Documents de Travaux Dirigés TD1 : TECHNIQUES UTILISEES EN BIOLOGIE DU DEVELOPPEMENT (1 ère partie) I) Techniques de microscopie 1) Analyse de la morphologique externe La figure ci-dessous représente des schémas interprétant des observations réalisées avec une loupe binoculaire. Différents stades du développement sont représentés. Donnez un titre à chacune des 4 grandes étapes du développement embryonnaire : 1
2) Vues externes et coupes histologiques Sur cette planche du cycle de développement d un amphibien, retrouvez les grandes étapes de l embryogenèse et du développement, jusqu au stade adulte. Remarquez que, sur cette planche, certains embryons sont schématisés à partir de vues externes (loupe binoculaire). D autres sont représentés à partir d observations de coupes histologiques (microscopie optique). 2) Les plans de coupe a) sur un ovocyte d amphibien avant la fécondation 1 4 2 3 - Orientez et légendez l ovocyte - Nommez les plans 1, 2, 3,4 2
b) sur un embryon au stade du bourgeon caudal Orientez et donnez un titre à chaque figure Définissez chacun des trois plans de coupe 3
II) Microchirurgie embryonnaire : TECHNIQUES DE MICROCHIRURGIE a- Isolement de cellule ou de territoire et mise en culture DANS QUEL BUT, POUR REPONDRE A QUELLE QUESTION? b- Elimination d une cellule ou d un territoire (ligature stade 1 cellule) c- Recombinaisons de territoires embryonnaires d- Greffes (cf. tableau suivant) d- Greffes de territoires embryonnaires : Complétez le tableau suivant 4
III) Analyse moléculaire A) Profil d expression des gènes : Les produits de l expression des gènes sont les ARNm et les protéines qui se forment à partir de ces ARNm. La détection du profil d expression des gènes se fait par des techniques de localisation microscopique d ARN et de protéine : 1) Principe et méthode de l hybridation moléculaire permettant de détecter les ARNm 5
2) Principe et méthodes permettant de détecter les protéines Principe : Les différentes étapes : PROFIL D EXPRESSION DES GENES DANS QUEL BUT, POUR REPONDRE A QUELLE QUESTION? Hybridation in situ Immunocytochimie 6
TD2 : TECHNIQUES UTILISEES EN EMBRYOLOGIE (2 EME PARTIE). ET GAMETOGENESE Analyse moléculaire A) Analyse de l expression des gènes (cf. TDI) B) Analyse de la fonction d un gène 1- Inhiber la fonction d un gène de façon transitoire - en injectant un anticorps qui bloque le fonctionnement de la protéine Exemple : anticorps anti-fibronectine - en inhibant la traduction en injectant des oligonucléotides (ADN) antisens Exercice : Quel est l effet direct de l injection, au stade ovocyte, d un oligonucléotides antisens de l ARNm de l Ecadhérine? Quelle sera la conséquence observable au stade blastula? 7
en inactivant des mécanismes biologiques par expression de protéines modifiées qui engendrent une inhibition compétitive avec la protéine native = «dominants négatifs» Exemple : dominants négatifs de récepteurs membranaires dans lesquels un des sites actifs a été modifié. Légendez les schémas suivants : Exercice : Chez le xénope, on effectue au stade 2 cellules, l injection d ARNm codant pour un récepteur muté du FGF. Quel est le but de cette expérience et quel phénotype obtiendra-t-on? 8
2- Expression ectopique et «sur-expression» 3- Inactiver la fonction d un gène de façon permanente. 9
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Gamétogenèse - Ovogenèse La Méiose : formation des gamètes et brassage génétique La méiose a 2 conséquences essentielles : d une part elle aboutit à la formation des gamètes haploïdes, et d autre part, elle engendre un énorme brassage génétique. Exercice 1 : Légendez la cellule ci-dessous (pour laquelle 2n = 4), puis faites effectuer la méiose à cette cellule, en dessinant les étapes essentielles permettant de comprendre le processus de réduction chromatique et les brassages chromosomiques et génétiques (jusqu à la formation des gamètes). Exercice 2 : La figure ci-dessous est une représentation schématique de la région du cortex de l ovocyte II d amphibien. Légendez la figure. De quelle région de l ovocyte s agit-il? 12
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TD3 La fécondation, induction du mésoderme 14
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TD 4 Gastrulation et Induction neurale Exercice 1 : Le schéma ci-contre figure une jeune gastrula d amphibien. Cinq marques colorées (numérotées de 1 à 5) sont déposées à la surface de l embryon. A - Indiquez la position de chaque marque colorée par rapport aux territoires et aux axes de l embryon. B A la fin de la gastrulation que sont devenues ces marques colorées et quel(s) mouvement(s) cellulaire(s) mettent-elles en évidence? 16
Exercice 2 17
Exercice 3 18
Neurulation, induction neurale Exercice 1 La figure représente une jeune neurula en vue dorsale. Attribuez une légende à chaque numéro. Exercice 2 La neurulation achève la mise en place du plan d organisation de l embryon. A l aide de schémas légendés, décrivez les étapes fondamentales. Exercice 3 19
Exercice 4 20
Exercice 5 Décrivez l expérience ci-dessous. Interprétez les résultats. Proposer un modèle permettant d expliquer ces résultats. TD 5 Révisions TD5 : Révisions, Sujets de concours Concours 2003 Université de Nouvelle - Calédonie Question 1 Définissez les termes suivants : 1 Induction ; 2 Noggin ; 3 Centre de Nieuwkoop ; 4 Archentéron ; 5 Lignage Concours 2003 Question 1 (4 points) : Définissez les termes suivants : (1 point par terme) 1. Dishevelled ; 2. Zone pellucide ; 3. Compétence ; 4. Effet de communauté Exercice 1 Les schémas ci-dessous illustrent trois expériences réalisées au cours de la neurulation. 21
1) Quelle est l hypothèse testée par ces expériences (1 point) 2) Donnez les résultats de chacune des greffes (3 points) 3) En vous appuyant sur vos connaissances, interprétez les résultats et proposez un modèle qui explique les résultats de ces expériences. (5 points) Concours 2001 Question 1 Définissez les termes suivants : 1 - Coelome (0.5 point) 2 Transition blastuléenne (0.5 point). 3 Chorde (0.5 point). 4 Compaction (0.5 point). Exercice 2 : Quels sont les éléments qui matérialisent la polarité antéro-postérieure dans une cellule fécondable chez l amphibien? 22
Exercice 3 : Après avoir précisé la nature moléculaire de la β-caténine, décrivez une expérience (méthode, résultats, interprétation) permettant de proposer une fonction à cette molécule. Exercice 4 : Quelles sont les molécules impliquées dans la mise en place du mésoderme intermédiaire? Exercice 5 : exemple de QCM possibles sur la base du sujet de concours 2005 Chez le modèle amphibien, l événement représenté ci-contre a lieu une heure après l entrée du spermatozoïde. I ) Il correspond à : cochez la (les) bonne(s) réponse(s) a - la rotation de symétrisation b la mise en place du croissant gris c la rotation corticale d la disparition de la tache de maturation e la rupture de la vésicule germinative II ) Au plan moléculaire, cet événement contribue : cochez la (les) bonne(s) réponse(s) a à la redistribution de l ARNm VegT b - à la polymérisation des micotubules c - au transport par les kinésines de déterminants cytoplasmiques d - à la transcription des ARNm zygotiques e - à l adressage du complexe Dsh-GBP du coté ventral Exercice 6 : exemple de QCM possibles sur la base du sujet de concours 2005 Chez les amphibiens, la polarité dorsoventrale est acquise une heure après la fécondation, grâce à, au moins, une protéine impliquée dans les interactions entre les molécules d adhérence et le cytosquelette, ainsi que dans une voie de transduction. I) De quelle protéine s agit-il : (cochez la (les) bonne(s) réponse(s)) a- la fibronectine b l ARNm Vg1 c nodal d la beta-caténine e la cadhérine II) Quel est son mode d action? (cochez la (les) bonne(s) réponse(s)) a elle se fixe aux récepteurs des protéines Wnt et active la voie de signalisation Wnt b elle réprime un des intermédiaires de la voie Wnt c elle est excrétée et active une voie de signalisation d elle pénètre dans le noyau e elle active le gène siamois 23
Références bibliographiques : Gilbert, S.F. (2003). Biologie du développement. De Boeck Université, Paris, Bruxelles Franquinet, R. et Foucrier, J. (1998). Atlas d embryologie descriptive. Collection Sciences Sup, Dunod, Paris LeMoigne, A. et Foucrier, J.,(2001). Biologie du développement. Dunod, Paris Wolpert, L.,(2004). Biologie du développement, les grands principes. Dunod, Paris Sites à consulter : http://www.snv.jussieu.fr/bmedia http://www.mblab.gla.ac.uk/ http://www.med.unc.edu/embryo_images/ http://www.ucalgary.ca/uofc/eduweb/virtualembryo/ http://xmmr.igh.cmrs.fr/ http://frogs.biology.utah.edu/ 24