Microparticules Quel méthode pour doser les microparticules? Master 1 pathologie humaine international 2012 Romaric Lacroix UMR-S608 INSERM/Université de la Méditerranée «Physiopathologie de l endothélium»
Définition des microparticules Vésicules résultant du bourgeonnement de la membrane cellulaire en réponse à une activation ou une apoptose cellulaire Taille hétérogène (diamètre: 0.1 to 1 µm ). Eléments retrouvés dans le culot d une centrifugation rapide d un plasma déplété en cellules. Structures exprimant généralement de la phosphatidylserine et des antigènes caractéristiques des cellules dont elles dérivent. Annexin V- FITC
Microparticules : Relation structure/fonction Coagulation Protéolyse Remodelage tissulaire Angiogenèse Croissance tumorale TM EPCR PAI-1 TF MMP Transfer d information génétique RNA MMP Intracellular protein FcR MHC Régulation immune PECAM-1 VCAM-1 ICAM-1 E-selectin CD146 Inflammation D après Leroyer et al. Thromb Haemost 2010
Définition d un biomarqueur NIH Biomarkers Definitions Working Group Un biomarqueur se définit comme une caractéristique biologique qui est objectivement mesurée et évaluée comme un indicateur des processus biologiques normaux, pathogènes, ou pharmacologiques en réponse à une intervention thérapeutique.
Biomarqueur : indicateur de processus biologiques Pathologies cardiovasculaires Syndromes coronaires aigus Athérosclérose Thromboses veineuses et EP Accidents vasculaires cérébraux Pathologies vasculaires gravidiques Piccin et al. Blood Rev 2007, Morel O. et al. Semin. Thromb. Haemost. Facteurs de risque cardiovasculaire Diabètes Hypertension Syndrome métabolique Insuffisance rénale chronique Dyslipidémies Risques thrombotiques Thrombopénie induite par l héparine Syndromes myeloprolifératifs Drépanocytose Hémoglobinurie paroxystique nocturne Cancers Pathologies autoimmunes Syndrome des antiphospholipides Lupus PTT PTI Pathologies Inflammatoires/infectieuses Sepsis VIH Collagénoses
Biomarqueur : indicateur de processus biologiques Marqueurs de l activation et/ou de l apoptose cellulaire Témoin d un processus non directement accessible (dysfonction vasculaire, développement tumoral, ) Corrélation avec l activité de la maladie Signification pronostique : Identification des patients à risque vasculaire/thrombotique Suivi thérapeutique Indicateur d altération des produits de santé labiles
De nombreuses méthodologies! Pas de méthodologies consensuelles.
Microparticules en clinique humaine Modéles in vitro Plasma humain normal International Society on Thrombosis and Haemostasis Scientific and Standardization Committee (SSC) in vascular biology F Dignat -George http://www.isth.com/ Phases pré-analytique et analytique
Pre-analytics as a major source of variability in MP enumeration -Tubes -Anticoagulant - Needles - Delay - Agitation Need of standardization Analytical steps - Freeze/Thaw - Temperature/Length - Centrifugation steps Mean (%/REF) 400 300 200 100 0 Variables that impact the most : - Agitation (transportation) - Centrifugation conditions - Delayed analysis Lacroix R. et al. J Thromb Haemost 2011
AGITATION Agitation A. Agitation : - = No, + = Gentle agitation (single up and down reversal of the tube) +++ = Strong agitation (continuous rotation on a wheel) Moy(%/REF) AnnV 400 200 0 FCM ** - + +++ Moy(%/REF) Velocity 800 400 0 Thrombin Generation - + +++ B. Transportation in clinical situation : Tubes remain motionless in the lab/ blind transportation system in a double plastic bag *** Moy (%/REF) CT 120 80 40 N=10 Coagulation time * *** - + +++ TRANSPORT Moy(%/REF) AnnV 350 250 150 50 ** - mobile fixed * Moy(%/REF)Velocity 250 150 50 - mobile fixed - Agitation was identified as a major pre-analytical point - MP generation may be prevented by appropriate transport system ** Moy(%/REF) CT 120 80 40 ** * - mobile fixed
TRANSPORT BOX Which type of box is best adapted to avoid the artefactual formation of MP in vitro? A: motionless tube (control) B: Tube in platic bag C: horizontal tube in box D: horizontal tube in CML box E: vertical tube in polystyrene box, F: vertical tube in plastic box N=10 Fresh blood C E F Vélocité 450 D 400 350 Moy (%/REF) Velocity 300 250 200 150 100 100.00 222.74 234.54 284.92 69.32 97.33 50 0 A B C D E F Temps de coag 110 100 100.0 97.7 96.5 Vertical transportation system is the most appropriate for MP analysis. Moy CT (sec) 90 80 70 60 50 78.5 80.9 73.9 A B C D E F
Proposition d un protocole pré-analytique pour l analyse des MP Tubes : Tubes citratés en plastique Prélèvement sanguin : Aiguilles <21G, élimination des premiers ml Délai avant la première centrifugation : 1-2 heures Transport : Dans des boites appropriées qui maintiennent les tubes immobiles et verticaux Protocole de centrifugation : 1iere centrifugation 15 min 2500g température ambiante 2ième centrifugation 15 min 2500g température ambiante Conservation : Congélation à -80 C Un seul cycle de congélation/décongélation Décongélation rapide au bain marie à 37 C
Méthodes de mesure des microparticules [Thrombin] (nm) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Time To Peak µs 0.9µm µs 0.5µm µs 0.3µm 0 0 10 20 30 40 50 60 Lag Time Peak Height Time (min) Area Under the Curve (ETP) Cytométrie de Flux. Antigènes spécifiques/anticorps. PS/annexine V. Taille (inférieure à 1µm) Numération / Origine cellulaire Tests Fonctionnels. PS /activité Prothrombinase. TF/ génération de thrombine Potentiel procoagulant Test de «Capture». PS ou Ag. Test fonctionnel procoagulant Potentiel procoagulant / Origine cellulaire
Navios, Beckman Coulter Cytométrie de flux FACS Canto II, Becton Dickinson
Cytométrie de flux 1) Le système fluidique Création d un flux laminaire dans l appareil par pressurisation d un liquide de gaine (solution saline isotonique, sheath fluid) Le liquide de gaine forme une colonne liquide qui va permettre la focalisation hydrodynamique de l échantillon: Objectif: faire passer les evts les uns après les autres dans la zone d analyse
2) Le système optique Cytométrie de flux L illumination par une source de lumière de l évènement passant dans la Flow Cell: Récupération des informations (paramètres) sur les évènements: Par la lumière diffractée a. Diffraction axiale: permet de mettre en évidence la taille de l evt Forward Scatter (FS ou FSC) b. b. Diffraction de la lumière à 90 : représente la composition interne de la cellule, sa granulosité, sa réfringence Side Scatter (SS ou SSC)
2) Le système optique Cytométrie de flux Par la lumière fluorescente émise Excitation des fluorochromes par la lumière émise par le LASER Emission de photons dans une longueur d onde supérieure pour revenir à l état non excité Récupération des photons émis FL1: 525nm FL2: 575nm FL3: 620nm FL4: 675nm FL5: 755nm
Cytométrie de flux Exemple d application de la cytométrie en flux : Le suivi des patients VIH+ Quadruple marquage : CD45 FITC, CD4 PE, CD8 ECD, CD3 PC5 CD 45 Marqueur pan leucocytaire. Facilite le gating de la population lymphocytaire avec le SS. CD3 Population T, permet d exclure les CD3-CD4+ = Monocytes contaminants CD4, CD8 Sous-populations lymphocytaires
Détermination des microparticules par cytométrie de flux Difficulté à mesurer les évènements de petite taille Réglage standard Les microparticules ont une taille inférieure à 1µm Limites : seuil de détection! 1 µm 0.1 µm MPs taille (FS) discriminant
Limites de la cytométrie de flux Résolution: Manque de résolution pour des évènements de taille inférieure à 0.5µm Bruit de fond : Perturbe la détection et la numération des MP Objectifs 1) Standardisation de la fenêtre d analyse des MP 2) Optimisation de la discrimination des MP de petites tailles
Amélioration de la détection des MP par CMF FC500 0.5µm threshold Gallios 0.5µm threshold Gallios 0.3µm threshold Gallios FS min threshold SS Log FS Log 1988 mp/µl 2000 mp/µl 2000 mp/µl 2000 mp/µl CD41 PE 3000 mp/µl 11000 mp/µl Annexin V FITC Robert S, Lacroix R et al. ATVB 2012
Accès à une nouvelle information clinique FC500 (0.5-1µm beads-eq) CD11bCD66b positive MP Gallios (0.3-1µm beads-eq) P=0.29 P 0.001 From RISK study, G. Sarlon et al. Multivariate analysis : the presence of neurologic symptoms and the level of CD11b66b MP two only variables that remained in the model as independent predictors of unstable plaque. CD11b66b MP: OR 2.4, 95% CI 1.1-4.9, p<0.05 Including the small MP subset in the analysis brings a new clinically-related information
Méthodes de mesure des microparticules [Thrombin] (nm) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Time To Peak µs 0.9µm µs 0.5µm µs 0.3µm 0 0 10 20 30 40 50 60 Lag Time Peak Height Time (min) Area Under the Curve (ETP) Cytométrie de Flux. Antigènes spécifiques/anticorps. PS/annexine V. Taille (inférieure à 1µm) Numération / Origine cellulaire Tests Fonctionnels. PS /activité Prothrombinase. TF/ génération de thrombine Potentiel procoagulant Test de «Capture». PS ou Ag. Test fonctionnel procoagulant Potentiel procoagulant / Origine cellulaire
STA-Procoag-PPL (Diagnostica Stago) Test Sample P-PPL/MPs R1 : Substrate plasma = P-PPL Depleted Plasma Incubation step R2 : Starting Reagent = Factor Xa (+Ca 2+ ) coagulation The shorter Clotting Time, the higher PPL activity Automated Measurement of Clotting Time
Méthodes de mesure des microparticules [Thrombin] (nm) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Time To Peak µs 0.9µm µs 0.5µm µs 0.3µm 0 0 10 20 30 40 50 60 Lag Time Peak Height Time (min) Area Under the Curve (ETP) Cytométrie de Flux. Antigènes spécifiques/anticorps. PS/annexine V. Taille (inférieure à 1µm) Numération / Origine cellulaire Tests Fonctionnels. PS /activité Prothrombinase. TF/ génération de thrombine Potentiel procoagulant Test de «Capture». PS ou Ag. Test fonctionnel procoagulant Potentiel procoagulant / Origine cellulaire
Tests hybrides de capture IIa Xa Ca 2+ Ca Va Ca 2+ 2+ Phospholipids Phosphatidylserine detection Prothrombinase activity (nm PS eq.) II Xa AV AV AV VIIa TF detection X TF Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ Phospholipids Bi Bi Bi SA SA SA Annexin V-biotin Bi Bi Bi SA SA SA Antibody-biotin D après JM Freyssinet
Microscopie de force atomique Yuana Y. et al J. Thromb. haemost. 2010
Nanotracking analysis Nanosight web site
Définition d un biomarqueur NIH Biomarkers Definitions Working Group Un biomarqueur se définit comme une caractéristique biologique qui est objectivement mesurée et évaluée comme un indicateur des processus biologiques normaux, pathogènes, ou pharmacologiques en réponse à une intervention thérapeutique.