LE GROUPAGE ABO (H) ET RHESUS STANDARD

ETSL LE GROUPAGE ABO (H) ET RHESUS STANDARD TP 2 GABIN-GAUTHIER 11/11/2009 I. HISTORIQUE... 2 II. GENERALITES SUR LES GROUPES ABO (H)... 2 1. DEFINITION... 2 2. NATURE ET SYNTHESE DES AG ERYTHROCYTAIRES... 3 3. ASPECTS GENETIQUES... 3 3.1. L ag H... 3 3.2. Les Ag A et B... 4 4. REGLES TRANSFUSIONNELLES... 4 III. GENERALITES SUR LE SYSTEME RHESUS... 4 IV. DETERMINATION DES GROUPES ABO (H)... 5 1. PRINCIPE... 5 2. TECHNIQUE SUR LAME... 6 2.1. Préparation de l échantillon... 6 2.2. Témoins... 6 2.3. Epreuve globulaire de Beth Vincent... 7 2.4. Epreuve sérique de Simonin... 7 V. DETERMINATION DU RHESUS STANDARD... 7 1. PRINCIPE... 7 2. TECHNIQUE SUR LAME... 7 VI. FEUILLE DE RESULTATS... 9

2 LE GROUPAGE ABO (H) ET RHESUS STANDARD TP 2 I. Historique Les 1ers essais de transfusions sanguines remontent au milieu du XVIIème siècle (vers 1622) par le médecin britannique Richard Lower, qui transféra du sang des veines d un chien à un autre chien. Deux ans plus tard, le médecin français Jean Denis fut le 1er à transférer du sang d un animal à un jeune garçon anémique de 16 ans. Des accidents mortels se multiplièrent et les transfusions furent interdites mais reprirent à la fin du XIXème siècle grâce aux travaux du chirurgien anglais J. Bludell. Cependant des accidents hémolytiques graves survenaient fréquemment et si la transfusion réussissait parfois, elle ne faisait souvent que précipiter le décès (agglutination puis lyse des hématies, destruction des reins etc.). Karl Landsteiner, médecin et biologiste autrichien, se proposa de surmonter ces difficultés et il avait observé, en mélangeant du sang de plusieurs personnes, qu il y avait parfois une agglutination des hématies et parfois non. Il a ainsi classé les sangs humains en groupes A, B, O et AB et a montré que la transfusion sanguine était sans risque entre des individus possédant le même groupe sanguin. Il a obtenu le prix Nobel en 1930 pour cette découverte. Cette découverte se prolonge en 1940, en collaboration avec les américains Levine et Wienner, par la découverte du d=système Rhésus puis du système M et N. Depuis d autres systèmes ont été découverts à la surface des hématies comme par exemple Lewis, Kell, Duffy, Kidd etc. Les plus importants, pour les transfusions sanguines, sont les sytèmes ABO (H) et Rhésus standard. II. Généralités sur les groupes ABO (H) 1. Définition Ils se définissent par la présence où l absence : D Ag de nature glycoprotéique à la surface des globules rouges (Ag A, Ag B, Ag H) encore appelés agglutinogènes. D Ac dans le plasma (Ac antiag A, Ac antiagb) encore appelés agglutinines. Ces Ac sont dits naturels, car ils sont présents dans le sang en l absence de toute immunisation connue (ils apparaissent pendant les 3 à 6 premiers mois après la naissance) Un individu donné possède toujours dans son plasma des agglutinines spécifiques d agglutinogènes (Ag) non présents sur ses hématies. Groupes Antigène érythrocytaire Anticorps plasmatique Fréquence en France A Ag A Ac antiagb 45% B Ag B Ac antiaga 9% AB Ag A et Ag B - 3% O Ag H Ac antiagb et Ac antiaga 43%

3 Rq : Cette répartition des groupes sanguins peut présenter de fortes différences en fonction des origines ethniques des individus (68% de O et 32% de B chez les arborigènes d Australie ; 100% de O pour les Indiens du Pérou, majorité de B chez les asiatiques etc.) Les Ag H sont des précurseurs nécessaires à la synthèse des Ag A et des Ag B. Il existe également des sous groupes pour le groupe A : A1 et A2. Les globules rouges dits A1 possèdent beaucoup d Ag A à leur surface, masquant l Ag H. Les globules rouges dits A2 possèdent peu d Ag A à leur surface et beaucoup d Ag H. 2. Nature et synthèse des Ag éry throcytaires Ce sont des glycoprotéines. La structure supportant la spécificité repose sur l assemblage de 2 ou 3 oses précis : L-Fucose, N-acétyl-glucosamine, N-acétyl-galactosamine, D-Galactose (cf. schéma ci-dessous). L Ag H est nécessaire à la fabrication ultérieure des ag A et B et il persiste en général sur les hématies A, B et AB des Ag H non modifiés ; il n existe donc pas chez l homme d Ac anti Ag H humains. 3. Aspects géné tiques 3.1. L ag H Il est codé par un gène présent sur le chromosome 19. Le gène présente 2 variants alléliques H et h : L allèle H code pour une enzyme, la Fucose transférase qui ajoute un fucose à l extrémité terminale de la chaîne glucidique, formant ainsi l Ag H. L allèle h est un gène amorphe et non fonctionnel dont la présence en 2 exemplaires (homozygote) est responsable de l absence d Ag H à la surface des hématies : le phénotype Bombay (observé pour la 1 ère fois en Inde). Ce phénotype Bombay est très rare et ces individus présentent donc des Ac anti Ag H dans leur sérum. Rq : 1 allèle correspond à différentes versions d un même gène, situé sur un même site chromosomique (locus).

4 3.2. Les Ag A e t B Ils sont codés par un gène porté par le chromosome 9. Le gène présente 4 variants alléliques A1, A2, B et O : L allèle A1 code pour une enzyme très active, la N-acétyl-D-galactosamine transférase, rajoutant un N- Acétyl-galactosamine à l extrémité osidique, sur presque tous les Ag H (ils se retrouvent ainsi masqués). L allèle A2 code pour une enzyme moins active, la N-acétyl-D-galactosamine transférase, rajoutant un N- Acétyl-galactosamine à l extrémité osidique, sur quelques Ag H (il persiste donc beaucoup d Ag H). L allèle B code pour une enzyme, la D-galactosyl transférase, ajoutant un D-galactose à l extrémité osidique. L allèle O est dit nul ou non fonctionnel et ne produit aucune enzyme active. A l état homozygote, il conduit à l absence d Ag A et d Ag B sur les hématies (phénotype O). Les allèles A et B sont codominants, l allèle O est récessif. Génotype (Allèles) Phénotypes (groupes sanguins) H/H ou H /h A1/O ou A1/A1 ou A1/A2 A1 H/H ou H /h A2/O ou A2/A2 A2 H/H ou H /h B/O ou B/B B H/H ou H /h A1/B A1B H/H ou H /h A2/B A2B H/H ou H /h O/O O h/h? Oh ou Bombay 4. Règles t ransfusionnelles Aujourd hui, pour éviter tout risque, ce sont les transfusions isogroupes qui sont le plus souvent réalisées. Cependant, en cas de difficultés d approvisionnement, on peut utiliser les règles transfusionnelles classiques (voir schéma ci-dessous). Le groupe O est dit «donneur universel», le groupe AB est dit «receveur universel». Attention, il ne faut pas oublier de tenir compte de la compatibilité Rhésus standard. III. Généralités sur le système rhésus Il possède un intérêt considérable en transfusion sanguine et en obstétrique pour les femmes. Sa connaissance permet de réduire de 95% les risques d immunisation suite à une transfusion sanguine et permet également de prévenir le risque d immunisation foeto-maternelle (cas d une mère Rhésus - portant un enfant Rhésus +). Il a ainsi été nommé car Landsteiner et Wiener, ont en 1940, immunisé un lapin avec des globules rouges d un singe espèce Macaccus rhesus et les Ac ainsi produit se sont avérés réagir avec 85% des globules rouges humains (porteurs de l Ag D ou rhésus standard +).

5 En fait, il existe 49 Ag Rhésus différents mais seuls 5 ont une importance en transfusion : Ag D, Ag C, Ag c, Ag E, Ag e. L expression de ces Ag est contrôlée par 3 gènes voisins, qui se transmettent ensemble et situés sur le chromosome 1. Le 1 er gène code pour une protéine RHD (Ag D) exprimée à la surface des globules rouges. Cette protéine est présente chez 85% des individus en France, et ils sont dits de phénotype Rhésus positif (Rh+ ou D+). Chez les sujets dits de phénotype Rhésus négatif (Rh ou D-), le locus RHD est absent, ce qui à l état homozygote conduit à l absence d Ag D sur la membrane des globules rouges. Le gène D est dominant. Les 2 autres gènes codent pour des protéines dites RHCE et existent chacun sous 2 allèles différents C et c, e et E, qui vont respectivement coder pour les Ag C, c, c et E. Les différents allèles sont codominants. Phénotype Génotype le plus probable Fréquence en France Rhésus Standard D+C+E-c+e+ DCE/dce 34% D+C+E-c-e+ DCE/DCe 20% D+C+E+c+e+ DCe/DcE 13% D+C-E+c+e+ DcE/dce 12% Rh + 85% Autres D+ divers 6% D-C-E-c+e+ dce/dce 15% Rh Autres D- divers < 1% 15% Contrairement aux Ac anti Ag A ou anti Ag B dits naturels, la grande majorité des Ac dans le système rhésus résultent d une réponse immunitaire induite par une grossesse ou par une transfusion sanguine incompatible. L Ag D est le plus immunogène, suivi par les Ag E et c. La compatibilité Rhésus standard (Ag D) est donc obligatoire en transfusion sanguine. Les Ac anti Ag D sont les plus fréquemment impliqués dans les problèmes d incompatibilité fœto-maternelle, on les appelle couramment les «agglutinines irrégulières» ou «Ac irréguliers». Le risque survient lorsqu une femme Rh- porte son deuxième enfant Rh+, et lorsqu au cours de la première grossesse il y a eu passage accidentel du sang du bébé vers celui de la mère. En l absence de traitement, il y a donc un risque de production par la mère d Ac anti Ag D, qui pourront passer la barrière placentaire et attaquer les globules rouges du deuxième enfant Rh + provoquant ainsi la maladie «hémolytique du nouveau-né». IV. Détermination des groupes ABO (H) 1. Principe On doit réaliser deux épreuves d agglutination active directes, simultanément (hématies et sérum à tester provenant du même sang) : Epreuve globulaire dite de Beth Vincent dans laquelle on teste les globules rouges du patient vis-à-vis d Ac agglutinants connus pour identifier les Ag portés par les globules rouges du patient.

6 Epreuve sérique dite de Simonin dans laquelle on teste le sérum du patient vis-à-vis de globules rouges de groupes sanguins connus pour identifier les Ac naturels présents dans le sérum du patient. Témoins pour valider les épreuves de Simonin et de Beth Vincent. Rq : Les deux épreuves doivent être réalisées simultanément et être concordantes. De plus, le groupage sanguin n est valide qu après une deuxième détermination, réalisée par un autre technicien et à partir d un deuxième lot de réactifs. Il s agit d une agglutination car il y a formation d un édifice multimoléculaire, visible à l œil nu entre un Ag particulaire (cellule) et un Ac spécifique. Cette agglutination est dite active, car les Ag font partie naturellement de la particule insoluble porteuse (GR) Cette agglutination est dite directe, car les Ac utilisés sont dits agglutinants, c.a.d. multivalents de type IgM, sans l intervention d aucun artifice. On observe 3 techniques principales : sur lame, en tube, en milieu gélifié. Nous utiliserons la technique sur lame. 2. Technique su r lame 2.1. Préparatio n de l échantillon Le sang prélevé est du sang veineux, prélevé sur anticoagulant (EDTA) et il doit être centrifugé afin de séparer le sérum et le culot globulaire. Le culot globulaire doit être dilué (10%) dans du sérum physiologique (NaCl 9 ). 2.2. Témoins On réalise 3 témoins : «auto», «allo» et «AB». Le témoin «auto» valide Beth Vincent et Simonin, le témoin «allo» valide Simonin, le témoin «AB» valide Beth-Vincent. Ces 3 témoins doivent toujours être négatifs. Les sérums doivent toujours être déposés en 1 er. Témoin «auto» : 1 goutte de GR du patient et 1 goutte de sérum du patient. Permet de vérifier que les GR ne sont pas auto-agglutinables et que le sérum du patient ne contient pas d auto-ac capables de réagir avec ses propres GR. Témoin «allo» : 1 goutte de sérum du patient et 1 goutte de GR du groupe O. Permet de vérifier que le sérum du patient ne contient pas d Ac capables de réagir avec d autres Ag portés par les GR, que les Ag A et les Ag B. Témoin «AB» : 1 goutte de GR du patient et 1 goutte de sérum d un sang de groupe AB. Permet de vérifier que les GR du patient ne sont pas agglutinés par d autres Ac que les Ac anti Ag A et anti Ag B.

7 2.3. Epreuv e globulai re de Be th Vincent On teste les GR du patient, vis-à-vis de sérums contenant des Ac connus. Les sérums doivent toujours être déposés en 1 er. Sur une plaque, déposer côte à côte : Sérum anti A Sérum anti B Sérum anti A + Sérum anti B GR à tester au 1/10 Homogénéiser avec un agitateur. Animer la plaque d un mouvement de rotation pour faciliter l agglutination. Noter l apparition d agglutinats dans un délai d une minute et présenter la plaque à un examinateur. Compléter la feuille de résultats jointe. 2.4. Epreuv e sé rique de Simonin On teste le sérum du patient, vis-à-vis de GR portant des Ag connus. Les sérums doivent toujours être déposés en 1 er. Sur une plaque, déposer côte à côte : Hématies A Hématies B Plasma à tester Homogénéiser avec un agitateur. Animer la plaque d un mouvement de rotation pour faciliter l agglutination. Noter l apparition d agglutinats dans un délai d une minute et présenter la plaque à un examinateur. Compléter la feuille de résultats jointe. V. Détermination du Rhésus standard 1. Principe On doit réaliser une épreuve d agglutination active directe sur les GR du patient pour tester la présence ou l absence de l Ag D. Le test est également validé par 2 témoins : un témoin positif et un témoin négatif. Autrefois, on utilisait une technique d agglutination active indirecte avec des Ac de type Ig G ; il fallait donc une aide extérieure pour réaliser l agglutination : une protéine, la sérum albumine bovine et une température «chaude» (37 C ou 40 C). On peut réaliser cette technique en tubes, sur lame ou en milieu gélifié. 2. Technique su r lame Cette manipulation doit être réalisée devant un examinateur. Déposer sur une plaque d opaline propre et sèche (sérums déposés en 1 er ) : Test Témoin + Témoin - GR à tester Sérum anti-d GR témoin O Rh+ Sérum anti-d GR Témoin O RH- Sérum anti-d

8 Homogénéiser avec un agitateur. Animer la plaque d un mouvement de rotation pour faciliter l agglutination pendant 1 à 3 minutes. Observer la présence ou l absence d agglutination. Compléter la feuille de résultats jointe. Conclure.

9 VI. Feuille de résultats Epreuve.... de.. Sérum anti A Sérum anti B Sérum anti A + Sérum anti B Témoin auto Témoin AB Schéma Interprétation Epreuve..de. Schéma Hématies A Hématies B Témoin auto Témoin allo Interprétation Légende :

10 Détermination Rhésus Standard : Schéma Gr à tester GR O Rh+ GR O Rh- Interprétation Légende :