permet la survie de l espèce, car tous les individus n ont pas les mêmes gènes MHC, et donc certains peuvent échapper au virus muté car ils se défendent en reconnaissant d autres peptides antigéniques. Au niveau de l individu, c est le fait qu il dispose de plusieurs gènes (polygénisme) MHC qui lui une assure une probabilité élevée de présenter au moins un peptide de chaque pathogène, même si ce dernier a subi des est généralement le cas. F. PRÉSENTATION CROISÉE D ANTIGÈNES EXOGÈNES des molécules MHC de classe I. Cette présentation dite «croisée» (ou «cross-présentation») implique que l antigène internalisé, qui serait normalement présenté par des molécules MHC de classe II, rejoigne la voie de présentation par les molécules MHC de classe I. Les mécanismes de la cross-présentation sont encore l objet de recherches, et pourraient impliquer un transfert de vésicules depuis les endosomes vers le réticulum endoplasmique, ou le passage de peptides depuis l intérieur de vésicules de phagocytose vers le sont obtenus avec les cellules dendritiques, et on ne sait pas encore si d autres cellules présentatrices ont active la réponse cytolytique avant la dissémination virale et l infection de nombreuses cellules.

119 114 CHAPITRE 7. DÉVELOPPEMENT DES LYMPHOCYTES T Comme les immunoglobulines, les récepteurs des lymphocytes T (T cell receptor : TCR) comprennent des autres clones de lymphocytes T. Cette diversité est générée par les mêmes mécanismes que pour les immunoglobulines, mis à part le fait que des mutations somatiques ne se produisent pas dans les gènes des TCR. A. GÉNÉRATION DES LYMPHOCYTES T Les lymphocytes T proviennent de précurseurs qui migrent de la moelle osseuse vers le thymus, où ils syndrome de DiGeorge chez l homme, associé à une délétion d une région du chromosome 22, ou en cas de mutation nude chez la souris. Le nom de cette mutation vient du fait que les souris concernées sont dépourvues de poils. Les thymocytes prolifèrent rapidement, comme le montre l incorporation intense de thymidine tritiée. En injectant à des souris irradiées des cellules de moelle osseuse, on a pu distinguer divers stades dans le développement des thymocytes en fonction de l apparition de différentes molécules de surface (Fig. 7-1). Intensité de la fluorescence verte (CD4) ± 10% ± 5% ± 80% ± 5% Marqueur fluorescent vert (fluorescéine) anti-cd4 CD4 Marqueur fluorescent rouge (phycoérythrine) anti-cd8 CD Intensité de la fluorescence rouge (CD8) Fig Marquage de thymocytes avec des anticorps anti-cd4 et anti-cd8. rescence verte ou rouge. Environ cellules ont été analysées. On distingue clairement quatre populations : CD4 - CD8 -, CD4 + CD8 +, CD4 + CD8 - et CD4 - CD8 +.

120 115 réarrangés. Au moment où apparaît le pseudo-tcr ( + pseudo ), les molécules CD3, CD4 et CD8 sont également présentes (Fig. 4-5). À ce stade, ces cellules, qui prolifèrent, constituent la population la plus des molécules MHC, 95 % de ces cellules vont mourir d apoptose et être ingérées par des macrophages. deviennent donc CD4 - CD8 + ou CD4 + CD8 -, ce qui correspond au stade de maturité et à leur passage comme lymphocytes T naïfs dans la circulation sanguine. Le développement des thymocytes s opère de la périphérie vers la médullaire du thymus (Fig. 7-2). Les plus jeunes se trouvent dans la région sous-capsulaire ; les cellules CD4 + CD8 + matures, dans la médullaire, d où ils vont passer dans le sang. Région sous-capsulaire CD CD Cellule épithéliale Cortex Sélection positive CD CD Médullaire Sélection négative Cellule dendritique Fig Développement des thymocytes.. SÉLECTION DES LYMPHOCYTES T Lors des réarrangements de segments de gènes des TCR, les associations aléatoires fournissent un thymocytes dits autoréactifs sont éliminés avant d atteindre le sang et les organes lymphoïdes secondaires. Cette élimination porte le nom de sélection négative. Elle constitue un des mécanismes de la tolérance naturelle. T subissent en plus une autre sélection. En effet, nous avons des lymphocytes T qui reconnaissent des peptides antigéniques présentés sur nos propres molécules HLA, mais nous n en avons généralement pas qui reconnaissent des antigènes sur des molécules HLA que nous ne possédons pas, et qui ne peuvent pas reconnaître d antigène sur une de nos propres molécules HLA. C est-à-dire que parmi tous les TCR

121 propres molécules HLA. Ce processus est appelé sélection positive Sélection positive thymique qui interviennent dans la sélection positive. Seuls les thymocytes dont le TCR peut interagir avec les molécules MHC présentes sur les cellules épithéliales pourraient survivre. Plus de 95% des thymocytes CD4 + CD8 + sont incapables de reconnaître les molécules MHC présentes dans le thymus et meurent. La sélection positive est donc un sauvetage des cellules porteuses d un TCR restreint par un MHC du soi. irradiée en lui injectant la moelle d une autre souris. Or, la souris donneuse est d un groupe H-2 différent. Après immunisation, la reconnaissance de l antigène sera-t-elle restreinte par le H-2 du donneur ou du receveur? MHC a x b moelle osseuse MHC a MHC b Immunisation avec protéine x lymphocytes T lymphocytes T lymphocytes T Prolifération en présence de la protéine X présentée par des cellules présentatrices d'antigène (CPA) CPA Prolifération CPA Prolifération CPA Prolifération MHC a MHC a MHC a MHC b MHC b MHC b Fig Démonstration de l existence de la sélection positive des lymphocytes T. Des souris d haplotypes MHC a ou MHC b lymphocytes T de la rate sont stimulés in vitro avec leur antigène présenté par des macrophages spléniques MHC a ou MHC b. On a constaté que les lymphocytes T qui dérivent de la moelle injectée et qui sont venus à maturité dans le thymus de la souris receveuse ne réagissent que lorsque le peptide antigénique est présenté par des molécules

122 117 receveur était dépourvu de toute cellule d origine hématopoïétique, il paraît probable que ce sont les cellules qui ont survécu à l irradiation, c est-à-dire les cellules épithéliales, qui ont servi à l écolage ou sélection positive des précurseurs T du donneur. à l intérieur des thymocytes (Fig. 7-4). - antigène du soi. - S il n y a aucune interaction, le thymocyte meurt aussi car sa différenciation ne peut se poursuivre sans une certaine interaction avec les molécules MHC. La sélection positive ne peut avoir lieu. - probable que cette interaction est faible parce que le TCR se lie au MHC mais pas au peptide présenté. MHC II Cellule présentatrice MHC I pas d'interaction: mort par apoptose CD4 + CD4 CD8 interaction faible: survie (sélection positive) ou TCR Thymocyte interaction forte: mort par apoptose (sélection négative) CD Sélection négative Lorsque un lymphocyte T mature rencontre son antigène, c est à dire que ses TCR établissent une interaction sécrète des cytokines, parfois il lyse la cellule qui présente l antigène. Au contraire lorsqu un thymocyte rencontre son antigène présenté par une cellule stromale du thymus, il meurt par apoptose. L administration d un même antigène peut donc activer les lymphocytes T matures d un individu au niveau des organes lymphoïdes secondaires comme les ganglions lymphatiques, tout en induisant la délétion clonale des souris H-2d transgéniques pour les chaines et peptide de l ovalbumine présenté par I-Ad. Quasi tout les thymocytes et lymphocytes T de cette de l ovalbumine, les lymphocytes T matures prolifèrent dans les organes lymphoïdes périphériques, mais tous les thymocytes meurent. Par contre, si l immunisation est réalisée en administrant localement (en sous-

123 118 drainant le site d immunisation, permettant l activation de lymphocytes matures sans induire de délétion clonale au niveau du thymus. La sélection négative des thymocytes commence dans la corticale du thymus, au contact des cellules épithéliales corticales, et se poursuit dans la médullaire dont les cellules dendritiques et les cellules épithéliales médullaires médullaires du thymus possèdent cette propriété particulière grâce à une protéine appelée AIRE (pour de ce mécanisme est illustré par un syndrome appelé APECED (pour Autoimminue PolyEndocrinopathy comme les parathyroïdes, les surrénales, la thyroïde et le pancréas suite à leur destruction par des lymphocytes auto-réactifs. Ces patients sont porteurs de mutations inactivatrices du gène AIRE et l absence de protéine AIRE fonctionnelle dans le thymus permet à des lymphocytes T auto-réactifs d échapper à la sélection négative et d induire une réaction auto-immune dans les organes périphériques. C. MARQUEURS DES LYMPHOCYTES T 1. Marqueurs de la lignée T Il est présent sur tous les lymphocytes T et et sur aucune autre cellule. - CD2 est une molécule d adhérence qui appartient à la superfamille des Ig, elle est présente sur tous les lymphocytes T mais pas sur d autres cellules. Son ligand, également membre de la superfamille des Ig, s appelle LFA-3 pour Lymphocyte Function Associated (CD58) est présent sur les cellules présentatrices 2. Marqueurs de différenciation des lymphocytes T de différenciation dans le thymus, l état d activation ou de repos, la fonction effectrice ou l état de cellule mémoire, les capacités de migration, etc... des molécules MHC de classe II pour CD4 et de classe I pour CD8. On comprend ainsi que CD4 très semblables dont la partie N-terminale est faite d un domaine de la superfamille des Ig. Aucun

124 119 Le rôle de CD4 et de CD8 serait double. D une part, ces molécules, par leur liaison au HLA, augmentent l avidité globale de l interaction entre le lymphocyte T et la cellule présentatrice d antigène (Fig. 7-4). D autre part, CD4 et CD8 participent à la stimulation du lymphocyte T. En effet, leur portion intracellulaire se lie à une enzyme de la famille des tyrosine kinases, qui phosphorylera, lors de l activation lymphocytaire, les séquences ITAM des chaînes CD3. autocrine, ce qui veut dire qu elle -9 et. Après stimulation antigénique, et sous l action de l IL-2 elle-même, la troisième chaîne du récepteur, pour constituer ainsi un récepteur complet chaîne du récepteur, parfois appelée Tac pour T activated ou CD25, est donc un marqueur d activation des lymphocytes T. 3. Tétramères tester au laboratoire l activité lytique ou la production de cytokines par une population de lymphocytes T, à laquelle manquent les portions transmembranaires et intracytoplasmiques. On produit également de la 2-microglobuline recombinante. Les protéines recombinantes produites dans des bactéries s y trouvent sous forme d amas insolubles parce que les protéines n ont pas leur structure normale et s agrègent. Il faut solubiliser ces protéines dans de l urée ou du thiocyanate de guanidine, puis retirer lentement l agent chaotropique pour que les protéines aient l occasion de se replier et de prendre leur forme normale. Ici on effectue cette étape de renaturation en mélangeant les chaînes lourdes et ß2m recombinantes, et en ajoutant 2m + peptide antigénique] solubles, qui contiennent tous le -6 M, pour permettre une liaison avons vu pour l IgM.

125 120 une forme de primo-infection par le virus d Epstein-arr, les lymphocytes T CD8 qui s accumulent dans d épitopes du virus (Fig. 7-5). cellule cible HLA-I + peptide TCR protéines recombinantes (bactéries) + + peptide renaturation lymphocyte T biotine tétramère fluorochrome avidine anticoprs anti-cd8 couplés au colorant Tricolor % 6.6% 5.6% donneur A donneur donneur C Tétramères [HLA-A2 + GLCTLVAML] couplés à la phycoérythrine Fig Production et exemple de marquages avec des tétramères. La production de tétramères s effectue au départ de protéines recombinantes produites dans E. coli. Pour obtenir des protéines MHC solubles on clone dans un plasmide transmembranaires et intracytoplasmique par une séquence d ADNc qui code pour une courte séquence protéique reconnue au MHC, à un endroit où il n interfère pas avec la reconnaissance par le TCR. + par un anticorps anti-cd8 et un tétramère HLA-A2 contenant le peptide GLCTLVAML qui est dérivé d une protéine du virus EV et qui est reconnu par des lymphocytes T CD8. Le donneur A est séronégatif pour EV, les donneurs et C font une mononucléose infectieuse aigüe. On voit qu une proportion importante, environ 6%, des lymphocytes CD8 + des donneurs et C sont par HLA-A2 ou d autres molécules HLA de classe I, qui sont également reconnus. Au total, on a pu établir que lors de ces transitoire: la proportion de CD8 anti-ev va diminuer et se stabiliser autour de 0.1 à 1% des CD8. Ce qui reste cependant très du virus, ni d ailleurs d une mononucléose infectieuse.

126 121 D. LOCALISATION DES LYMPHOCYTES T ont montré que les précurseurs des lymphocytes T provenaient bien de cet organe et qu ils ne pouvaient plupart des précurseurs lymphocytaires arrivent dans le thymus par la zone corticale, s y divisent et passent continuellement dans la zone médullaire, et quittent le thymus par la circulation sanguine pour rejoindre les ganglions lymphatiques et la rate. paracortex des ganglions lymphatiques, qui ne contient pas de centres germinatifs, follicules, a un aspect normal. Dans la rate (Fig. 3-22), les lymphocytes T se trouvent dans la pulpe blanche (zone lymphoïde), où ils sont concentrés dans les manchons périartériolaires plus particulièrement dans les régions situées immédiatement autour des artérioles.

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