Institut Supérieur School of Computing, d Informatique de Dublin City University, Modélisation et de Glasnevin, Dublin 9 leurs Applications Complexe des Cézeaux BP 125 63173 Aubière Cedex Rapport de projet de 2 ème année Filière 4 Epigenetic modelling Présenté par : BELLARBI Merième et GOASMAT François Responsable(s) ISIMA : Vincent BARRA Responsable(s) entreprise : Dimitri PERRIN 0
Remerciements A l issue de ce projet, nous tenons à remercier toutes les personnes qui ont permis à notre projet d aboutir. Nous remercions notre chef de projet, Dimitri Perrin qui nous a encadrés dès le début du projet et nous a fourni tous les conseils nécessaires pour atteindre les objectifs fixés. Nous remercions chaleureusement Rokia BELLARBI pour sa disponibilité et sa gentillesse. Tout au long des six derniers mois, elle s est assurée par mail ou par téléphone de notre compréhension des aspects biologiques de notre projet et nous a fourni la documentation nécessaire à son avancement. Nous remercions enfin Christophe Duhamel, qui a répondu à toutes nos sollicitations techniques. 1
Résumé Notre projet de deuxième année a été proposé par D.C.U., et nous avons été chargés de modéliser les mécanismes épigénétiques. Tout d abord une analyse approfondie du problème a été nécessaire. Cela nous a permis de comprendre précisément les besoins de l équipe de biologistes du D.C.U. qui les ont conduits à nous proposer ce projet. Cette première étape a conduit à l inventaire des différentes structures de la chromatine qui interviennent dans les mécanismes épigénétiques. Cette phase nous a permis de concevoir les différentes classes relatives à ces structures en C++. Ces classes contiennent des attributs et des méthodes qui mettent en œuvre les mécanismes épigénétiques. Ensuite nous avons élaboré d autres méthodes pour relier les changements épigénétiques à l expression du gène. L objectif de cette étude est d utiliser ces changements pour comprendre l évolution de certaines maladies telles que le cancer, l obésité ou le VIH. 2
Abstract Our second year project was proposed by DCU, and we have been asked to model epigenetic mechanisms. First, an analysis of the problem was necessary. This allowed us to understand clearly the need of their biologists who proposed this project. This first step led us to the inventory of the different structures of the chromatin which are involved in epigenetic mechanisms. Thanks to this step, we designed different classes of these structures in C + +. These classes contain attributes and methods which model the epigenetic mechanisms. Then we developed other methods to link epigenetic changes to gene transcription. The main objective of this study is to use these changes to understand the evolution of some diseases such as cancer, obesity or HIV. 3
Table des matières Rappel du sujet d étude 1 Le contexte 3 Analyse du problème 4 Conception de la solution 5 Classe Histones 5 Classe Nucleosome 8 Classe ListeNucleosomes.11 Classe Bloc.13 Classe ListeBloc..16 Les fonctions.17 Prolongement..18 4
Table des Illustrations Figure 1 : attributs de la classe Histones.5 Figure 2 : méthodes de la classe Histones..7 Figure 3 : état épigénétique des histones 8 Figure 4 : Représentation d un nucléosome.9 Figure 5 : Définition de la classe Nucleosome.9 Figure 6 : attributs de la classe ListeNucleosomes..11 Figure 7 : représentation d une liste de nucléosomes..11 Figure 8 : déclaration des méthodes de la classe ListeNucleosomes..12 Figure 9 : déclaration de la classe Bloc..14 Figure 10 : déclaration de la classe ListeBloc..16 Figure 11 : les fonctions..17 5
1) Rappel du sujet d étude Notre projet entre dans le cadre d une étude des mécanismes épigénétiques menée par le centre de programmation scientifique et de modélisation des systèmes complexes à Dublin. Les mécanismes épigénétiques impliquent des altérations héritables de la structure de la chromatine qui à son tour régule l expression des gènes, mais sans changement au niveau de la séquence de l ADN. Ces altérations de l expression des gènes se produisent durant le développement et la prolifération cellulaire et persistent pendant la division cellulaire. Alors que l information à l intérieur du matériel génétique n est pas changée, les instructions pour son assemblage et son interprétation pourraient l être. Il y a beaucoup de mécanismes importants de l hérédité épigénétique, mais peut être l exemple le mieux compris est celui de la méthylation de l ADN. Le processus de méthylation arrête l expression des gènes par une inhibition au niveau de la région méthylée en ajoutant un groupement méthyl au résidu d un nucléotide donné, ce qui produit un changement physique qui sera hérité par les cellules filles. Il existe des indicateurs permettant de calculer les taux de méthylation spécifiques à des sites sur une section donnée d un chromosome donné. Très récemment, un modèle a été développé pour le calcul de tels taux, par la donnée des méthylations sur les doubles brins. De tels mécanismes sont toujours présents dans la vie cellulaire normale, et sont impliqués, par exemple, dans la différentiation cellulaire. Des altérations sont également observées pour le cancer, et des liens ont été établis dans plusieurs cas, par exemple la tumeur de Wilms et le cancer du colon. 1
Les mécanismes qui mènent vers des programmes épigénétiques normaux ou anormaux sont largement inconnus et différents états de méthylation existent dans les populations cellulaires tumorales, donc l anormalité est mal définie. Le fait d établir une base pour la quantification de tels «patterns» offrirait un appui considérable à l utilisation optimale de la méthylation dans le diagnostic ou le traitement du cancer. Une méthylation aberrante a été également liée à l autisme et l obésité, et peut être impliquée dans le VIH latent d après de récentes recherches. En plus de la méthylation, d autres facteurs épigénétiques peuvent être importants dans la détermination du phénotype cellulaire. Cela peut impliquer plus qu une paire de gènes interrupteurs «on off», ce qui suggère que le fait de se concentrer sur la localisation des gènes laisse de côté des informations potentiellement utiles. L objet ultime de notre étude est de développer plusieurs couches de modèles pour lesquelles des données peuvent être obtenues, par exemple, pour permettre l exploration de mécanismes de l initiation et de la progression du cancer par des phénomènes épigénétiques. Une partie cruciale de cette recherche est la constitution de modèles microscopiques au niveau de la cellule et des composants cellulaires, ce qui représente l objectif premier de notre projet. Dans un premier temps, nous verrons comment nous avons mis en œuvre des structures de la chromatine (nucléosomes, histones, brins d ADN, etc.) en tant que classes C++. Dans un deuxième temps, nous avons inclus dans notre modèle le positionnement dynamique des nucléosomes le long des brins d ADN. Ensuite, nous avons mis en œuvre des changements épigénétiques à l échelle microscopique et enfin nous avons élaboré des fonctions permettant de définir l expression d un gène en fonction de son état épigénétique. 2
2) Le contexte Cette partie a pour but d expliquer l environnement dans lequel le sujet à été proposé. Ce dernier nous a été expliqué par Dimitri Perrin principalement en début d étude. Le centre de programmation scientifique et de modélisation des systèmes complexes de Dublin avait besoin d'un programme capable de modéliser les chaînes d'adn ainsi que les nucléosomes autour desquels elle est enroulée. Le programme devait bien sûr faire entrer ces deux acteurs en interaction, et ce pour savoir si un brin d'adn supportant un nombre donné de nucléosomes était transcriptible ou non. Ils avaient en fait besoin d un programme permettant une première modélisation des processus épigénétiques, et ce afin d étayer les théories actuellement en cour de développement. Ce projet s inscrit donc dans une inertie plus globale qui cherche à progresser sur la découverte des processus épigénétiques. Ces recherches ont pour but à long terme de reconnaitre une cellule cancéreuse, dans lesquelles, certains gènes ne peuvent être transcrits. En effet le comportement chaotique de ces cellules nécessite le fait que les gènes qui ralentissent ces comportements soient muselés. 3
3) Analyse du problème Le problème nécessite la modélisation des gènes et des nucléosomes ainsi que leur état épigénétique (méthylation, acétylation, Ubiquitination, phosphorylation ). Les brins d ADN sont caractérisés par leurs séquences de nucléotides, et donc l information dont ils sont porteurs. Cependant, ce n est pas la seule information qui est portés par le génome. En effet, ces brins sont également soumis à des altérations (méthylation). De plus, il faut préciser le fait que tous les brins d ADN ne doivent pas être transcrits. Cette chaîne est enroulée autour de plusieurs nucléosomes. Ces nucléosomes subissent également des altérations. Chaque nucléosome est positionné sur le brin, il peut être repéré par le premier nucléotide qu il enroule et par une longueur en nombre de nucléotides enroulés. Cette dernière dépend de l état du nucléosome. Les nucléosomes peuvent se déplacer le long des blocs d ADN, mais évidement, un même nucléotide ne peut être enroulé autour de deux nucléosomes différents. Le fait qu un brin d ADN puisse être transcrit dépend du nombre et de l état des nucléosomes qu il porte. Ce programme devait pouvoir prendre en compte le fait que les données ne sont pas encore clairement définies. Certaines constantes devaient donc pouvoir être modifiées sans pour autant devoir changer une ligne du programme. 4
4) Conception de la solution Dans cette partie, nous décrirons les différentes étapes de la réalisation de la solution. 4.1) Classe Histones Tout d abord, nous avons codé la classe Histones comme on peut le voir dans la figure1. Figure 1 : attributs de la classe Histones Les Histones sont des protéines autour desquels s enroule l ADN pour former la structure de base de la chromatine. Il en existe différents types ayant des caractéristiques différentes : H1, H2A, H2B, H3 et H4. L histone H1 régule le degré de condensation des nucléosomes et permet ainsi de modérer l expression des gènes. 5
La classe Histones possède différents attributs comme nous pouvons le voir figure 1. Comme nous l avons indiqué précédemment, les histones sont des protéines, ce sont donc des successions d acides aminées. Pour cela nous avons mis un attribut Taille qui nous renseigne sur le nombre d acides aminés qui composent l histone courant. Cet attribut dépend bien évidemment du type de l histone. Nous avons ensuite ajouté les attributs Met, Ac, Ub, et P pour connaître l état épigénétique des histones. Ces attributs désignent respectivement le degré de méthylation (acétylation, ubiquitination, et phosphorylation) de l histone, c est à dire le nombre de groupements méthyle (respectivement acétyle, ubiquitine et phosphate) que cette histone porte. L attribut TabMet (respectivement TabAc, TabUb et TabP) contient la position des groupements méthyle (respectivement acétyle, ubiquitine et phosphate) de l histone en terme d acide aminé. Par exemple si TabMet vaut [2, 7], les groupements méthyle seront portés par le second et septième acide aminé de l histone. 6
Figure 2 : méthodes de la classe Histones Comme nous pouvons le voir dans la figure 2, la classe Histone possède différentes méthodes. Premièrement nous avons développé un constructeur par défaut, un constructeur par copie et enfin un destructeur. Ensuite, nous avons codé les ««setteurs» et les «getteurs» relatifs à chacun des attributs de la classe. Finalement la fonction possiblemet prend en entrée un nombre de groupements méthyle et un tableau contenant les positions où ils doivent être insérés. La fonction retourne vrai s il est possible d insérer tous les groupements méthyle aux emplacements indiqués. 7
Il en est de même pour les méthodes possibleac, possibleub, et possiblep. Ces fonctions doivent vérifier que certaines contraintes sont respectées, mais on ne s étendra pas dessus dans notre étude. Figure 3 : état épigénétique des histones L acide aminé portant le numéro 9 de l histone H3 peut être soit méthylé soit acetylé. L ensemble composé des histones et de l ADN forme un collier de perles. Une unité de ce collier de perles est appelée nucléosomes. Le nucléosome est donc la plus petite unité d enroulement de l ADN. Il est composé de 8 histones autour desquels d enroule l ADN. Il s agit de l octamère formé par 4 paires des histones H2A, H2B, H3 et H4 (cf figure4). Cela nous a amené à créer la classe Nucleosome comme on peut le voir dans la figure 5. 4.2) Classe Nucleosome 8
Figure 4 : représentation d un nucléosome 9
Figure 5 : Définition de la classe Nucleosome La classe Nucleosme possède les attributs suivants : Neuf histones : 8 histones qui composent l octamère et l histone H1 qui permet de réguler le degré de condensation du nucléosome. Un pointeur vers le nucléosome suivant pour pouvoir gérer une liste chaînée de nucléosomes qui forment le collier de perles. Enfin, l attribut Position nous indique la position (en nombre de paires de bases) du premier nucléotide enroulé autour du nucléosome. Comme nous pouvons le voir dans la figure5, la classe Histone possède différentes méthodes. Premièrement nous avons développé un constructeur par défaut, un constructeur par copie et enfin un destructeur. Ensuite, nous avons codé les ««setteurs» et les «getteurs» relatif à chacun des attributs de la classe. Enfin la méthode longueur retourne le nombre de nucléotides enroulé autour du nucléosome. Cette dernière méthode permet de nous renseigner sur le degré de compaction du Collier de perles, et par conséquent de savoir si le gène qui peut être porté par l ADN enroulée autour peut être transcrit. Tout cela nous amène à l étape suivante qui consiste à créer la classe ListeNuclesomes qui représente le collier de perles dont nous avons parlé précedemment, et qu on peut voir sur la figure7. La représentation en collier de perle justifiera le choix de la structure de liste chaînée dans l élaboration de cette classe, et le choix des attributs FirstNucl et LastNucl (cf figure6). 10
Ces attributs sont des pointeurs qui pointent respectivement sur le premier et le dernier nucléosome de la liste de nucléosomes. 4.3) Classe ListeNucleosomes Figure 6 : attributs de la classe ListeNucleosomes Figure7 : représentation d une liste de nucléosomes 11
Figure 8 : déclaration des méthodes de la classe ListeNucl Ensuite, nous avons élaboré les méthodes relatives à cette classe. Tout d abord les méthodes classiques de la forme normale de Coplien : constructeur par défaut, constructeur par copie, la surcharge de l opérateur d affectation et le destructeur. Nous avons aussi codé des «setteur» et des «getteurs» se rapportant aux attributs de la classe ListeNucleosomes. Les méthodes d insertion et de suppression viennent ensuite pour permettre de gérer la liste chaînée. Ainsi, les utilisateurs pourront insérer ou supprimer des nucléosomes de la liste, au début, à la fin, ou au milieu de celle ci. Les fonctions de consultation des éléments de la liste sont aussi nécessaires. Elles nous permettront de connaître la longueur de la liste, de l afficher etc. 12
La méthode remodelage permet de déplacer un nucléosome d un nombre entier de nucléotides et de réguler ainsi le degré de compaction des nucléosomes. La méthode getprec permet d obtenir un pointeur sur le nucléosome qui précède directement le nucléotide dont à la position passée en argument. La fonction insertion permet de vérifier si l insertion d un nucléosome est possible, c est àdire qu il n enroule pas un nucléotide déjà enroulé autour d un autre nucléosome, puis de l insérer. 4.4) Classe Bloc 13
Figure 9 : déclaration de la classe Bloc Un Bloc d ADN est un fragment de gène. Il est composé d une liste de nucléosomes. Pour le modéliser nous avons utilisé les attributs suivants : L attribut nnucleotides nous donne le nombre de nucléotides qui composent le Bloc, l attribut Seq, quand à lui, nous donne accès à la séquence de nucléotides elle même. La chaîne de caractères Type nous renseigne sur le type du Bloc. L attribut Methyle nous donne le degré de méthylation global de la chaîne. 14
Le booléen atranscrire nous informe sur l utilité de transcrire ce Bloc car tous les gènes ne sont pas nécessaires à la cellule. Les nucléosomes empêchent alors à l ARN polymérase d accéder aux régions promotrices de ces gènes pour empêcher leur transcription. C est là qu intervient la fonction remodelage vue dans la classe précédente pour modéliser l action d enzymes appelés facteurs de remodelage qui peuvent déplacer les nucléosomes permettant ainsi l accès au fragment ADN qui représente le gène. Le pointeur BlocSuiv permet de chaîner la liste et enfin, le pointeur ListNucl permet d accéder aux nucléosomes portés par le Bloc. Nous avons ensuite codé le constructeur et destructeur par défaut, ainsi que les «setteurs» et les «getteurs». Enfin la fonction istranscriptible nous permet de savoir si on peut transcrire le Bloc en fonction de l état épigenetique des nucléosomes qu il porte. 15
4.5) Classe ListeBloc Figure 10 : déclaration de la classe ListeBloc Une liste de Blocs représente la chaîne d ADN proprement dite. L attribut nblocs contient le nombre de Bloc qui composent la liste. Les attributs FirstBloc et LastBloc permettent d accéder respectivement au premier et dernier Bloc de la liste. Les méthodes codées sont, tout d abord, les méthodes de la forme normale de coplien. 16
Viennent ensuite les «setteurs» et les «getteurs». Puis nous avons crées les méthodes de gestion de liste soit les méthodes d insertion et de suppression. Viennent ensuite les méthodes de consultation des éléments de la liste et d affichage. 4.5) les fonctions Figure 11 : les fonctions La fonction echange permet d échanger la valeur des deux paramètres. La fonction tri_insertion permet de réaliser un tri par insertion, elle utilise la fonction echange. La fonction lecturedata lit les fichier de configuration et remplis le tableau entré en paramètre. 17
5) Prolongement Dans cette partie, nous allons voir différents points qui pourront être améliorées par la suite. Tout d abord la fonction qui retourne le nombre de nucléotides enroulées autour d un nucléosome ne dépend pas de l état de ce dernier dans notre programme. Ceci devra être modifié affin de se rapprocher de la réalité. Il serait également utile de pouvoir écrire dans un fichier l état des brins d ADN modélisés, affin de ne pas perdre les différents exemples mis en place. Il pourrait être utile d utiliser un fichier d initialisation d une séquence d ADN, contenant le code génétique ainsi que les nucléosomes, leurs places et leurs états épigénétique. Un tel fichier permettrais de ne pas être obliger de refaire les mêmes manipulations pour initialiser la simulation. L utilisation réelle du programme vient par la suite, c est à dire quand on déplace les nucléosomes et que l on change leur état pour savoir si le brin est toujours transcriptible ou non. Ce serait d ailleurs, le seul moyen pour l utilisateur, de pouvoir directement choisir les nucléotides de la chaîne d ADN. 18
Conclusion Au cours de ce projet, nous avons pu déployer les techniques apprises en cours de C++ pour modéliser les structures de la chromatine et les changements épigénétiques qui interviennent à leur niveau. Nous avons dû nous familiariser avec certaines notions en biologie, et les codes sources que nous avons élaborés correspondent aux objectifs fixés au début du projet. Ces codes sont destinés aux biologistes du DCU. Ils ne sont pas fidèles à la réalité observée dans la nature, ils nécessitent donc certaines améliorations. Celas sera pris en charge lors du stage auquel le projet donne suite. 19