SYMPOSIUM INNOVATIONS VIROLOGIQUES Modérateurs : Vincent THIBAULT (Rennes) & Stéphane CHEVALIEZ (Paris) 14H30 15H00 : Les nouvelles techniques de séquençage du VHC Sylvie LARRAT (Grenoble)
Menu Le Next generation sequencing (NGS) qu est ce que c est? - Intérêt du NGS en virologie -Comment ça marche? -Quels outils? Exemples d applications VHC: -résistance -évolution -Rechute/ré-infection -génome complet
Réaction de Séquençage x 100 000 (000) Principe de base Sanger = 1 ère génération (ABI: 1986) NGS = 2 ème génération 454 Roche, Ion Torrent, Illumina NGS = 3 ème génération PacBio, Oxford Nanopore,
Intérêt en virologie Recherche des mutations de résistance présentes à de faibles pourcentages Chevaliez, Gastroenterology, 2012 Analyse de zones plus étendues du génome voire du génome complet Analyse de diversité/phylogénie intra et inter hôte, infections mixtes, sur-infections Découverte de nouveaux virus métagénomique/viromes
Intérêt en virologie Quinones-Matineu, J Clin Virol, 2014
Le NGS en pratique Enrichissement de l échantillon en séquence d intérêt Préparation de la librairie Amplification clonale Séquençage Analyse bioinformatique
enrichissement Enrichissement sans enrichissement Enrichissement non spécifique Enrichissement viral Enrichissement spécifique Anchored multiplex PCR SPIA/ cdna-aflp /Rolling circle/ Techniques physiques: UC, filtration, Dnases,. PCR capture Nombre de read nécessaire pour l analyse
Préparation de la librairie Amplicon taille read Amplification avec amorces comprenant MID et adaptateurs Grands fragments (taille> read) Shotgun Fragmentation chimique, physique ou enzymatique Petits fragments Taille reads Amplif non spé Ligation d adapteurs génériques
Amplification clonale PCR en émulsion PCR «en pont» sur plaque de verre
Incorporation des dntp
Profondeur vs longueur https://flxlexblog.wordpress.com/2015/06/17/developments-in-high-throughput-sequencing-june-2015-edition/
https://genohub.com/ngs-instrument-guide/
NGS 3ème génération: single molecule Plus d étape de PCR clonale Séquençage >10 kb PacBio Oxford nanopore Metzker, Nature Reviews Genetics 2010 Schaffer, MIT technology review, 2012
the Sequel System: The Scalable Platform for SMRT Sequencing
Apparition mutation résistance Dynamique des variants résistants sur 4 échecs PR+TPV Pas de lien entre mutations à baseline et SVR pour PR+TPV (R155K/T/Q?) Trimoulet et al., Antiviral Therapy, 2013
Prédiction à baseline? pas de lien entre mutations (seuil 1%) à baseline et SVR sur PR + IP (n=20) (n=20) Larrat, JCM, 2015
Analyse de la diversité: Prédiction à baseline? where n is the number of different species identified, fi is the observed frequency of the particular variant in the quasispecies, and N is the total number of clones analyzed N=40 Larrat, JCM, 2015
Prédiction à baseline? 30 patients G1b non F4 traités par DCV+ASV 83,3% SVR Lien entre présence de RAV et SVR (p<0,001) Kinugasa H, Antiviral Therapy, in press
Recherche résistances inconnues Ré-analyse Φ III Gilead (SOF/R ou SOF/PR) : 224 échecs/982 subjects 676 analyses NGS L159F (n=12) et V321A (n=5) émergent chez 2.2% - 4.4% des échecs. (seuil -: 1% seuil +: 10%) Polymorphisme en 316 RVS chez G1b (n=6) Donladson, Hepatology, 2015
Evolution Primo-infection: génome complet (FLX 2 ou 3 PCR ss-type spé) : Bottleneck 1= transmission 1 ou 2 souches établissent une infection Bottleneck 2 : 100 jours PI diversité virale et émergence d une nouvelle souche dérivant des souches initiales pour les 2 patients qui passent en infection chronique Bull, Plos Pathogens, 2011
Rechute ou Ré-infection? 99 HSH VIH PI VHC traités/pr 15 échecs (6 RR, 6NR, 3RP) En séquençage direct: 10/15 suspicion de ré-infection NGS: HVR1-454 FLX 15/15 émergence d une population pré-existante Abdelrahman, Hepatology, 2015
VHC génome complet: pourquoi? 1-Typage précis + description nouvelles souches 2-Détection des mutations de résistance en 1 seule analyse + mut compensatoires Jackowiak, Infect Genet Evol., 2014 ; Galli, Trends microbiol, 2014; Cuypers, Viruses, 2015
VHC Formes recombinantes Formes recombinantes 2/1: 12 / 487 2.5% des génotypes 2 dans études Gilead SPIA+ Illumina MiSeq 11seq complètes/12 8 relapses/11: RVS12=27%!!! Hedskog, Hepatology, 2015
VHC génome complet Amplif non spécifique (geno indep): SPIA + 454 FLX 1-6,4% Reproductibilité: 6/10 Bartoloni, Dig and Liv Dis, 2015
VHC génome complet: Détection d un virus recombinant HCV genomic RNA P9S1 5 NC 3 NC Retro-transcription Control PCRs Whole genome PCR BootScan - Query: P1 FileName: \\exploitation.chug.alp\fldrdr$\frchug1\slarrat\my Documents\Bureau\Pauline\basesimplot.pir 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 1b 1h 1a 1c 1e 1g 1l 2a 2c 2d 2r 2j 2e 2i 2k 2q 2m 2b 2l 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 500 1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 3 500 4 000 4 500 5 000 Position 5 500 6 000 6 500 7 000 7 500 8 000 8 500 9 000 9 500 10 000 Window: 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Reps: 100, Kimura (2-parameter), T/t: 2,0, Neighbor-Joining 802 unique genomic sequences covering the recombination breakpoint with at least 30 2k-upstream and 30 1b-downstream nucleotides Ramière et al, Eurosurveillance, 2014
VHC Génome complet Identification de nouvelles souches Trémeaux et al, submitted
VHC génome complet 180 Analyse 3D N Tarbouriech et W Burmeister Trémeaux et al, submitted
Audebert et al., Médicine/Science 2014
Merci pour votre attention
Back-up slides
Take kome messages NGS: Profondeur de séquençage = f(amplif spé/non spé/ sans amplif) Actuellement compromis biais/ coût Arrivée des technologies single molecule de 3 ème génération Résout les problème d haplotypage étude des quasiespèces Applications: -pas d intérêt de rechercher en NGS les pop minoritaires avant ttt -Intérêt ++: recherche de nouvelles mutations -Etudes d évolution ( cf. 3G) -Génome complet : -recombinants - typage nouvelles souches -étude des mutations + large
VHC génome complet Approche Sans amplif: 3 patients 1 run Illumina IIx Ninomiya JCM, 2012 96 M seq 76pb (87M hum)> 1.5M pat 1; 7M pat 7 et 0.7M pat 9 Approche 4 amplicons: 4 patients 1 run GS Junior Lauck, J Virol, 2012 Amorces G1a spécifiques 29 567 37 627 seq/ chaque génome 916 à 1125 X
Appli: virus discovery: amplif non spé cdna-aflp Rolling circle amplification Sequence independent single-primer amplification
Mutations pré-existantes à baseline N=570 559 WT à baseline (98%) 11 (2%) ont mutations 5 V36M 1 V170A Souches 100% mutées 1 R109K 4 R155K V36M et R155K même IC50 Bartels DJ, JID, 2008
Suivi après traitement Thomas (Netherlands), Plos One, 2012 4 ans plus tard après avoir reçu 14 jours de monothérapie TPV 454 GS FLEX 2 amplicons analyse AVA