Réplication de l ADN
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- Suzanne Paradis
- il y a 8 ans
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1 Réplication de l ADN
2 Réplication de l ADN: expériences historiques
3 I] Expérience de Meselson et Stahl
4 Replication de l ADN est semie-conservative Expérience de Meselson et Stahl :1958 -Cultive E.Coli sur milieu contenant uniquement de l isotope lourd N15, pendant plusieurs générations. -Bactéries sont lavées et mises à cultiver sur milieu contenant uniquement N14 pendant une génération. Parental N15/N15 1 ière génération N15/N14
5 II] Mise en évidence des ADN polymérases et du mécanisme de la réplication: in vitro
6 IIa] Synthèse in vitro Arthur Kornberg (père) a réalisé la première synthèse d ADN in vitro: -ADN -dntp marqué au P32 pour montrer l incorporation de la radioactivité dans la chaine néoformée. L idée étant de ne pas utiliser des dnmp pourtant constituant de La chaine d ADN. -DNApol de E.coli à partir d extrait grossier -Précipitation des macromolécules par ajout d un acide organique (sépare l ADN ayant incorporé de la radioactivité des dntp P32. Cette expérience prouve que qu une synthèse in vitro d ADN peut être effectuée mais ne démontre pas le mécanisme semi-conservatif et que l ADN néo synthétisé est «actif». Il s est avéré que Kornberg a utilisé la DNApol I
7 IIb] Synthèse in vitro d un ADN biologiquement actif par un mécanisme semi-conservatif -actif? Capacité d infection d un ADN de bactériophage FX174. ADN SB circulaire de 5000 nucléotides (brin+). -But recréer in vitro le cycle du bactériophage. -1 problème: comment lier le brin- après synthèse. Ligase. -2 problème : comment séparer brin+ et brin- 5-bromodésoxy-uridine. -3 problème: le brin- n étant pas infectieux, il faut resynthétisé un brin+ à partir de ce brin-. Après purification seul le brin+ néoformé est infectieux.
8 III] Notion de fourche de réplication Expérience de Cairns
9 Réplication de l ADN
10 I] ADN polymérases Ia] E. Coli -ADN pol I -ADN pol II -ADN pol III: réplicase
11 Activitées -Activité 5-3 polymérase -Activité 3-5 exonucléase -Activité 5-3 exonucléase
12 Ib] Phages
13 Ic] ADN polymérases eucaryotes supérieurs -DNApol b: réparation de l ADN, pas d activité exonucléase. Levure ADN pol II -DNApol e: synthèse du brin continu. réparation -DNApol g: ADN mitochondrial. -DNApol a-primase: complexe qui synthétise des amorces d ARN-ADN pour le brin avancé (précoce), synthétise les fragments d Okazaki du brin retardé (tardif). Pas d activité exonucléase. Primase Levure ADN pol I -DNApol d: principale, brin retardé, possède une activité 3 5 exonucléase. (Pol III ). Intervient également dans la réparation. Levure ADN pol III
14 Domaines catalytiques des ADN pol
15 Id] Amorces Différent types d amorces utilisées par les ADN pol
16 Synthèse discontinue et synthèse continue
17 I] Synthèses
18 II] ligase Ligation des fragments d Okazaki
19 III] Autres protéines
20 IV] Procaryotes ADN pol III
21 Replication
22 V] Eucaryotes
23 VI] Terminaison -Procaryotes
24 -Eucaryotes?
25 VII] Origine de la fourche de réplication: procaryotes Ori C
26 VII] Origine de la fourche de réplication: eucaryotes
27 Transcription
28 I] Mécanisme général
29 II] Synthèse des ARNs
30 III] Différentes étapes de la transcription
31 ARN polymerase et transcription: procaryote (E. Coli)
32 I] ARN polymérase
33 II] promoteur et facteur s Régions d ADN reconnues par l ARN pol Régions de s interagissant avec l ADN
34 Facteurs s et exemple d infection par le phage SPO1
35 III] Autres enzymes
36 -Intrinséque IV] Terminaison
37 -Rho dépendante
38 -Facteur antiterminaison
39 ARN polymerase et transcription: eucaryote
40 ARN polymérases eucaryotes Enzyme Position Produit Activité relative ARN polymérase I Nucléole ARN ribosomal 50-70% ARN polymérase II Nucléoplasme ARN hétérogéne nucléaire 20-40% ARN polymérase III Nucléoplasme ARNt, petits ARN ~10%
41 Facteurs auxiliaires -Facteurs généraux: nécessaires à l initiation de la synthèse des ARNm au niveau de Tous les promoteurs. Facteurs généraux + ARNpol: appareil de transcription élémentaire -Facteurs en amont: reconnaissent de courtes séquences d ADN. Activité non régulée. -Facteurs inductibles: reconnaissent de courtes séquences d ADN appelées éléments de réponse.
42 Facteurs de transcription
43 I] ARN polymérase II
44 II] Transcription par l ARN pol II: reconnaissanceinitiation
45 II] Transcription par l ARN pol II: initiation-élongation
46 III] Méthodes d études des promoteurs
47 III] Méthodes d étude d un promoteur 1) Utilisation d un gène rapporteur a) Principe b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase c) Luciférase d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo 2) Exemples
48 Principe du gène rapporteur Transfection transitoire Gène rapporteur Analyse de l expression du gène rapporteur Promoteur
49 III] Méthodes d étude d un promoteur 1) Utilisation d un gène rapporteur a) Principe b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase c) Luciférase d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo 2) Exemples
50 Chloramphénicol Acétyl Transférase Gamme étalon
51 III] Méthodes d étude d un promoteur 1) Utilisation d un gène rapporteur a) Principe b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase c) Luciférase d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo 2) Exemples
52 Luciférine Luciférase
53 III] Méthodes d étude d un promoteur 1) Utilisation d un gène rapporteur a) Principe b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase c) Luciférase d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo e) Exemple d étude: promoteur de la b-globine 2) Technique de Footprinting 3) Technique de retard sur gel
54 Gènes rapporteurs: b-galactosidase et GFP
55 2) Etudes de promoteurs:exemples
56 Méthodes d étude des facteurs de transcription 1) Technique de Footprinting 2) Technique de retard sur gel
57 Footprinting
58 SP1 Exemple de Footprinting: site SP1 SP1 Promoteur: WT Muté
59 Méthodes d étude des facteurs de transcription 1) Technique de Footprinting 2) Technique de retard sur gel
60 Technique du retard sur gel Dépots Piste A: fragment d ADN* sans extrait nucléaire Piste B: mélange de l ADN* et des protéines nucléaires
61 Technique du gel super retard Dépots ADN*+ Protéines+ Anticorps ADN*+ Protéines ADN*
62 Exemple de l élément en cis: Mu
63 IV] Facteurs de transcription et inhibitions
64 V] Mécanisme d action des facteurs de transcription -Mécanisme général
65 V] Mécanisme d action des facteurs de transcription -Exemple de la protéine TAT
66 V] Mécanisme d action des facteurs de transcription -Notion de co-activateur
67 L Enhancer est situé souvent à plusieurs kpb du promoteur, la question est donc de savoir:comment un Enhancer peut-il stimuler l initiation de la transcription?
68 Rôle d un Enhancer
69 VI] Mécanisme de terminaison de la transcription
70 Gènes morcelés
71 Exemple du gène de la globine
72 Epissage alternatif
73 Epissage alternatif
74 Coiffe
75 Site consensus d épissage nucléaire chez les eucaryotes supérieurs Boite de branchement (A/C)AGGU(A/G)AGU UAUAAC YnN(C/U)AGG(G/U)
76 Principe général
77 UAUAAC Mécanisme: in vitro UAUAAC UAUAAC UAUAAC
78 Réactions chimiques: estérifications
79 Le spliceosome -RNP (ribonucléoprotéines) contenant les ARNsn (small nucleus) RNPsn/spliceosome -RNPsn directement impliquées dans l épissage: U1, 2, 4, 5 et 6 -RNPsn: les ARNsn lie au moins 1 protéine appartenant à la famille des Pt Sm sauf ceux de U6 (Lsn) -Autres protéines non Sm: facteurs d épissage.
80 Exemple : RNPsn U1
81 Mécanisme: in vivo Exon1-Exon2 Intron
82 Autres types d épissage eucaryotes
83 Exemple de mécanisme de l épissage alternatif Si ASF/SF2 Si SF5
84 Notion d épissage en Trans
85 Epissage des ARNt
86 Mécanisme d épissage des ARNt
87 Mécanisme de terminaison des ARNm polya+
88 Mécanisme de terminaison des ARNm polya-
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