Atelier 17 Transfert non viral de gènes dans les cellules en culture : Revue des technologies d électroporation et perspectives de transfection de cellules en osmolarité extrême Plate-forme Biogenouest IBiSA «SynNanoVect» Pascal LYER, Inserm UMR991, Hôpital Pontchaillou, Rennes - Solutions for gene and drug delivery -
Plate-forme «Production de vecteurs de synthèse et vectorisation de bio-molécules» 2 villes et 4 laboratoires : Brest Rennes Inserm U1078 (T. Montier) Responsable UMR CNRS 6521 (P-A. Jaffres) UMR CNRS 6226 (T. Benvegnu) ENSCR Inserm UMR991 (P. Loyer)
Plate-forme «Production de vecteurs de synthèse et vectorisation de bio-molécules» Vectorisation : technologies/vecteurs permettant d'améliorer l'efficacité d'un principe actif en augmentant sa biodisponibilité. Principes actifs : molécules bioactives incluant médicaments, acides nucléiques (ADN, sirna), protéines, etc... Vecteur : structure macromoléculaire capable de véhiculer le principe actif en modifiant sa distribution tissulaire, sa biodisponibilité et/ou ses interactions avec des cellules cibles. Biodisponibilité (propriété pharmacocinétique) des principes actifs : fraction d un principe actif qui : 1) atteint la circulation sanguine et qui est potentiellement active sur l organe cible (in vivo), 2) pénètre dans les cellules en culture. Ciblage : l adressage «spécifique» d un principe actif vers un organe choisi par une vectorisation présentant un tropisme pour cet organe.
Index thérapeutique La Vectorisation et nanovecteurs 3 ème actuelle 2 ème Principes actifs - acides nucléiques - médicaments 1 ère Encapsulation Encapsulation + Furtivité Encapsulation + Furtivité + Ciblage cellulaire Génération, etc. Liposomes nanoparticules nanocapsules Virus
ffre de prestations et de services : Production de vecteurs de synthèse (lipides cationiques et neutres) Formulation et caractérisation physico-chimique de nanoparticules Vectorisation/Transfection d acides nucléiques et de peptides (lipofection, électroporation) et imagerie in vitro et in vivo Recherche & Développement : Nouveaux vecteurs de synthèse (lipides et polymères) pour la vectorisation d acides nucléiques, peptides et de xénobiotiques Vectorisations optimisées in vitro et in vivo (cellules normales et transformées) et ciblage cellulaire/tissulaire CNTACT : www.synnanovect.ueb.eu Responsable de la plateforme : Tristan.Montier@univ-brest.fr
Les prestations : Synthèse de vecteurs de synthèse (lipides et polymères cationiques et neutres) Structure moléculaire du vecteur Caractérisations des Propriétés physico-chimiques Formulation Efficacité du vecteur Conception et synthèse de lipides cationiques et neutres Ciblage Passif: caractéristiques physico-chimiques Actif : Interactions ligands-récepteurs
% in class Les prestations : Formulation et caractérisation de nanovecteurs Caractérisation des propriétés physico-chimiques Size distribution(s) 20 10 5 10 50 100 500 1000 5000 Diameter (nm) SAXS HPTLC DLS - Zétamétrie TEM (cryofracture) MP
Nos vecteurs lipidiques pour la transfection : Vecteurs Applications Molécules délivrées Références GLB-73 In vitro (A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, Hep G2 ) In vivo (Intra Veineuse) pdna Guillaume-Gable C. et coll, Hum Gene Ther. 1998 Floch V. et coll Biochim Biophys Acta. 2000 KLN-5 In vitro (K562, Daudi, Jurkatt) Ex vivo (Cellules dendritiques, Cellules hématopoïétiques CD34+) pdna Montier T. et coll, Biochim Biophys Acta. 2004 Le Gallo M. et coll, J Gene Med. 2008 KLN-47 In vitro (A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28, A375, Hepa RG, Hep G2 ) Ex vivo (cellules épithéliales humaines, hépatocytes humains ) In vivo (Intra Veineuse) pdna GCV (> 100kb) sirna Montier T. et coll, Mol Biotechnol. 2004 Picquet E. et coll, Bioconjug Chem. 2005 Laurent V. et coll. Biotechnology J. 2010 Delépine P. et coll, En préparation BSV-4 (EP8e) In vitro (A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28, A375, Hepa RG, Hep G2 ) In vivo (Intra Veineuse) pdna sirna Picquet E. et coll, Bioconjug Chem. 2005 Le Gall T. et coll, J. Med Chem 2010 Laurent V. et coll Biotechnology J 2010 MM18-DPE In vitro (A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28, A375, Hepa RG, Hep G2 ) pdna sirna Réthoré G. et coll, Chem Commun 2007 Laurent V. et coll, Biotech J 2010 www.synnanovect.ueb.eu
Lipofectamine 2000 FuGENE 6 TransIT TransFectin jetpei Lipofectamine jetpei- Hepatocyte Lipofectin PromoFectin Exgen500 NT GFP positive cells (%) Viability (%) GFP positive cells (%) Viability (%) Nos vecteurs lipidiques pour la transfection : KLN47 KLN 47 Lipophosphoramidate AS P N H As I 50 40 30 20 10 0 NT 0.5 1 2 4 8 16 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Cellules HepaRG 30 25 20 15 10 5 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 (Floch, Loisel et al. 2000; Guenin, Herve et al. 2000) Cellules HepaRG : rhodamine-siarn
Les prestations : Vectorisation et imagerie in vivo (Inserm U1085, Brest) associées à l évaluation de paramètres cellulaires et biochimiques (robot d analyse du sang et plasma : énumération cellulaire, enzymes hépatiques, ionogrammes)
Les prestations : L électroporation (Inserm UMR991, Rennes) Méthode d'introduction de molécules bioactives dans des cellules par l application d un champ électrique de haut voltage pendant quelques millisecondes sur les cellules vivantes (en suspension). Les membranes cellulaires sont transitoirement «déstabilisées» et les molécules à vectoriser, présentes dans l'espace extracellulaire, pénètrent par diffusion et sous l effet du champ électrique dans les cellules (ex: ADN chargé négativement). Voltage : > 1000 volts. Temps : 10 à 40 millisecondes. 1 à 3 pulses. Tampons de resuspension cellulaire pré-définis
L électroporation : La seule méthode non virale de transfert de gènes permettant une expression significative d un vecteur d expression dans des cellules peu ou pas proliférantes (primaires) Cellules HepaRG progénitrices (proliférantes) ou différenciées (quiescentes) : lipofection KLN47 HepaRG progénitrices: Cellules proliférantes HepaRG différenciées «Hepatocyte-like Cells» : Cellules quiescent es
GFP positive cells (%) Fluorescence ratio L électroporation : Transfert d ADN «nu» versus l encapsulation pour la lipofection/polyfection ADN Lipofection vs Electroporation Liposome-ligand ADN Liposome-ligand EP Contraste plasmide protéine GFP Lipoplexe Lipoplexe Noyau Noyau Liposome Endocytose Import nucléaire Endocytose 100 90 Import nucléaire 80 14 12 Sortie des endosomes Sortie des endosomes 70 60 50 10 8 40 6 30 20 10 4 2 0 EP BSV10/DPE R1 GLB43/DPE R1 MM18/Chol R2 0 V. Laurent, A. Fraix, T. Montier, S. Cammas-Marion, C. Ribault, T. Benvengu, PA. Jaffres, P. Loyer. Biotechnol J, 2010, 5, 314-320.
L électroporation : Inserm UMR991 : deux technologies d électroporation. Système «microporator MP100» (Digital Bio, LabTech France, 2007) Disponible sous le nom de système Neon (Invitrogen/Life Sciences)
GFP positive cells (%) Viability (%) GFP positive cells (%) Viability (%) 100 90 80 70 Electroporation (Microporator MP100) : Transfection de cellules HepaRG progénitrices ou différenciées par électroporation (24 tests 0,5 µg pegfp pour 10 5 cellules) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 100 90 80 15 4 5 3 23 9 16 22 8 2 19 12 20 14 24 7 21 11 6 18 13 10 17 NT 60 50 40 30 20 10 0 120 100 70 60 80 50 40 30 20 10 0 5 4 9 3 15 8 12 14 16 20 2 13 7 11 19 17 24 21 6 22 18 10 23 NT 60 40 20 0 V. Laurent, A. Fraix, T. Montier, S. Cammas-Marion, C. Ribault, T. Benvengu, PA. Jaffres, P. Loyer. Biotechnol J, 2010, 5, 314-320. J. Dumont, R. Jossé, C. Lambert, S. Anthérieu, V. Laurent, P. Loyer, MA Robin, A. Guillouzo. Toxicol Appl Pharmacol., 2010, 249, 91-100.
L électroporation : Système «4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, 2011) Nucleofector II: «Amaxa System» (2002) 96-well Shuttle Core unit X unit HT-Nucleofector Y unit 384-well plate nucleofector device V. Laurent, Glaise D, Nübel T, Gilot D, Corlu A, Loyer P. Methods In Mol Biol, 2012, sous presse.
L électroporation : Système «4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, 2011) X unit: 2 options Cuvette strip (20 l, 10 5 cells or «regular» cuvette (100 l, 10 6 cells) V + - 96-well plate Shuttle Cuvette strip (20 l, 10 5 cells) Analyses In situ Analyses ARN-Protéines Criblages banques siarns («in situ reading out»)
L électroporation : Système «4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, 2011) Y unit: For adherent cells Cells cultured in regular 24-well plates and electroporation performed using «dipping electrodes» Phase contrast HepaRG cells GFP Program ED142
R&D de la plate-forme SynNanoVect : Synthèse de nouveaux vecteurs : Lipides d Archébactéries (T. Benvegnu, ENSCR) Cheminées hydrothermales Marais salants Diéther Tétraéther Halophiles H 2 N H H Thermophiles diester ou diéther tétraéther LIPSME rganisation des lipides en bicouche INNVATIN (Brard, Richter et al. 2004; Brard, Laine et al. 2007; Rethore, Montier et al. 2007; (Benvegnu, Rethore et al. 2005; Laine, Mornet et al. 2008; Brevet 2006, ENSCR-CNRS) ARCHAESME rganisation des lipides en monocouche
R&D : Lipides d archéobactéries ou archéolipides (T. Benvegnu, ENSCR) Etudes de stabilité des archaeosomes : relargage de sonde fluorescente H H Diol MB Sonde fluorescente : 4(5)-carboxyfluorescéine M e 3 N + ( C H 2 ) 2 dipc P - P - ( C H 2 ) 2 N + M e 3 Conditions EPC Diol MB dipc Tensioactif, t = 5s 100 % 30 % 80 % lipoprotéines, t = 15h 70 % 80 % 30 % ph = 2, t = 5 min ph = 2, t = 10 min 95 % 95 % 85 % - 20 % 20 % 20 % 1 brevet (2006, co-propriété) avec licence d exploitation ; Chem. Commun. 2005, (44), 5536-5538.
R&D : Les applications des archaeosomes (T. Benvegnu, ENSCR) Transfection d acides nucléiques vers les cellules en osmolarité extrême :. Cellules d organismes marins L administration par voie orale de liposomes véhiculant des médicaments:. Ciblage hépatique après absorption intestinale
R&D : Synthèse et évaluation de mono- et copolymères de polyesters/polycarbonates (S. Cammas-Marion, ENSCR). PMLA : poly(acide malique) Nanocapsule Nanosphère. Nanoparticules plus petites, plus furtives que les liposomes. biocompatibles et (bio)dégradables capables de s auto-assembler en architectures macromoléculaires originales. Structures «cargo» pour des médicaments. Groupements latéraux permettant le greffage d agents de ciblage (peptides hépatotropes) Z.W. Huang, V. Laurent, G. Chetouani, T. Benvegnu, P. Loyer, S. Cammas-Marion, Int. J.Pharm. 2012, 423, 84-92
Procédure pour accéder aux services : Prendre contact avec un responsable de site (www.synnanovect.ueb.eu) Définir le projet étudier la faisabilité (rédaction d une fiche projet) Etablir un devis Réalisation du projet cas du prêt de matériel (électroporation):. Formation d une ou plusieurs personnes, autonomie d utilisation avec suivi de consommation (réactifs) Clôture du projet rendu de résultats Facturation Fiche de satisfaction
Comité de pilotage, de gauche à droite : Thierry Benvegnu, Pascal Loyer, Tristan Montier (Directeur de la plateforme), Paul-Alain Jaffrès Inserm U1078 (T.Montier, MCU, Directeur). Nathalie Carmoy (IE). Tony Le Gall (IR). Yann Sibrill (AI). Caroline Denis (TR). Véronique Laurent (CM) UMR CNRS6226, ENSCR (T.Benvegnu, PU). Jean-Paul Guegan (AI). Sandrine Cammas-Marion (CR). Loïc Lemiègre (MCU). Jelena Jeftic (PU). Thomas Vives (AI) UMR CNRS6521 (PA.Jaffres, PU). Hélène Couthon-Gourvès (MCU) Inserm UMR991 (P.Loyer, CR). Catherine Ribault (TRE). Véronique Laurent (CM)