INVESTIGATIONS TECHNIQUES EN PHYSIOPATHOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE Partie I. La transfection. Responsable : Valérie Chopin.

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1 INVESTIGATIONS TECHNIQUES EN PHYSIOPATHOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE Partie I La transfection Responsable : Valérie Chopin LBH semestre 6 Faculté des Sciences Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Moléculaire Bat minimes [email protected]

2 La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe ADN exogène = - 1 ADNc - 2 plus récemment sirna ou shrna

3 La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe 1 Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule = protéine exogène Transformation = Transfection Infection (méthode virale) Surexpression de cette protéine grâce à la machinerie cellulaire (transcription/traduction) ADN ARN protéine exogène (2) Etude in situ (1) Etude à partir de lysat protéique (activité enzymatique) ribosomes Une cellule eucaryote

4 La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe 2 Transfert de sirna ou de shrna = ARN interference Extinction génique (inhibition production protéine par élimination de son ARNm)

5 La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe 2 Transfert de sirna ou de shrna Généralités sur l ARN interférence

6 La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe 2 Transfert de sirna ou de shrna Les différents ARNi sirna (synthèse chimique 16 à 21nt) Prêt à agir après phosphorylation dsrna (double strand : souvent virus) shrna (small hairpin) Produit à partir de plasmides Découpés par DICER en sirna mirna (micro : in vivo mais 21 à 24nt)

7 La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe 2 Transfert de sirna ou de shrna Le principe général

8 Techniques d introduction d une séquence ribonucléotidique Réactifs chimiques - Calcium phosphate - DEAE-dextran - Liposomes artificiels Méthodes physiques - Microinjection directe (dans la cellule ou le noyau) : animaux transgéniques - Electroporation (perturbation de la membrane par un choc électrique) - Propulsion de microprojectiles contenant de l ADN (in vivo) : plantes Utilisation de particules virales - Rétrovirus - Adénovirus - Particules virales non infectieuses

9 Réactifs chimiques DEAE-dextran 1965 par Vaheri et Pagano Technique classique, in vitro DEAE-dextran = polymère cationique Association avec les acides nucléiques chargés négativement Endocytose cytoplasme noyau

10 Réactifs chimiques Calcium phosphate 1973 par Graham et van der Eb Technique classique et bon marché, in vitro Mise en contact de l ADN avec du chlorure de calcium dans un tampon phosphate Formation d un précipité entre le calcium et l ADN Précipité dans la cellule par endocytose ou phagocytose

11 Réactifs chimiques Liposomes artificiels 1980 par Fraley et co. Efficacité de transfection, fragments d ADN, types cellulaires, in vitro et in vivo Liposomes = lipides cationiques (+ lipides neutres) Réaction avec les acides nucléiques chargés négativement Compaction de l ADN = complexe liposomes-adn Endocytose cytoplasme noyau

12 Réactifs chimiques Liposomes artificiels

13 Réactifs physiques Electroporation Embo J 1982 par Neumann and co Efficacité de transfection (5 fois plus que techn chimiques), fragments d ADN, types cellulaires, in vitro et in vivo et surtout possibilité de transfection cellules en Go nucleofection

14 Applications (in vitro) 1. Surexpression de protéines absentes dans un type cellulaire donné : sa fonction - sa localisation in situ Promoteur du vecteur ADNc codant pour la protéine - son interaction avec d autres protéines de la cellule ou une autre protéine transfectée (co-transfection avec 2 plasmides) Etude de l activité d un promoteur et sa régulation in situ Promoteur à étudier Gène rapporteur Elaborer une lignée cellulaire immortelle protéine exogène = Antigène T du virus SV40 Promoteur du vecteur ADNc codant pour l Ag T - 2. Modifier un gène existant / inhiber l expression d un gène existant

15 Surexpression de protéines : Mise en évidence ADN ARN protéine exogène Etude in situ ribosomes Transfection d un ADNc codant pour une protéine non modifiée - Détection par immunocytochimie ou par Western blot Transfection d une construction possédant l ADNc d intérêt et une étiquette («tag») = Protéine de fusion - GFP (Green Fluorescent Protein) - HA, flag, c-myc (anticorps) ADNc protéine de fusion tag

16 Etude de l activité d un promoteur : Mise en évidence promoteur gène rapporteur galactosidase ADN lysat protéique ARN protéine exogène activité enzymatique β galactosidase Mesure quantitative in situ galactosidase ribosomes β-galactosidase (spectrophotomètre) Luciférase (luminescence) Effet de facteurs endogènes (facteurs de transcription) Effet de facteurs exogènes sur l activité du promoteur - facteurs de croissance ajoutés dans le milieu de culture - transfection avec une 2 ème construction codant pour une protéine pouvant réguler le promoteur étudié = co-transfection

17 Préparation de l ADN à transfecter Réalisation de constructions plasmidiques : vecteur + ADNc/promoteur-gène rapporteur ETUDE catégorie de vecteurs à utiliser Vecteur commun d expression Plasmide GFPtag Plasmide activité promotrice

18

19 Vecteur commun d expression Promega

20 Plasmide GFPtag ou étiquette GFP Promega

21 Plasmide permettant d étudier l activité d un site spécifique d un promoteur Clontech

22 Deux approches Transfection transitoire - Analyse de la transfection à h -Perte du plasmide en quelques jours Transfection stable -Transfection à long terme - L ADN est généralement intégré au niveau chromosomique - Isolation des clones cellulaires par dilutions limites (clonage cellulaire) -Criblage par résistance à un antibiotique des clones possédant l ADN transfecté (néomycine, hygromycine, ) semaines

23 Exemple BUT : Transfecter des cellules COS avec des constructions plasmidiques contenant différents ADNc Technique des liposomes Plasmide 1 Plasmide 2 Plasmide 3 Protéine X-GFP Protéine Z-HA β galactosidase Fluorescence directe Immunocytofluorescence Réaction enzymatique colorimétrique

24 Plasmide 1 Protéine X-GFP ADN * X-GFP Fluorescence directe (vert)

25 Plasmide 2 Protéine Z-HA ADN Immunocytofluorescence Z-HA * (2) (1) (1) Anticorps de souris anti-protéine HA (anticorps primaire) Immunocytofluorescence (2) Anticorps de chèvre anti-igg de souris conjugué à la rhodamine (TRITC) (anticorps secondaire) *

26 Avantages Plasmide 3 (1) Mise en évidence facile et rapide (2) Mesure quantitative (in situ) : nombre de cellules bleues / population totale β Galactosidase (3) Mesure qualitative (dosage colorimétrique : Luciférase) Réaction enzymatique colorimétrique (cellules bleues) Substrat de l enzyme = X-gal Rôle de ce type de construction (1) Vérifier que le type cellulaire utilisé peut être transfecté (2) Mesurer une efficacité de transfection

27 Plasmide Protéine Z - HA + Protéine X - GFP Localisation de 2 protéines au niveau d une même cellule Besoin de 2 fluorochomes

28 Mise en évidence de la présence d une cellule Noyaux (PI: iodure de propidium, DAPI, YOYO, ) Filaments d actine, cytosquelette (rhodamine-phalloïdine) Marqueurs spécifiques du réticulum endoplasmique Marqueurs membranaires Marqueurs généraux = La cellule en entière ou des structures particulières