Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules La biophotonique pour l étude de la dynamique et des interactions moléculaires dans le noyau Mesure de dynamique FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy) SPT (Single Particule Tracking) Etudes des interactions moléculaires par BIFC FRET / intensité FRET / temps de vie de fluorescence Corentin Spriet Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules Mesure de dynamique FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy) SPT (Single Particule Tracking) Etudes des interactions moléculaires par BIFC FRET / intensité FRET / temps de vie de fluorescence Comment décrire une protéine/activité L ARN polymérase II Enzyme eucaryote Complexe de 550 Kda composé de 2 sous-unité (RBP) chez l humain RBP = plus grande sous-unité qui contient un domaine C-ter essentiel pour l activité de transcription Architecture du complexe chez Saccharomyces cerevisiae Cramer & al, Science, 2000 Transcription : des ARNm de certains ARNsn (small nuclear) de certains microarn Comment décrire une protéine/activité Comment décrire une protéine/activité
Comment décrire une protéine/activité ptefb Heterodimer (+CdK9) Free ptefb : activates RNA polii early elongation step : inactivate ptefb DRB (5,6-dichloro- D ribofuranosylbenzimidazole ): prevent the RNA Pol II early elongation step. Comment décrire une protéine Et le temps Diffusion, random collision, binding, conformational changes Low number of molecules inactive Modèle proposé CdK9 active (-) DRB 7SK RNA CdK9 DRB (-) RNA mrnas adjust rapidly to changes in genes activity Proteins follow slowly mrna changes ADN Comment décrire une protéine Population/cellules/localisation Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules Mesure de dynamique FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy) SPT (Single Particule Tracking) Etudes des interactions moléculaires par BIFC FRET / intensité FRET / temps de vie de fluorescence From Elowitz MB et al 2002. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science, 297, 83-6 Etude de la dynamique des protéines Photobleaching «Réactions photochimiques irréversibles» Oxydation (Oxygène sigulet : radical libre) Décomposition Polymérisation Réaction avec d autres molécules Photo-destruction (photobleaching) - Caractéristique d un fluorochrome - Dépend de l environnement 2 coefficients sont principalement utilisés pour caractériser ces mouvements : La fraction mobile M La constante de diffusion Ne pas confondre avec le quenching : Inhibition réversible, dépendante de l environnement. 2
FRAP FRAP Lippincott-Schawrtz FRAP FRAP Mb-GFP (durée 30s) i-frap FLIP Compartiment Molécule fluorescente Région d intérêt Acquisition (pre-bleach) Photobleaching ( t0) Acquisition (t) Acquisition (t2) Acquisition (tn) Avantage : on regarde une zone qui n a pas été soumise à une forte source d énergie : limite le stress local. Inconvénient : Presque toute la cellule est photo blanchie : stress global plus important. Avantage : on regarde une zone qui n a pas été soumise à une forte source d énergie : limite le stress local. Inconvénient : Photo blanchiment répété d une même zone Moins invasif que le ifrap mais plus que le FRAP. 3
Photo-activation Retour à l ARN PolII Photoblanchiement de l ARN pol II-YFP GFP photoactivable GFP excitable a 488 GFP fluorescente 43 nm 488 nm Site de bleaching : au niveau du site de transcription Observation de la disparition de fluorescence au spot de photoactivation Réapparition de l ARN pol II en fonction du temps Exemple de photoactivation de la PA-GFP en cellules COS-7 Patterson & Lippincott-Schawrtz, Science 2002 In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription Darzacq X, Shav-Tal Y, de Turris V, Brody Y, Shenoy SM, Phair RD & Singer. Nature Structural & Molecular Biology, 2007 Retour à l ARN PolII Retour à l ARN PolII données obtenues ( ) = somme d exponentielles Modèle mathématique qui correspond le mieux aux données : 2 composantes exponentielles 3 composantes exponentielles A ~ proportion de molécule a ~ vitesse 3 populations 3 rôles? rapide = polymérases qui se fixent sur le promoteur moyenne = polymérases impliquées dans l initiation de la transcription lente = polymérases impliquées dans l élongation Modèle cinétique utilisé pour simuler les données : Ecarts des points obtenus expérimentalement par rapport au modèle Le modèle à 3 composantes est meilleur Équations différentielles qui simulent ce modèle : Variation [pol] en fonction du temps 22 Retour à l ARN PolII Retour à l ARN PolII DRB = Inhibiteur de transcription qui affecte l élongation vérifier que les polymérases en élongation = population lente Vérifier que les techniques permettent des mesures équivalentes 3D FRAP Confocal Localisation - + Rapidité + - 3% des polymérases qui interagissent avec leur promoteur vont poursuivre en initiation Parmi celles ci : 8,6% vont jusqu en élongation (soit.% des polymérases qui ont interagit avec le promoteur) interaction sur 90 va produire un ARNm 23 Le DRB affecte la composante lente du modèle. Il y a augmentation du temps de résidence des polymérases en élongation. La population lente correspond aux polymérases en phase d élongation. 24 4
En résumé Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules Mesure de dynamique FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy) SPT (Single Particule Tracking) Etudes des interactions moléculaires par BIFC FRET / intensité FRET / temps de vie de fluorescence Intéressant de regarder à longue et courte distance FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy. On positionne le faisceau laser dans un locus d intérêt => les particules fluorescentes entrent et sortent du volume focal 2. On mesure alors les fluctuations d intensité 3. Calcul de la fonction de correlation F( t) F( t ) G( ) 2 F( t) 4. Ajustement par un modèle biophysique approprié => Obtention des paramètres (diffusion, nombre de molécules ) FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy L auto-correlation vision très schématique 5
0,0 0,04 0,07 0, 0,4 0,7 4 7 0 40 70 00 400 700 000 0,0 0,03 0,05 0,07 0,09 0,2 0,4 0,6 0,8 3 5 7 9 20 40 60 80 00 300 500 700 900 G(t) normalisé Contribution relative (%) 0,0 0,03 0,05 0,07 0,09 0,2 0,4 0,6 0,8 3 5 7 9 20 40 60 80 00 300 500 700 900 FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy On a le même signal après dt ligand linked to another molecule ligand mix of free and linked ligand On a plus du tout le même signal après dt FCS Fluorescent Correlated Spectroscopy Retour à l ARN PolII CdK9 (-) DRB 7SK CdK9 DRB (-) ADN,2 4 2 0,8 + DRB 0 +DRB 0,6 8 0,4 6 0,2 0 0,0 00 0000 Temps (ms) 4 2 0 Retour à l ARN PolII Retour à l ARN PolII CdK9 CdK9 (-) (-) DRB 7SK DRB 7SK CdK9 DRB CdK9 DRB (-) (-) ADN ADN,2 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,0 00 0000 Temps (ms) 6 4 2 0 8 6 4 2 0,2 254 0,8 333 0,6 0,4 0,2 0 0,0 00 0000 temps (ms) 25 20 5 0 5 0 254 333 Temps de diffusion (ms) 6
Plan: SPT: principe Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules Mesure de dynamique FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy) SPT (Single Particule Tracking) Etudes des interactions moléculaires par BIFC FRET / intensité FRET / temps de vie de fluorescence Principe simple: suivre des particules uniques au cours du temps et étudier leur déplacement [Ewers et. al. PNAS, 02, 50-5] SPT: fluorophores SPT: en pratique! European Journal of Neuroscience, Vol. 30, pp. 987 997, 2009 SPT: en pratique! SPT: en pratique! Dt() MSD Dt 7
SPT: en pratique! SPT: en pratique! MSD MSD Dt Dt SPT: en pratique! SPT: en pratique! http://www.biotec.tu-dresden.de/cms/fileadmin/research/biophysics/practical_handouts/spt.pdf J. Phys. Chem. B 2007,, 3625-3632 SPT: en pratique! Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules Mesure de dynamique FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy) SPT (Single Particule Tracking) Etudes des interactions moléculaires par BIFC FRET / intensité FRET / temps de vie de fluorescence BMC Cell Biology 2004, 5:45 8
Interactions BiFC Kerppola Lab Online BiFC BiFC FRET, BiFC = interaction between molecules Kerppola Lab Online BiFC BiFC Kerppola Lab Online 9
BiFC les défauts Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules Mesure de dynamique FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy) SPT (Single Particule Tracking) Etudes des interactions moléculaires par BIFC FRET / intensité FRET / temps de vie de fluorescence Le FRET Le FRET CFP YFP Interactions protéines-protéines Changement de conformation FRET Transfert d énergie non radiatif du donneur (CFP) vers l accepteur (YFP) FRET Visualisation du FRET par excitation du donneur et observation de l accepteur Le FRET Le FRET: rapport d intensité donneur/accepteur FRET Points critiques: Excitation directe de l accepteur dans le filtre FRET Emission du donneur dans le canal FRET Expérimentalement: Donneur avec les 3 combinaisons de filtres Accepteur avec les 3 combinaisons de filtres Compensation des excitations indirectes et fuites spectrales Calcul du FRET Erickson et al, biophys J, 2003 0
log I 0 /I Le FRET: photo-blanchiment de l accepteur Principe : FRET Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules Mesure de dynamique FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) FCS (Fluorescence Correlated Spectroscopy) SPT (Single Particule Tracking) Etudes des interactions moléculaires par BIFC FRET / intensité FRET / temps de vie de fluorescence Fluorescence resonance energy transfer from cyan to yellow fluorescent protein detected by acceptor photobleaching using confocal microscopy and a single laser T. S. Karpova et al. Le temps de vie de fluorescence Δt Δt Le temps de vie de fluorescence Le temps de vie de fluorescence k = / Temps de vie de fluorescence avec k = k r + k nr I int Δt Dt (ns) intrinsèque environemental Δt intégrale: Intensité de fluorescence Environement moléculaire, FRET ~indépendant de la concentration
Nbr de photons Nbr de pixel Confocal imaging of -Cer +/- -Venus Lifetime images of -Cer Mesure de TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting) Analyse des courbes F( t) IRF ( Of / a e t i ) m i a i i a i i i i F(t) : la fonction à déterminer, Of : «l offset» ou niveau zéro à fixer pour fixer le niveau du bruit, a i : les coefficients d intensité exprimés en amplitude relative, : les temps de vie de fluorescence. i Application aux mesures de FRET ptefb A B FRET Cer -Cer hexim-venus -Cer hexim-venus+ DRB 3.2 ns Mean lifetime: 2,85 +/- 0,03 ns Mean lifetime: 2,72 +/- 0,0 ns Mean lifetime: 2,66 +/- 0,0 ns 2.5 ns 0000 000 τ B τ A A B+A 00 τ A 0 Temps (ns) Temps de vie (τ) Temps de vie (τ) Molecular interaction between - in living cells DRB modify and interactions higher proximity between partners Travail in vivo: étude dans l embryon Dynamique et interactions en cellules/tissus/animaux. 3 ns Dynamique Interactions (FRET) FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching FCCS Fluorescence Cross Correlated Spectroscopy TCSPC Time Corelated Single Photon Counting FLIP Fluorescence Loss In Photobleaching FCS Fluorescence Correlated Spectroscopy φ/m Phase and Modulation lifetime SLiM Spectral and Lifetime Measurements.5 ns 2
Definition Les biosenseurs sont des systèmes de reconnaissance moléculaire dont certains éléments sont inspirés ou ont été empruntés à des systèmes biologiques connus. Analyte Les bio-senseurs Biorecepteur Transducer Measurable signal La définition formelle proposée par IUPAC est : [traduction libre] Un biosenseur est un dispositif intégré autonome capable de fournir des informations analytiques quantitatives ou semi quantitatives en utilisant un élément biologique de reconnaissance qui est en contact spatial direct avec un élément de transfert. Un biosenseur doit être clairement distingué des systèmes bioanalytiques qui demandent des étapes supplémentaires de fonctionnement, tel que l'addition de réactifs. De plus, un biosenseur doit être distingué d'une biosonde qui est soit jetée après une utilisation, i.e. à usage unique ou incapable de suivre la concentration d'analyte de façon continue. Biosenseur : un terme générique a large spectre! Principe Analyte Biorecepteur Transducer Biosenseur Measurable signal Un biosenseur est généralement constitué de deux parties aux fonctions distinctes. Ces parties sont le système de reconnaissance et le transducteur («transducer élément»). Kinase activity reporter Kinase activity reporter Biosensors design: Getting the blocks together 2 3 4 -FRET donor, 2- PAABD +Linker, 3- Kinase substrate and docking site, 4- FRET acceptor Fig.. Basic structure of a kinase activity reporter. A kinase activity reporter consists of four basic modules that are linked in sequence, namely a FRET donor (e.g. CFP), a phosphoaminoacid binding domain, a substrate domain, and a FRET acceptor (e.g. YFP). Additional elements include defined docking sites for recruiting the kinase of interest and localization sequences for targeting the reporter to different subcellular compartments or protein complexes. FRET-based biosensor tool kit library Using multisite Gateway strategy 3
Modulation lifetime (ns) Kinase activity reporter Le FRET: rapport d intensité donneur/accepteur FRET Points critiques: Excitation directe de l accepteur dans le filtre FRET Emission du donneur dans le canal FRET Expérimentalement: Donneur avec les 3 combinaisons de filtres Accepteur avec les 3 combinaisons de filtres Compensation des excitations indirectes et fuites spectrales Calcul du FRET Erickson et al, biophys J, 2003 Le FRET: rapport d intensité donneur/accepteur pour les senseur! Etudes d interaction dynamique Phase lifetime AKAR2 biosensor Monitors PKA/phosphatase equilibrium PKA activation: phosphorilation of theonine domain Reversible conformational change: Phosphatase: can dephosphorilate the probe Forskoline: indirect activator of PKA activity t Epac vv 2,5 2,4 2,3 2,2 2, 2,9,8,7 Forskoline 0 500 000 500 2000 time (s) ROI ROI2 ROI3 ROI4 ROI5 ROI6 ROI7 Couplage de technique camp activity Reporter 4
Biosenseurs Caspase Principe d un biosenseur caspase : Biosenseurs Caspase Exemple de résultats : Biosenseur caspase 8 Activation caspase 8 en cellules HeLA après induction de l apoptose par le TNF-α FRET Condition : 0 nm max entre les fluorophores Luo et al, BBRC, 2003 Exemple de résultats : 0 μm Différents biosenseurs caspases existants Neefjes et al, Nat Rev Drug Discov, 2004 85 Biosenseur caspase 3 Cellules HeLa traitées à la staurosporine (= inducteur apoptose) activation caspase 3 Ai et al, Nat Met, 2008 86 Régulation du cycle cellulaire Premo FUCCI Cell Cyle Sensor Premo FUCCI Cell Cyle Sensor Premo FUCCI Cell Cyle Sensor Movie S. Time-Lapse Imaging of Fucci-Expressing HeLa Cells. Cells were grown on a glass-bottom dish, and time-lapse imaging was performed with an LCV00 microscope (Olympus). Images were acquired every 3.5 min. Playback speed is 24300 real time. Total imaging time = 64 hr. 5
Premo FUCCI Cell Cyle Sensor TD Exam! Movie S2. Time-Lapse Imaging of Fucci-Expressing NMuMG Cells. Cells were grown on a glass-bottom dish with (right) or without (left) TGFβ. After incubation for 3 days, culture medium was replaced with fresh medium. Images were acquired every 0.3 min. Playback speed is 8,000 real time. Total imaging time = 87 hr. The scale bar represents 50 μm. Lambda/NA 4 Questions rapides (5 min par question, prévoir 20 min, /3 des points) Expliquer la limite de résolution en optique par un schéma et une courte explication. Donner les paramètres importants. Critère de Rayleigh : d = 0,6 N.A. N.A. : ouverture numérique de l objectif Objectifs Exemples de questions rapides: Différence technique entre un confocal et un microscope champ large Dans quel cas choisir un confocal ou un microscope champ large Choix de l echantillonnage Comment retirer du bruit d une image sans ajouter un effet de flou Proposez une méthode pour «remplir les trous» de cette structure. Principe du FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) Comment choisir son fluorophore? Exemples de questions redactionelles: Principales spécifications : - ouverture numérique (ex. :,4) - grandissement (ex.: 60x) - milieu d immersion (air, eau, huile) - type de correction Proposez une méthode pour faire du suivi de cellules et de mitoses Proposez une méthode de suivi de l étape du cycle cell Proposez une méthode se suivi de la dynamique d une protéine d interet stratégie générale et pourquoi description rapide de l experience contrôles proposés 6
Effet confocal assuré! ICF Champ large vs Confocal ICF Camera CCD Photomultiplicateur Filtres Miroir Dichroïque Pinhole Source Laser Objectif Conventionnelle Confocal Lampe Mercure 00 W Echantillon Scanning d xy = 0,6. em /(n sin ) d xz = 2. em /(n sin ) 2 d xy = 0,4. em /(n sin ) d xz =,4. em /(n sin ) 2 Microscopie Classique Abbe, 872 Microscopie confocale Marvin Minsky (957) Fluorophore ICF Un bon fluorophore doit posséder : une absorbance molaire élevée un rendement quantique de fluorescence le plus près possible de un spectre d'émission dans le visible un déplacement de Stokes supérieur à 50 nm éventuellement une stabilité des propriétés de fluorescence une fois couplé à une molécule non fluorescente (protéine) que l'on cherche à coupler. Peu de substances rassemblent ces propriétés. La fluorescéine, la rhodamine, les coumarines, l'umbelliférone et leurs dérivés sont les plus utilisés. La durée de vie de toutes ces substances sont brèves, de l'ordre de quelques ns. 7