Analyse Chromosomique sur Puce à ADN Applications en Prénatal

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1 Analyse Chromosomique sur Puce à ADN Applications en Prénatal Véronique Satre, Charles Coutton, Gaëlle Vieville, Françoise Devillard et Florence Amblard

2 Maladies génétiques Anomalies chromosomiques Cytogénétique conventionnelle Caryotype 5 à 10 Mb (10x10 6 pb) Etude globale pangénomique

3 Maladies génétiques Maladies monogéniques Génétique moléculaire Analyse des gènes 1 pb 5x10 3 pb Analyse ciblée

4 Maladies génétiques Maladies génomiques : microremaniements (Lupski, 1998) Cytogénétique moléculaire Analyses ciblées : FISH Analyse pangénomique : Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA ou CGH-array)

5 Maladies génétiques Maladies monogéniques Génétique moléculaire Maladies génomiques : microdélétion/microduplication Cytogénétique moléculaire ACPA 50 kb Anomalies chromosomiques Cytogénétique conventionnelle à kb

6 L'Analyse Chromosomique sur Puces à ADN en France Texte de référence : circulaire DHOS/OPRC no du 22 janvier 2007 relative au soutien exceptionnel accordé pour le développement dans les centres hospitaliers universitaires de plateaux techniques hospitaliers mutualisés de génétique constitutionnelle dans le cadre de la mise en œuvre du «Plan national maladies rares». Circulaire DHOS/OPRC no du 31 décembre 2007 relative au renforcement dans les centres hospitaliers universitaires des plateaux techniques hospitaliers mutualisés de génétique constitutionnelle pour la détection des microremaniements chromosomiques, déjà soutenus en 2007, dans le cadre de la mise en œuvre du «Plan national maladies rares»

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8 Analyse Chromosomique sur Puces à ADN Mise en évidence de perte ou de gain de matériel génétique Etude globale du génome Différents types de puces mais surtout puces à oligonucléotides Fragments d'adn d'environ 60 pb spécifiques d'une région

9 Résolutions variables Environ oligonucléotides répartis sur la puce 3 kb 15 kb 50 kb Espace moyen entre les sondes Chromosome 17

10 Extraction ADN Technique de l ACPA

11 ADN Témoin ADN Patient Mélange en quantité égale et hybridation sur la lame (puce)

12 Interprétation Lecture de la puce Patient = Témoin Quantité d ADN identique chez le patient et le témoin -2 copies / 2 copies - ratio de fluorescence log2(2/2) = 0

13 Interprétation Patient Témoin Quantité d ADN moindre chez le patient par rapport au témoin -1 copie / 2 copies -délétion hétérozygote - ratio de fluorescence log2(1/2) = -1

14 Patient Témoin Quantité d ADN supérieure chez le patient par rapport au témoin -3 copies / 2 copies -duplication - ratio de fluorescence log2(3/2) = 0,58

15 Interprétation Lecture de la puce Mise en évidence de CNV : Copy Number Variation Fragments d'adn de plus de pb (1 kb) qui varient entre les individus Normalement présents en 2 copies : 1 sur chaque chromosome mais pouvant être présents en 0, 1, 3 copies ou plus 12 % du génome humain : 1447 polymorphismes Etude HapMap : 270 individus sains : Yorubas d'ibadan, au Nigeria, Japonais de Tokyo, Chinois Han de Beijing et Européens du Nord et de l'ouest Plus de 41 % des CNV contiennent des gènes

16 Définition du CNV Postnatal Variations d au moins 3 sondes consécutives Résolution moyenne 60 K : 150 kb 180 K : 50 kb Exigence minimale : 400 kb Prénatal? Nombre de sondes consécutives?? En cours d évaluation : 400 kb? 1,5 Mb?

17 Répartition des CNV enfants avec déficience intellectuelle et malformations congénitales adultes témoins sains Analyse des CNV en excluant les CNV polymorphiques communs (fréquence > 1 % dans la population générale) Patients Témoins Seuil 400 kb : 25,7 % patients versus 11,5 % témoins Seuil 1,5 Mb : 11,3 % patients versus 0,6 % témoins Cooper et al, Nature Genetics 2011

18 Classification des CNV Utilisation de bases de données Bases de données de témoins Polymorphismes individus : 53 % hommes et 47 % femmes, 44 populations différentes

19 Classification des CNV Bases de données de témoins Bases de données patients

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23 Polymorphismes sans conséquences Variations pathogènes Vérification de l'anomalie pathogène par une autre technique FISH si possible Mécanisme chromosomique Analyse chez les parents Anomalie héritée ou de novo Pénétrance incomplète et expressivité variable Seulement facteur de prédisposition? Problème majeur de conseil génétique

24 Variant Of Unknown Signification : VOUS Aucune ou très peu d'information dans les bases de données Analyse des gènes présents Expression cérébrale? Rôle de la protéine? Etude des parents Critères de Lee et al, 2007 et Miller et al, 2010

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26 Variant Of Unknown Signification : VOUS Aucune ou très peu d'information dans les bases de données Analyse des gènes présents Expression cérébrale? Rôle de la protéine? Etude des parents Critères de Lee et al, 2007 et Miller et al, 2010 CNV de prédisposition sans rapport avec l indication Cancer, pathologie de révélation tardive Pathologie génique récessive (par exemple : gènes mucoviscidose ou DMD) Information à transmettre?

27 Indications de l'acpa Postnatal Déficience intellectuelle +/- malformations +/- variants morphologiques Gain d'environ 15 % - 20 % par rapport au caryotype Examen de première intention? Problème du coût et du non remboursement Enveloppe budgétaire fixe Dépôt d un dossier de demande de mise à la nomenclature auprès de l HAS le 13 septembre 2013 : rejet/discussion fin 2014?

28 Indications de l'acpa Prénatal? Nombreuses études

29 Prenatal Diagnosis 2012, 32, Etude sur 2858 grossesses avec anomalie(s) échographique(s) et caryotype normal Indications Nombre et % anomalies pathogènes 1 seule anomalie échographique Anomalies écho dans 2 systèmes ou plus Anomalie de croissance isolée 99/1773 5,6 % 77/808 9,5 % 2/76 2,6 % Signes mineurs 2/77 2,6 %

30 3,1 5,6 9, fœtus 18 études 1/1500 incidental finding

31 Indications de l ACPA Prénatal? Gain diagnostic d environ 5 à 10 % par rapport au caryotype en présence de signes d appel échographiques Incidence des VOUS 1 à 2 % Recommandations

32 Indications de l ACPA en prénatal

33 215 grossesses uniques avec naissances vivantes et caryotypes normaux 1,4 % de CNV mais aucun pathogène, classés VOUS polymorphisme Augmentation risque autisme

34 Limites de l ACPA Remaniements chromosomiques équilibrés : translocations, inversions Triploïdies, tétraploïdies Mosaïque de faible pourcentage 10 % On ne voit pas tout! 141 fœtus avec signes d appel échographique et puce 180 K normales : Diagnostic postnatal d un syndrome clinique dans 15 % des cas (21 patients) dont 30 % mutation génique (Vetro et al, 2012)

35 Diagnostic prénatal par ACPA en ,7 % 8,8 % ACPA en postnatal en 2012 : 20,9 % de CNV pathogènes Sondage réseau en 2013 : Réponses 24 centres / 44 Prévision nombre d ACPA en prénatal : environ 5 000

36 En pratique pour l'acpa en prénatal Consultation de conseil génétique pour explication sur l ACPA (limites) Consentement Nouveau prélèvement fœtal parfois nécessaire Prélèvements des 2 parents (héparine et EDTA) Vérification de l absence de contaminations maternelles Fœtus féminin indispensable Vérification d une éventuelle anomalie dépistée Durée de l'analyse longue, peut-être supérieure à 1 mois

37 Notre expérience en prénatal 40 ACPA réalisées 6 ACPA en en 2013 dont 6 depuis septembre 25 en 2014 Indications 4 anomalies apparemment équilibrées au caryotype 3 caractérisations d'une anomalie déséquilibrée identifiée au caryotype ou par MLPA 11 pour nuque ou HKN 3,5 mm (3,5 à 5,5 mm) 22 SAE

38 Résultats ACPA 4 anomalies apparemment équilibrées au caryotype 3 ACPA normales 1 délétion hétérozygote 20p11 héritée maternelle : VOUS 3 caractérisations d'une anomalie déséquilibrée identifiée au caryotype ou par MLPA 1 marqueur chromosomique hérité : polymorphisme 1 délétion 6q27 : pathologique 1 duplication 17q12 : VOUS 11 pour nuque ou HKN 3,5 mm (3,5 à 5,5 mm) 22 SAE 10 ACPA normales 1 duplication Xp22.2 héritée maternelle chez un fœtus fille : VOUS (3 gènes OMIM, effet chez un garçon?) 21 ACPA normales 1 délétion 13q31.1 : pathologique