RNA interference Charles Lecellier Institut de Genetique Moleculaire de Montpellier CNRS UMR 5535 - IFR 122 1919 Route de Mende 34293 Montpellier Cedex 5 Phone : 33 (0) 4 34 35 96 78 Fax : 33 (0) 4 34 35 96 34 E-mail : charles.lecellier@igmm.cnrs.fr http://www.igmm.cnrs.fr
Chalcone synthase Co-suppression (CS) in transgenic Petunias Opposite phenotype P CS T CS transgene No CHS mrna RNA silencing
dsrna as a key molecule for RNA silencing activation P X T 2-3 % of silenced lines 80 % silenced lines P X T 2-3 % silenced lines P X X T 95 % silenced lines
dsrna as a key molecule for RNA silencing activation injected GFP dsrna RNA interference (RNAi): C.elegans Fire et al., 1998 Sense or antisense single stranded RNA had no effect Sequence-specific Systemic General phenomenon in animals: planarians, drosophila, mouse.
Mediator molecule of RNA silencing? a nucleic acid Causing degradation of sense RNA GFP Silenced GFP Non silenced antisense RNA? No consistent detection of high molecular weight antisense RNA in various RNA silencing systems Low molecular weight antisense RNA? 15% PAGE sense RNA detected in same abundance Template = dsrna? 21-23nt antisense GFP RNA
21-23nt RNAs universal markers of RNA silencing H 2 O RNAi
Hypothesis: dsarn RNAse-III? Sequence-specific degradation of target RNA 25nt RNA Bernstein et al., 2001
21-25nt RNAs are the specificity determinants of RNA silencing in drosophila lysates Dicer P 2nt 5 3 3 P 5 P P sirna small interfering RNA synthetic 21nt RNA OH OH Target mrna 5 p 32 3 Drosophila embryo lysate +ATP +creatin kinase 11nt Endonuclease - AGO2 5 p 32 3 Elbashir et al., 2001
RNAi in drosophila lysates cyclin E dsrna mrna sirna Hammond et al., 2000 RNA-Induced Silencing Complex (containing AGO2)
Core reactions of RNA silencing dsrna Dicer sirna RISC targeted mrna degradation
Viral replication produce dsrnas TMV viruses produce proteins as a counter-defense
Suppression of RNA silencing is a general property of plant viruses CMV TBSV RYMV ACMV Etc.. Protein 2b Protein P19 Protein P1 Protein AC2 Proteins diverse in: -structure -sequence RNA and DNA viruses
P PRSV PRSV T PRSV dsrna PRSV sirnas Papaya ringspot virus (PRSV) Loaded RISC PRSV viral RNA HcPro preloaded RISC
21-25nt RNAs are the specificity determinants of RNA silencing (II) OH OH lamin A/C sirna Hela Cells (lipofectamine 2000 transfection) Elbashir et al., 2001b
choix de la séquence sirna Consultation de la littérature Algorithmes (e.g. Dharmacon, Qiagen..) 1- recherche dans la région codante de l ARNm cible de 21 nucléotides commençant par motifs AA ou NA (sirna avec débordement dinucléotides UU en 3 sont plus puissants) 2- sélection d une zone ayant 30-50% GC (fort taux GC en 3 antisens et faible taux en 5 ) 3- éviter la région 75-100 bp après AUG contenant des sites polymorphiques et/ou occupés par protéines régulatrices 4- le motif dinucléotide leader AA/NA ne fait pas partie du duplex final 5- choisir 2-4 séquences cibles/gène (1/2 sirna diminue ARNm cible de 50% et ¼ de 75%) 6- éviter les séquences cibles qui présentent 16-17 bases contigües similaires (BLAST pour chercher autres gènes similaires) 7- rechercher une complémentarité possible entre région seed du sirna et autres séquences 3 UTR (BLAST)
Méthode conventionnelle AUG mrna 5 NA AAAA -3 UTR 75-100 bases UTR 21 base target sequence GCCANACGUUGCAAUAGCUUAGUACTTGAG Synthesis Annealing sirna duplex CGUUGCAAUAGCUUAGUACTT - 3 3 - TTGCAACGUUAUCGAAUCAUG Sens Antisens
Méthodes de synthèse de sirna Synthèse chimique Transcription in vitro Digestion ARNdb long in vitro par Dicer ou RNase III Expression par un plasmide ou vecteur viral (psilencer, psuper ) Utilisation d un backbone mirna
Mise en œuvre in vitro Transfection ou infection des cellules avec vecteur d expression codant un shrna (plasmide, virus) Lipofection des cellules avec formulations synthétiques de sirnas cinétiques, viabilité, dose-réponses
Contrôles pour expériences d ARNi Contrôle positif Optimisation et suivi de l efficacité de transduction 1- ciblage d un gène abondant et d expression constitutive (GAPDH, Lamin A/C, Cyclophilin B) 2- pas d effet sur la viabilité cellulaire 3- pas d effet sur le phénotype cellulaire 4- test de mesure de l inhibition aisé Contrôle négatif Différentier inhibition séquence-spécifique des effets non-spécifiques 1- ne doit cibler aucun gène cellulaire connu (siluc, sigfp, Non-targeting sirna) 2- pas d effet sur la viabilité cellulaire 3- pas d effet sur le phénotype cellulaire 4- Contrôler les effets off-target (RNAi non spécifique) Contrôle de transfection Déterminer les conditions optimales d administration 1- signal fluorescent dont la détection ne fait aucun doute sur la pénétration cellulaire (siglo) 2- intensité du signal dépendante l efficacité d entrée des sirnas et de l ARNi Contrôle non traité Définir le taux basal de viabilité et d expression du gène cible 1- culture cellulaire en absence de sirna pmaxgfp pmaxgfp + sigfp
Mise en œuvre in vivo Injection systémique de sirnas nus possible mais rarement utilisée: nucléases et élimination rénale Injections locales peu efficaces: problèmes de pénétration dans les tissus, organes (sauf cas particulier, e.g. VEGFR et MAD) Nécessité d associer sirnas aux techniques de transfert de gènes: - vecteurs synthétiques (liposomes, chitosan, nanoparticules ) - modifications chimiques (greffage cholestérol, PEG ) - vecteurs d expression plasmidiques ou viraux (LV, AAV ) - méthodes physiques (hydrodynamique, électroporation )
Modifications chimiques et vecteurs synthétiques Bénéfices des modifications chimiques et formulations de sirnas 1- stabilité thermique supérieure 2- résistance aux nucléases 3- biodistribution améliorée 4- entrée dans les cellules cibles 5- ciblage tissu-spécifique 6- diminution des effets off-target Corey (2007) JCI 117(12): 3615-3622
Constructions virales Clonage du shrna sirna problèmes identiques à ceux de la thérapie génique: shrna - efficacité de transduction du tissu cible - spécificité du ciblage - toxicité - immunogénicité H1 Production du plasmide ou virus
Multi-gene RNAi using mirna-based shrnas against HIV sirna/shrna efficiently inhibit HIV-1 replication Rapid emergence of RNAi-resistant escape viruses due to deletions/mutations abolish the antiviral effect + Viral suppressors Design of multi-sirna hairpin vectors targeting for durable inhibition of escape-prone HIV-1 viruses Brake et al. (2009) Gene Therapy 16, 148 153 Brake et al. (2006) Mol Therapy 14, 883 892 Prom1 5 mir shrna1 3 mir Prom2 5 mir shrna2 3 mir Prom3 5 mir shrna3 3 mir Liu et al. (2007) Nucleic Acids Res 35, p5683-5693 positioning of the sirna at the base of the hairpin stem yields optimal RNAi activity without triggering the innate antiviral IFN response
endogenous RNAi effectors in mammals Röther et al., Biochimie 2011
gdna NUCLEUS CYTOPLASM Pre-miRNA Exportin 5 Pri-miRNA Drosha Dicer translational repression target mrna P asymetric RISC assembly RISC P Processing (P)-bodies
Nature Reviews Genetics 12, 99-110 (February 2011)
Nature Reviews Genetics 12, 99-110 (February 2011)
Possible mechanisms of mirna-mediated repression Chekulaeva M and Filipowicz W., Current Opin Cell Biol 2009
fundamental roles of mirnas in mammals Knocking out Dicer in mouse mir-181 induces B cell differentiation in vitro and in vivo - Chen et al., 2004 Bernstein et al.,2003 developmental arrest in mouse embryo Each cell type produces a specific mirna repertoire
SOME EXAMPLES Feb 7 2013 mirnas & Cancers NCBI Entrez Pubmed pubmed - mirna pubmed - mirna and cancer count count percentage 2013 937 361 38,52721451 2012 5567 2362 42,42859709 2011 4306 1894 43,98513702 2010 3328 1450 43,56971154 2009 2217 885 39,9188092 2008 1525 589 38,62295082 2007 985 304 30,86294416 2006 651 165 25,34562212 2005 392 71 18,1122449 2004 214 28 13,08411215 2003 106 11 10,37735849 2002 42 8 19,04761905 2001 5 0 0 Lets take some examples from the lab
I. mirna profiling as diagnostic and prognostic markers (mirnas present in all biological fluids) II.Novel anti-cancerous therapies aimed at modulating (restoring) mirna expression Pharmacological modulations of mirna expression (transcriptional regulation) mirna inhibition : antisense oligonucleotides (LNA, 2 Ome, ) intravenous injection is efficient mirna enforced expression : new gene therapy vectors containing mirna precursors