14H30 15H00 : Les nouvelles techniques de séquençage du VHC Sylvie LARRAT (Grenoble)

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1 SYMPOSIUM INNOVATIONS VIROLOGIQUES Modérateurs : Vincent THIBAULT (Rennes) & Stéphane CHEVALIEZ (Paris) 14H30 15H00 : Les nouvelles techniques de séquençage du VHC Sylvie LARRAT (Grenoble)

2 Menu Le Next generation sequencing (NGS) qu est ce que c est? - Intérêt du NGS en virologie -Comment ça marche? -Quels outils? Exemples d applications VHC: -résistance -évolution -Rechute/ré-infection -génome complet

3 Réaction de Séquençage x (000) Principe de base Sanger = 1 ère génération (ABI: 1986) NGS = 2 ème génération 454 Roche, Ion Torrent, Illumina NGS = 3 ème génération PacBio, Oxford Nanopore,

4 Intérêt en virologie Recherche des mutations de résistance présentes à de faibles pourcentages Chevaliez, Gastroenterology, 2012 Analyse de zones plus étendues du génome voire du génome complet Analyse de diversité/phylogénie intra et inter hôte, infections mixtes, sur-infections Découverte de nouveaux virus métagénomique/viromes

5 Intérêt en virologie Quinones-Matineu, J Clin Virol, 2014

6 Le NGS en pratique Enrichissement de l échantillon en séquence d intérêt Préparation de la librairie Amplification clonale Séquençage Analyse bioinformatique

7 enrichissement Enrichissement sans enrichissement Enrichissement non spécifique Enrichissement viral Enrichissement spécifique Anchored multiplex PCR SPIA/ cdna-aflp /Rolling circle/ Techniques physiques: UC, filtration, Dnases,. PCR capture Nombre de read nécessaire pour l analyse

8 Préparation de la librairie Amplicon taille read Amplification avec amorces comprenant MID et adaptateurs Grands fragments (taille> read) Shotgun Fragmentation chimique, physique ou enzymatique Petits fragments Taille reads Amplif non spé Ligation d adapteurs génériques

9 Amplification clonale PCR en émulsion PCR «en pont» sur plaque de verre

10 Incorporation des dntp

11 Profondeur vs longueur

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13 NGS 3ème génération: single molecule Plus d étape de PCR clonale Séquençage >10 kb PacBio Oxford nanopore Metzker, Nature Reviews Genetics 2010 Schaffer, MIT technology review, 2012

14 the Sequel System: The Scalable Platform for SMRT Sequencing

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16 Apparition mutation résistance Dynamique des variants résistants sur 4 échecs PR+TPV Pas de lien entre mutations à baseline et SVR pour PR+TPV (R155K/T/Q?) Trimoulet et al., Antiviral Therapy, 2013

17 Prédiction à baseline? pas de lien entre mutations (seuil 1%) à baseline et SVR sur PR + IP (n=20) (n=20) Larrat, JCM, 2015

18 Analyse de la diversité: Prédiction à baseline? where n is the number of different species identified, fi is the observed frequency of the particular variant in the quasispecies, and N is the total number of clones analyzed N=40 Larrat, JCM, 2015

19 Prédiction à baseline? 30 patients G1b non F4 traités par DCV+ASV 83,3% SVR Lien entre présence de RAV et SVR (p<0,001) Kinugasa H, Antiviral Therapy, in press

20 Recherche résistances inconnues Ré-analyse Φ III Gilead (SOF/R ou SOF/PR) : 224 échecs/982 subjects 676 analyses NGS L159F (n=12) et V321A (n=5) émergent chez 2.2% - 4.4% des échecs. (seuil -: 1% seuil +: 10%) Polymorphisme en 316 RVS chez G1b (n=6) Donladson, Hepatology, 2015

21 Evolution Primo-infection: génome complet (FLX 2 ou 3 PCR ss-type spé) : Bottleneck 1= transmission 1 ou 2 souches établissent une infection Bottleneck 2 : 100 jours PI diversité virale et émergence d une nouvelle souche dérivant des souches initiales pour les 2 patients qui passent en infection chronique Bull, Plos Pathogens, 2011

22 Rechute ou Ré-infection? 99 HSH VIH PI VHC traités/pr 15 échecs (6 RR, 6NR, 3RP) En séquençage direct: 10/15 suspicion de ré-infection NGS: HVR1-454 FLX 15/15 émergence d une population pré-existante Abdelrahman, Hepatology, 2015

23 VHC génome complet: pourquoi? 1-Typage précis + description nouvelles souches 2-Détection des mutations de résistance en 1 seule analyse + mut compensatoires Jackowiak, Infect Genet Evol., 2014 ; Galli, Trends microbiol, 2014; Cuypers, Viruses, 2015

24 VHC Formes recombinantes Formes recombinantes 2/1: 12 / % des génotypes 2 dans études Gilead SPIA+ Illumina MiSeq 11seq complètes/12 8 relapses/11: RVS12=27%!!! Hedskog, Hepatology, 2015

25 VHC génome complet Amplif non spécifique (geno indep): SPIA FLX 1-6,4% Reproductibilité: 6/10 Bartoloni, Dig and Liv Dis, 2015

26 VHC génome complet: Détection d un virus recombinant HCV genomic RNA P9S1 5 NC 3 NC Retro-transcription Control PCRs Whole genome PCR BootScan - Query: P1 FileName: \\exploitation.chug.alp\fldrdr$\frchug1\slarrat\my Documents\Bureau\Pauline\basesimplot.pir b 1h 1a 1c 1e 1g 1l 2a 2c 2d 2r 2j 2e 2i 2k 2q 2m 2b 2l Position Window: 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Reps: 100, Kimura (2-parameter), T/t: 2,0, Neighbor-Joining 802 unique genomic sequences covering the recombination breakpoint with at least 30 2k-upstream and 30 1b-downstream nucleotides Ramière et al, Eurosurveillance, 2014

27 VHC Génome complet Identification de nouvelles souches Trémeaux et al, submitted

28 VHC génome complet 180 Analyse 3D N Tarbouriech et W Burmeister Trémeaux et al, submitted

29 Audebert et al., Médicine/Science 2014

30 Merci pour votre attention

31 Back-up slides

32 Take kome messages NGS: Profondeur de séquençage = f(amplif spé/non spé/ sans amplif) Actuellement compromis biais/ coût Arrivée des technologies single molecule de 3 ème génération Résout les problème d haplotypage étude des quasiespèces Applications: -pas d intérêt de rechercher en NGS les pop minoritaires avant ttt -Intérêt ++: recherche de nouvelles mutations -Etudes d évolution ( cf. 3G) -Génome complet : -recombinants - typage nouvelles souches -étude des mutations + large

33 VHC génome complet Approche Sans amplif: 3 patients 1 run Illumina IIx Ninomiya JCM, M seq 76pb (87M hum)> 1.5M pat 1; 7M pat 7 et 0.7M pat 9 Approche 4 amplicons: 4 patients 1 run GS Junior Lauck, J Virol, 2012 Amorces G1a spécifiques seq/ chaque génome 916 à 1125 X

34 Appli: virus discovery: amplif non spé cdna-aflp Rolling circle amplification Sequence independent single-primer amplification

35 Mutations pré-existantes à baseline N= WT à baseline (98%) 11 (2%) ont mutations 5 V36M 1 V170A Souches 100% mutées 1 R109K 4 R155K V36M et R155K même IC50 Bartels DJ, JID, 2008

36 Suivi après traitement Thomas (Netherlands), Plos One, ans plus tard après avoir reçu 14 jours de monothérapie TPV 454 GS FLEX 2 amplicons analyse AVA