Laboratoire Cerba. Congrès SHIP Marseille 15 Octobre 2010

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1 Diagnostic prénatal non invasif à partir du sang maternel > J.M. COSTA Laboratoire Cerba Congrès SHIP Marseille 15 Octobre 2010

2 Diagnostic prénatal in utero en France : quelques chiffres clés Toutes indications confondues Nombre de fœtus testés Nombre de fœtus atteints > Pertes fœtales théoriques (0,5-1%) (ratio: 1/5-1/10) Diagnostic des anomalies chromosomiques : Age maternel ( 38 ans) pour 394 trisomies 21 détectées Marqueurs sériques pour 415 trisomies 21 détectées > Pertes fœtales théoriques (0,5-1%) pour 809 trisomies 21 détectées (ratio: 1/2.6-1/5.2)

3 Procédure non invasive de diagnostic prénatal Obtention de cellules foetales Sang maternel

4 Diagnostic prénatal in utero des anomalies chromosomiques et génétiques : approche invasive Objectif Obtention de cellules fœtales pour: Analyse de génétique moléculaire Mise en culture et établissement du caryotype fœtal

5 Diagnostic prénatal à partir du sang maternel Cellules fœtales circulantes 1893 trophoblaste «pulmonaire» (Schmorl) 1959 trophoblastes circulants (Douglas) 1969 lymphocytes Y (Walknowska) 1979 isolement cellules fœtales par FACS (Herzenberg) 1990 érythroblastes foetaux (Bianchi) 2002 étude NIFTY I 2010???

6 Diagnostic prénatal à partir du sang maternel Cellules fœtales circulantes Prenat Diagn 2002;22: Echec pour 17 % des échantillons Taux de détection de cellules T21+ (FISH) : 74,4 % (4% faux positifs)

7 Diagnostic prénatal à partir du sang maternel Cellules fœtales circulantes : les difficultés Quantité : 1 à 2 par ml de sang Pas de culture possible Analyse «unicellulaire» délicate Isolement et enrichissement complexes (méthodes immunologiques) Persistance («microchimérisme fœtal»)

8 Diagnostic prénatal à partir du sang maternel Un «nouveau» concept L ADN fœtal sérique ou plasmatique (ADN fœtal libre circulant) Lancet 1997;350: Détection de séquences ADN dérivées du chromosome Y : 80 % (24/30)

9 ADN fœtal plasmatique Physiopathologie Origine cellulaire: les cellules trophoblastiques

10 ADN fœtal circulant Physiopathologie Processus de relargage dans la circulation maternelle: apoptose cellulaire Veines utérines Passage pulmonaire (?) ADN circulant

11 ADN fœtal plasmatique Physiopathologie Origine cellulaire: les cellules trophoblastiques Apparition précoce dans la circulation maternelle (détection 5-6SA) Augmentation de la concentration tout au long de la grossesse Disparition rapide (< 48 h) après accouchement (1/2 vie 16 min) Pas de persistance après grossesse

12 ADN fœtal plasmatique Difficultés et limites Analyse moléculaire Séquençage MLPA, QF-PCR Caryotype moléculaire (CGH-array, SNP-array)

13 ADN fœtal plasmatique Difficultés et limites d analyse Ne représente que 3 à 6% de l ADN plasmatique Quantité faible au 1 er trimestre : Geq/ml

14 Analyse de l ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel Y X Détermination du sexe fœtal : Recherche de séquences dérivées du chromosome Y (gènesry)

15 Détermination du sexe foetal Intérêts Maladies génétiques liées à l X Eviter un geste invasif (CVS) chez les patientes conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque) Hyperplasie congénitales des surrénales (déficit en 21-hydroxylase) Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile) Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie Aide à la prise en charge.

16 Analyse de l ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel RHD+ RHD- Génotypage RHD fœtal : séquences dérivées du gène RHD

17 Analyse de l ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du système rhésus Blood 1991;78: Nat Genet 1993;5:62-5. N Engl J Med 1993;329:

18 Analyse de l ADN fœtal circulant: application au génotypage RHD Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif Upstream Rhesus box Downstream Rhesus box

19 Analyse de l ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel RHD+ RHD- Génotypage RHD fœtal : séquences dérivées du gène RHD Ce qui a changé! Plus de recours à l amniocentèse chez les patientes alloimmunisées pour évaluation foetale Plus d injection systématique d immunoglobulines anti-d chez les patientes RhD-négatives après un geste invasif (villosités choriales ou amniocentèse) Intérêt: environ 30% des fœtus sont RhD-négatifs

20 Analyse de l ADN fœtal plasmatique Recherche de séquences absentes du génome maternel RHD+ RHD- Génotypage RHD fœtal : séquences dérivées du gène RHD Ce qui a changé! Plus de recours à l amniocentèse chez les patientes alloimmunisées pour évaluation foetale Plus d injection systématique d immunoglobulines anti-d chez les patientes RhD-négatives après un geste invasif (villosités choriales ou amniocentèse) Ce qui est nouveau! Prophylaxie anti-d à 28-32SA ciblée chez les patientes RhDnégatives dont le fœtus est de génotype RHD positif

21 Génotypage RHD fœtal à partir du sang maternel: principe Les bases moléculaires du système rhésus Sensibilité Ex5 Ex7 Ex10 Allèle RHD Caucase Afrique noire Allèle RHD Neg «classique» Allèle RHD- «RHD-CE-D s» Allèle RHD- «RHDψ» % <1% <1% 18% 15% 67% Fréquence du phénotype RhD-négatif: 15-17% 3-5%

22 Aspects règlementaires L analyse de l ADN fœtal circulant est un acte de diagnostic prénatal Laboratoires : Autorisation de diagnostic prénatal par l ARH Praticiens : Agrément par l Agence de la Biomédecine Déclaration annuelle des activités diagnostiques

23 Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques (ou caractéristique génétique)? Un défi technologique majeur-1

24 Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques (ou caractéristique génétique)? Le challenge CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACAGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG CCATGTCTTTGCAGCCGAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCCTG

25 Détection d une population minoritaire d allèle muté: exemple de la PCR-HRM Proportion de l allèle muté au sein d un background «sauvage» 5% 2.5% 1% 0%

26 Analyse de l ADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus Mutation de novo : achondroplasie Recherche de la mutation G380R du gène FGFR3 Ce qui va changer? (validation clinique en cours) Complément à l analyse échographique Ce qui pourrait se faire? Hypochondroplasie Nanisme thanatophore Syndrome d Apert

27 Analyse de l ADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus K1 K2 SNP paternel : génotypage KEL (K1) Recherche du variant Thr193Met du gène KEL Ce qui va changer? (validation clinique en cours) Plus de recours à l amniocentèse chez les patientes alloimmunisées pour évaluation fœtale Ce qui pourrait se faire? Génotypage plaquettaire (HPA1 ) Diagnostic des maladies autosomiques dominantes (paternelle) Test de paternité

28 Analyse de l ADN fœtal plasmatique Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus G551D F508del SNP paternel: diagnostic d exclusion Ce qui pourrait se faire? (publiés) Mucoviscidose Béta-thalassémies Acidémie propionique Amaurose congénitale de Leber Hémoglobine E Dystonie (DYT1)

29 Analyse de l ADN fœtal libre circulant Ce qui paraît impossible..et pourtant! Quantification de SNP maternel Preuve de concept 10 patientes terme moyen: 19SA Béta-thalassémie/Hémoglobine E 5 fœtus correctement génotypés

30 Diagnostic prénatal in utero en France : quelques chiffres clés

31 Diagnostic prénatal non invasif des anomalies chromosomiques (trisomie 21)? Un défi technologique majeur-2

32 ADN fœtal plasmatique et trisomie Quantification de marqueurs NON-SPECIFIQUES 95 copies maternelles 5 copies foetales 95 copies maternelles 7.5 copies foetales Chr21 mère Chr21 foetus Foetus Euploïde Foetus T21

33 ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Dosage chromosomique relatif (RCD) par Digital PCR 95 copies maternelles 7.5 copies foetales 95 copies maternelles 5 copies foetales Ratio:1.025 Ratio:1.000

34 ADN fœtal plasmatique et trisomie Quantification par «massively parallel sequencing» reads chromosomes bridge amplification by synthesis PCR emulsion by ligation Single molecule amplification Massive parallel sequencing

35 ADN fœtal plasmatique et trisomie 21 Quantification par «massively parallel sequencing» 18 patientes (terme médian: 18 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés 15 patientes (terme médian: 14 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés

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