Biologie Cellulaire & Biologie Moléculaire

Biologie Cellulaire & Biologie Moléculaire Cours n 6 : Mardi 23 septembre 14h- 16h Chap. II Chromosome, épigénédque, réparadon, domaines régulateurs L3 UE 5.2 EP1 2014-2015 118

Immuno- PrécipitaDon de la ChromaDne (ChIP) 4 - Analyse de marqueurs de «Silencing» ChIP Signal de base non spécifique Equilibre de méthylation ou méthylation Temporaire andcorps Cellules MDA- MB- 231 H. M. O Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155 Avec l autorisadon du C.F.C - 20, rue des Grands AugusDns 75006 Paris Fin du cours n 5 119

Document non présenté en cours n 5 QuesDon/Réponse : Certaines méthyladons ou acétyladons font l objet soit d un équilibre dynamique entre «écriture» et «effaçage» (ex. dia. 119, H3K9me2 et H3K9me3 ) soit accompagnent un événement pardculier ou une phase temporaire d un mécanisme (ex. H3K27me3). Lysine : SET Arginine : PRMT HDM ou KDM Pour les méthyladons et acétyladons, les enzymes d «écriture» et d «éffaçage» peuvent aussi agir sur des protéines non- histone Exemple : Facteur de transcrip@on. Avec l autorisadon du C.F.C - 20, rue des Grands AugusDns 75006 Paris Contrôle spado- temporel IntégraDon : état chromadnien/réparadon/transcripdon 120

Western blot 5- acdon de SIRT1 sur protéine non histone protocole : exposidon siarn, inducdon DSB, analyse par western blot Western blot 2 siarn différents Grille de lecture 72 heures AnDcorps : AnDcorps : AnDcorps : AnDcorps : Cellules MDA- MB- 231 H. M. O Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155 Avec l autorisadon du C.F.C - 20, rue des Grands AugusDns 75006 Paris 121

SIRT1: Regulator of p53 DeacetylaDon. p53 : impliqué dans la protecdon du génome, modifié lors des cancers (en andcipadon des Chapitres Cycle cellulaire et TranscripDon) Régulation de SIRT1 p53 : facteur de transcripdon L acétyladon de p53 acdve : sa liaison à l ADN et son acdvité transcripdonnelle Acétyl Transférases des familles : P300/CBP MYST GNAT SIRT1 désactive p53 : peut protéger la cellule d un engagement en apoptose par désactivation de p53ac 122

3- Statut de H4K16 et fixadon de SIRT1 au site de coupure ChIP DOUBLE H4K16ac : gène acdf SIRT1 : H4K16ac déacétylase Deux évènements simultanés ne sont pas forcément directement reliés, il faut le prouver H. M. O Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155 Avec l autorisadon du C.F.C - 20, rue des Grands AugusDns 75006 Paris 123

6- ValidaDon du lien entre dé- acétyladon de H4K16ac et apparidon de SIRT1 Histone et non histone ChIPs siarn 72 heures Immuno- PrécipitaDon de la ChromaDne Contrôle Analyse (ChIP) L inhibidon de SIRT1 par siarn induit un retard dé- acétyladon de H4K16ac à proximité du site de clivage double brin. Avec l autorisadon du C.F.C - 20, rue des Grands AugusDns 75006 Paris H. M. O Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155 124

7- un «DSB» induit le recrutement d ADN Méthyl- Transférases Non- histone ChIP Conclusion : On observe un recrutement d ADNméthyl-transférases à proximité du site de clivage ADN double brin maximum à 8h et persistance sur 24h pour DNMT1 et temporaire entre 4h et 8h après l induction du clivage pour DNMT3B. Immuno- PrécipitaDon de la ChromaDne (ChIP) DNMT3B est chargée d introduire les méthyladons dans l ADN (ex. après un «DSB») et DNMT1 est plutôt chargée du mainden des méthyladons. H. M. O Hagan, PLoS Genet 4(8): e1000155. doi:10.1371/journal.pgen.1000155 Avec l autorisadon du C.F.C - 20, rue des Grands AugusDns 75006 Paris 125

IllustraDon Recrutement d ADN méthylases : DNMT Deux mécanismes de fixation : par dé-méthylation préalable ou par fixation directe Dé- méthyladon de H3K4me La méthylation de l ADN entraîne une répression génique et une inhibition de la fixation des facteurs de transcription. Lecture des acdvités : voir glossaire à venir 126

Polycopié Cours n 5 127

Acteurs de la structuradon chromadnienne : 18 4 ADN méthyl- transférase 1 Histones et variants d histones 3 Nucléosome 2 Chaperons moléculaires d histone (ASF1, NAP- 1, CAF- 1) 8 Complexes Histone acétylase 5 Kinases Sc 7 Phosphatase 6 Adaptateur 5 Kinases Hs ATR ATM 9 Histone déacétylases HDAC SIRT 1 18 LncARN 10 Histone méthylases 11 Histone déméthylases 12 Complexes de Remodelage ISWI 13 Co- acdvateur 14 Co- répresseur 15 «Mediator» 16 Facteurs de transcripdon 17 ARN polymérase II 128

Classes d Histone déacétylases HDAC Répression transcriptionnelle SIRTUINES Répression Réparation de l ADN Vaquero 2003 Ex. sirtuine : «known to regulate epigenetic gene silencing» Chez l homme SIRT1 agit sur les histones par exemple sur H4K16 mais aussi sur des protéines ex. p53. ReproducDon effectuée par l Université François Rabelais de Tours Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. 129

SIRT1: Regulateur l acdvité de p53 DOUBLE L acétylation de p53 augmente la liaison à l ADN et l activité transcriptionnelle p53 protection du génome, modifié lors des cancers (en anticipation des Chapitres Cycle cellulaire et Transcription) SIRT1 peut protéger la cellule d un engagement en apoptose par désactivation de p53ac Molécules anti-sirt1 à visée thérapeutique Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. 130

Reconnaissance des histones méthylées Bromodomaine : lysine acétyladon Ex. Histone acétyl transférase Chromodomaine: reconnaissance des lysines méthylées Ex. CHP1 (mainden de l hétérochromadne péricentrique, reconnaît H3K9me3) Spécificité de structure (domaine) et de site modifié, comment structurer les connaissances? Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. 131

Chromodomaines Chromodomaine reconnaissance des histones méthylées. Chromodomaine de HP1α (Drosophile) reconnaît H3K9me2 and H3K9me3 Chromodomaine de «Polycomb protein» reconnaît l histone H3K27 méthylée. Implica@on fonc@onnelle des «MPT» des Histones modifica@on H3K4 H3K9 H3K14 H3K27 H3K79 H4K20 H2BK5 H4K16 mono- methyla@on di- methyla@on tri- methyla@on ac@va@on ac@va@on ac@va@on ac@va@on ac@va@on? ac@va@on répression répression ac@va@on HP1 ac@va@on répression répression acetyla@on ac@va@on ac@va@on ac@va@on répression répression répression ac@va@on BPTF : double reconnaissance de H3K4me3, H4K16ac, 132

DOUBLE MéthylaDon H3K4me3 Promoteurs acdvement transcrits, en pardculier juste après le site d inidadon. La déméthyladon entraine l exdncdon de l expression (silencing de la région génomique) H3K36me3 Gène acdfs au plan transcripdonnel H3K9me3(*) Gènes consdtudvement réprimés (hétérochromadne consdtudve ) H3K27me3 Gènes facultadvement réprimés H4K20me3 possibilité d associadon (couplage) de ces trois «marqueurs» AcétylaDon H3K9ac(*) Promoteurs acdfs. H3K14ac Promoteurs acdfs H4K16ac ChromaDne transcripdonnellement acdve http://www.nature.com/ng/journal/v43/n7/fig_tab/ng.869_f1.html 133

Etat chromadnien et épigénédque Tollervey Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. Le passage d un état à l autre demande l intervention de : Complexes de remodelage chromatinien (CRC) 134

Remodelage de la chromadne Remodelage de la chromadne est une modificadon dynamique de l architecture chromadnienne permesant de donner accès à des zones d ADN génomique condensées et permesant la fixadon de protéines régulatrices de la transcripdon ou d autres foncdons (réparadon, réplicadon). (et inversement!) 1 Code histone 2 Complexes de remodelage chromadnien AcDvités ATPase Complexes Guidage Cascades FoncDon 135

ATPases des complexes de remodelage chromadnien Homme SANT : couplage de la fixadon sur les histones l acdvité catalydque de l ATPase. Nat Rev Mol Cell Biol, 3, 422-429 Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. 136

Types de Complexes de remodelage chromadnien ATP- dépendant 4 familles de complexes : SWI/SNF ISWI CHD (NURD/Mi- 2/) INO80/SWR1 : exemple de famille Dont 1 sous- unité à acdvité ATPase qui caractérise le complexe plus sous- unités de Spécificité de reconnaissance et de recrutement RégulaDon de l acdvité du complexe Spécificité de mécanisme Epigenetics. 2009 May 16;4(4):209-11. Epub 2009 May 6. Novel Mi-2 related ATP-dependent chromatin remodelers. Kunert N 1, Brehm A. Author information Abstract Distinct chromatin remodeling complexes can share a common ATPase subunit. The functional characteristics of each remodeling complex are determined by the respective ATPase-associated subunits. The Mi-2 nucleosome remodeling ATPase has so far only been shown to reside within Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) complexes. Here we will review the recent discovery of two Mi-2 related remodelers that function independently of NuRD and that act as SUMO (small ubiquitin-related modifier)-dependent corepressors: First, Mi-2 exists in a novel chromatin remodeling complex, dmec, that does not rely on histone deacetylation to effect transcriptional repression of proneural genes. Second, the Mi-2 related factor dchd3 acts as a monomer and does not associate with additional subunits in vivo. These recent results have uncovered an unanticipated complexity in the composition and function of CHD (Chromodomain-Helicase- DNA-binding) complexes. 137

Human ISWI family of remodeling ATPases complexes «Nucleosome remodeler» ATPases : SNF2L et SNF2H, two mammalian orthologs of ISWI Snf2H Sous-unité de guidage : BPTF NURF, nucleosome remodelling factor Snf2L BPTF Sous unité Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. Fabian Erdel and Karsten Rippe FEBS J 2011 doi:10.1111/j.1742-4658.2011.08282. 138

Décryptage d un complexe de remodelage de la Famille ISWI Sous-unité ATPase Couplage fixation nucléosome activité ATPase Facteur de ciblage de fixation nucléosomique Retinoblastomaassociated proteins Reconnaissance Histone acétylée H4K16ac NUcleosome Remodelling Factor Reconnaissance Histone méthylée H3K4me3 Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. Fabian Erdel and Karsten Rippe FEBS J 2011 doi:10.1111/j.1742-4658.2011.08282. 139

Signaux de guidage des CRC de la famille ISWI Fabian Erdel and Karsten Rippe FEBS J 2011 doi:10.1111/j.1742-4658.2011.08282. Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. 140

BPTF : Deux domaines d un facteur peuvent reconnaître des modificadons sur des histones différentes PHD finger transcrip@on factor PHD- adjacent bromodomain in BPTF BPTF Sous unité du complexe de remodelage chromadnien NURF de la famille ISWI ciblant sa fixadon par une double reconnaissance intranucléosomique de H3K4me2/3/PHD/ et de H4K16ac/Bromodomaine. GST- tagged Membrane histones acétylées (B) A SPOT blot of an array containing all known human core histone acetyladon sites on a modified cellulose scaffold probed with GST- tagged bromodomain. H4pepDdes (residues11 25) acetylated on the 3 amines of lysines 16 and 20, Signal : respecdvely (H4K16ac and H4K20ac). The staining of H2BK85ac (red asterisk) appears to be a pepdde- HRP interacdon, and there is no detectable binding between the bromodomain and this pepdde in soludon. Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. Liaison de deux marqueurs différents sur deux histones d un même nucléosome bromodomaine H4K16ac et PHD finger : H3K4me2/3 141

Banque de nucléosomes modifiés «Nuc- PTMs» Dépôt sur membrane des différentes formes modifiées de nucléosome Figure 1: PreparaDon of a DNL and its use in in vitro ChIP- seq experiments. Nature Methods 11, 834 840 (2014) doi:10.1038/nmeth.3022 From Accelerated chromadn biochemistry using DNA- barcoded nucleosome libraries Uyen T T Nguyen et al. Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. 142

SWI/SNF chromadn- remodeling complexes et plas@cité au cours du développement Facteurs de transcription Facteurs de transcription ChromaDn remodelling during development Lena Ho & Gerald R. Crabtree Nature 463, 474-484(28 January 2010) doi:10.1038/nature08911 Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. CRC de la famille SWI- SNF BRG1 : ATPase brahma- related gene 1 (brahma terminologie chez la «drosophile») BRM : ATP dependent helicase BRM 143

Rôles cellulaires de SWI/SNF : Transcrip@on et autres exemple :«Suppresseur de tumeur» PRC2 : Complexe de méthylation H3K27me3, inactivation de transcription Wilson et al. Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. Terminologie levure/homme : The human analogs of SWI/SNF are BAF (SWI/SNF-A) and PBAF (SWI/SNF-B). BAF in turn stands for "BRG1 (sous-unité catalytique) Associated Factors", and PBAF is for "polybromo-associated BAF". 144

Illustration : complexe de remodelage chromatinien NuRD contenant une ATPase de la classe CHD et impliqué dans la répression chromatinienne «facteur de remodelage» agit par glissement de nucléosome : «Sliding mechanism» HDAC : Histone déacétylase (MBD) méthyl CpG- binding domain Mi- 2 alpha et béta = CHD3/CHD4. These large helicase- like ATPases contain conserved PHD fingers, chromodomains and a putadve DNA- binding domain 145 SA Denslow and PA Wade, Oncogene (2007) 26, 5433 5438 ReproducDon effectuée par l Université François Rabelais de Tours Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C.

Trois aspects de la réacdon à une lésion ADN : Hs, «homme» Etape initiale : La fixation de MDC1 et du complexe MRN («lesion-specific sensor») sur le site lésionnel entraine le recrutement de la sérine thréonine kinase ATM dont l activité permet la phosphorylation du variant d histone H2A.X ( H2A.Xser139P ou γh2a.x) pour induire la réparation et de CHK2 (Check point kinase 2) pour le contrôle du cycle cellulaire. ATM : «ataxia telangiectasia mutated», sérine/thréonine kinase, possède une action majeure de régulation du cycle cellulaire (blocage) qui est activée lors des lésions ADN, phosphoryle diverses proteines dont l histone H2A.X (p53, BRCA1, la «checkpoint kinase» CHK2 et la protéine NBS1) et s autophosphoryle en S1981, favorisant ainsi la réparation de l ADN [Hs]. MRN H2A.X- MDC1 146 A Gospodinov et Z Herceg, Chroma@n structure in double strand break repair. DNA Repair 2013 : 12, p. 800 810 DOI: 10.1016/j.dnarep.2013.07.006 ReproducDon effectuée par l Université François Rabelais de Tours Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C.

Modèle de clivage double brin levure Lésion ADN (DSB) Cascade PhosphorylaDon (Kinases Mec1, Tel1) HAT complexes (NuA4, SAGA, HATB) AcétylaDon Complexes de remodelage (RSC, Swi/Snf) Remodelage RéparaDon (Rad52) PhosphorylaDon Départ des complexes (NuA4) Accessibilité aux protéines de réparadon Cibles des HAT : H4K5ac, H4K12ac Nucléosome H4K5ac, H4K12ac Au site de coupure =HAT CRC =HAT (Spt Ada Gcn5 acetyltransferase) CRC Histone acetyltransferase complexes: one size doesn't fit all Kenneth K. Lee & Jerry L. Workman Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 284-295 (April 2007) Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. Levure S. cerevisiae Modèle de clivage double brin «levure» 147 Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C.

Signal : H2A- phosphorylée Recrutement Arp4/sur histone H2A- Recrutement de NuA4/Arp4 Cascade «DSB» (drosophile) Arp4 : Actine-related- protein 4 Composant des complexes de remodelage chromatinien Ino80 et Swr1 et du complexe histone acétyl-transférase NuA4 AcétylaDon histone H4(NuA4) Recrutement INO80/Arp4 Recrutement Swr1/Arp4 Remplacement histone H2A par H2A.Z grâce à Swr1 (acdvité chaperonne) Remodelage nucléosomique par INO80 Recrutement des complexes de réparadon des lésions de l ADN Thèse CMC Doyen Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. Swi2/Snf2- related ATPase that is the structural component of the SWR1 complex, which exchanges histone variant H2A.Z for chromatinbound histone H2A. Chromatin remodeling INO80 complex which is involved in transcriptional regulation, DNA replication and DNA repair 148

Contrôle ou mise en place séquendelle (cascade) : TranscripDon GCN5 : histone acétyltransferase CBP Histone Acétyl- Transferas e bromodomain containing transcripdon complexes SWI/SNF Bromodomain reconnaissande lysine acétylée TFIID possède 2 bromodomaines Avec l autorisadon du C 20 rue des Grands AugusDns 75006 Paris. F. C. AgalioD T Cell 2002 111, 381 392. 149

Second niveau d organisadon Nucléosome : dynamique structurale ModificaDon de l ADN Code histone Variants d histone Remodelage des nucléosomes Chaperon moléculaire des histones Domaines régulateurs Hypothèse : Réseau fibrillaire protéique sur lequel viennent s insérer des boucles d ADN de 40 000 à 100 000 pb nommés domaines régulateurs Echafaudage (scaffold, métaphase) Matrice nucléaire (interphase) composant : ex. Topoisomérase 150

OrganisaDon des domaines régulateurs 109 Barrière de domaine/insulator Matrix A9achment Region Locus Control Region Sites hypersensibles à la Dnase I Domaine régulateur 40 000 à 10 000 pb Séquences de 140 pb d inserdon dans la matrice nucléaire Matrice nucléaire 151

Chromosome interphasique et noyau 110 Enveloppe nucléaire Membrane interne Lamina nucléaire Lamines A, B et C Chromosome (interphasique) Séquence de 10 000 pb Domaines régulateurs Matrice nucléaire Séquences d inserdon de 140 pb dans la matrice nucléaire 5 4 3 ex. boucle 1 : 2 1 152

Barrière de domaine :«Insulator» protége de «silencing chromadn»/«enhancer» FixaDon du facteur CTCF 111 Organisateur chromatinien CTCF : «CCCTC binding factor» : recrute un complexe de déacétylation et agit comme un répresseur transcriptionnel» http://www.nature.com.gate2.inist.fr/ng/journal/v43/n7/full/ng.857.html Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 December 10; 99(Suppl 4): 16433 16437. The insula@on of genes from external enhancers and silencing chroma@n Bonnie Burgess- Beusse, Catherine Farrell, Miklos Gaszner, Michael Lis, Vesco Mutskov, Felix Recillas- Targa, Melanie Simpson, Adam West, and Gary Felsenfeld * 153

Domaine béta globine : Ouverture du «Locus Control Region» Agencement 3D S : Répresseur transcripdonnel : «silencer» Ordre des gènes sur ce modèle de domaine béta- globine relié à la chronologie de l expression au cours du développement 154

113 NoDon de HUB Système de «terminal» qui focalise différents domaines chromadniens et qui gère leur expression OrganisaDon spadale de l expression 155

The chicken β-globin locus (Upper) showing the four genes, the strong enhancer between the adult β gene (βa) and the ɛ gene, and the constitutive HS, 5 HS4. the constitutive HS, 5 HS4 (/inductible) Burgess-Beusse B et al. PNAS 2002;99:16433-16437 2002 by National Academy of Sciences 156

RégulaDon domaine alpha- globine MRE : Major Regulatory Element FixaDon de protéines régulatrices «HUB» TranscripDon Gavrilov A. Nucleic Acids Res. 2008 August; 36(14): 4629 4640 157

Types de protéines se fixant sur le LCR et les promoteurs globine Dia non présentée 4 types de protéines Exemples : CTCF (insulator, recombinaison) GATA- 1 IKAROS (Double potendalité) Protéines à doigt de zinc qui peuvent recruter des complexes mixtes de «remodelage chromadnien/ modificadons épigénédques (HDAC)» Daan Noordermeer1 and Wouter de Laat1,2, Life, 60(12): 824 833, December 2008 158