PLACE DE L IMAGERIE CELLULAIRE DANS L ETUDE DES CELLULES SOUCHES «PLACE DE L ANATOMIE PATHOLOGIQUE DANS L ETUDE DES CELLULES SOUCHES»

PLACE DE L IMAGERIE CELLULAIRE DANS L ETUDE DES CELLULES SOUCHES «PLACE DE L ANATOMIE PATHOLOGIQUE DANS L ETUDE DES CELLULES SOUCHES»

A quoi sert l Anatomie Pathologique? Faire le diagnostic de pathologies à partir de cellules et de tissus humains 80% des diagnostics: pathologie tumorale (tumorothèques) Le reste: pathologie inflammatoire (digestive, cutanée), immunologique (greffes), dégénératives (Alzheimer..)

Intérêt des cellules souches: classification des tumeurs Autrefois: classifications morphologiques des tumeurs Classifications des tumeurs en fonction du stade de différenciation de la cellule à l origine du clone tumoral Tumeurs hématopoïétiques et lymphomes: oui Tumeurs épithéliales? Tumeurs mésenchymateuses?

Cellules souches et réparation tissulaire Pas d implication en routine Toutes nos techniques sont applicables à l étude des cellules souches dans le cadre de la recherche

Moyens d étude morphologiques des tissus et des cellules Techniques d inclusion + coupes histologiques = microscopie optique Immunofluorescence, Immuno(cyto)histochimie Hybridation in situ

I- Techniques de fixation-inclusion standards 1- Choix et identification des prélèvements 2- Fixation 3- Inclusion 4- Coupe

Techniques de fixation-inclusion standards I.1- Choix et identification des prélèvements

Techniques de fixation-inclusion standards I.2- La fixation

La fixation des tissus: Principes théoriques - Etat aussi proche que possible du vivant - S opposer à l autolyse - Insolubiliser les constituants cellulaires, - S opposer aux distorsions et rétractions = durcir le tissu - Préparer les structures tissulaires aux traitements ultérieurs

I.2.1- Fixation physique : congélation Tissu plongé dans un liquide refroidissant et caloporteur : Utilisation courante : - N2 liquide - 190 C - iso pentane 130 C - Fréon, Butane-Propane Enrobage dans substance protectrice (OCT)

Fixation physique : congélation Avantages - maintien de la réactivité de l Ag (fixation idéale) - état proche du vivant (résurrection) - fixation rapide d états transitoires - maintien en place des constituants solubles ou dépolymérisables - préservation d organites sensibles à la pression osmotique

Fixation physique : congélation Inconvénients : - lourd, peu pratique (sauf si N2 liquide) - structures détruites (cristaux) - moins bonne morphologie

I.2.2- Fixation chimique

Fixation chimique: les agents précipitants Précipitation Modification structure III aire des protéines : effet dénaturant Agents Alcool éthylique, acétone Avantage Préserve l antigénicité Inconvénients Effet souvent réversible Déshydratation simultanée altérations morphologiques

Fixation chimique : Les agents pontants Effet pontant Immobilisation par des liens intra et intermoléculaires Agent Formol, liquides de Bouin Avantages : - Structures mieux préservées: bonne morphologie - Meilleure immobilisation des protéines Inconvénients -Dénaturation + sévère des Ag - Masquage des Ag

Techniques de fixation-inclusion standards I.3- L inclusion

I.3- Inclusion Imprégnation d un tissu /milieu, capable de le durcir de manière homogène maintenir les éléments en place coupe fine

I.3.1- Inclusion en paraffine Déshydratation (EtOH) Solvant intermédiaire (Benzène, Toluène, Xylène) Imprégnation en paraffine (56-58 C) Inclusion en paraffine bloc

I.3.2- Autres types d inclusions - en gélatine - en résines polymères -objets durs - pour microscopie électronique

Techniques de fixation-inclusion standards I.4- La coupe

Confection des coupes: la microtomie - Microtome à congélation : 7 à 10 µm - Microtome à paraffine : 2 à 5 µm - Ultra microtome : 500 à 1500 A

Coloration et lecture Coloreuse: hématéine - éosine Lecture

Macro coupes Souris

Tissue array Carottes de 0,6 à 2 mm

II. Examens cytologiques 1- Matériels cytologiques 2- Techniques cytologiques

II.1 Matériels cytologique - Liquides physiologiques : LCR, sang, urines - Liquides d épanchements : pleural, ascite - Produits de lavage : bronchiolo-alvéolaire - Ponctions d organes pleins à l aiguille - Produits de brossage, de grattage - Cellules isolées provenant de culture - Suspension de cellules après broyat tissulaire

II.2 Techniques cytologiques Etalement sur lame : Etalement direct, empreinte, frottis Cytocentrifugation Culture de cellules sur lamelles Enrobage (culot) inclusion Agarose 3% Gélatine 2-10% Paraffine

III. Immunofluorescence Immunohisto (cyto)chimie 1- Intérêts 2- Principes 3- Accès des Ac à l Ag 4- Les anticorps 5- Système révélateur 6- Amplification de signal 7- Analyse de la technique 8- Contrôle du marquage

III.1 Intérêts - Détection spécifique de protéines sur matériel cytologique ou sur coupes tissulaires - localisation (+/- quantification) d'une protéine dans une cellule ou un tissu

III.2 Principes Le système révélateur L anticorps Lumineux (fluorescent) Coloré (enzyme) opaque (Or, Argent) Polyclonal Monoclonal L antigène Tissu Présentation de l Ag

III.3 Accès des Ac à l Ag 1) Démasquage antigénique - Enzymatique Trypsine 0,1% TA Pronase 0,1% 37 C Pepsine 0,4% 37 C -A la chaleur tampon citrate four à micro-ondes tampon EDTA autocuiseur bain-marie ++ étuve

III.3 Accès des Ac à l Ag 2) Perméabilisation des membranes Cellules entières Détergents non ioniques : Triton 0,1% Saponine 0,1-0,01%

III.3 Les anticorps 1) Anticorps polyclonaux : Avantages : - plusieurs Ac contre un seul Ag - plus «sensible» - fixation moins critique - mise en œuvre rapide Inconvénients : - spécificité moindre : reconnaît différents déterminants d un même Ag - affinité et spécificité variables suivant le lot

III.3 Les anticorps 2) Anticorps monoclonaux : Avantages : - mono spécifiques (un épitope) - affinité homogène - production régulière, sans variabilité Inconvénients - réalisation plus difficile - plus grande sensibilité à la qualité de la fixation

III.3 Les anticorps 3) Fragments Fab ou F(ab ) 2 : Obtention : digestion ménagée, purification Avantages : - taille moindre : meilleure pénétration - pas de fixation Fc non spécifique

III.5 Système révélateur 1) Fluorescence Principe : absorption - émission FITC (isothiocyanate fluorescéine) RITC (isothiocyanate rhodamine) TRITC (isothiocyanate tétraméthylrhodamine) Absorption Emission couleur (nm) (nm) 490 520 vert 520+550 575 orangerouge 520+550 575 orangerouge DAPI bleu

III.5 Système révélateur Avantages : -protocoles rapides - grande sensibilité (fond noir) Ag avec faible [ ] - colocalisations possibles -confocal Inconvénients : - montage aqueux : disparaît au cours du temps - sensibilité à la lumière : stockage à 4 C, ombre - extinction du signal sous UV - microscope spécialement équipé, chambre noire -marche mal en paraffine

III.5 Système révélateur 2) Marquage à l or Microscopie électronique Inhibiteur de la cystéine protéase dans une feuille de tomate

III.5 Système révélateur 3) Marqueur enzymatique - Enzymes : HRP: peroxydase du raifort Phosphatase alcaline Glucose oxydase β-galactosidase -Substrats = chromogènes

III.5 Système révélateur Chromogène (incolore et soluble) Composé coloré insoluble Enzyme Chromogène coloration Compatib. enzyme HRP : DAB (3.3 brun H2O, EtOH Diaminobenzydine) AEC (3 Amino 9 Ethyl rouge H2O Carbazole) 4 Chloro 1 Naphtol bleu H2O AP : Fast blue bleu H2O, EtOH Fast red rouge H2O

III.5 Système révélateur Avantages : Visualisation aisée, microscopie optique Grande sensibilité Différentes couleurs et contres colorations Stables si déshydratées Double marquage avec vision simultanée (sauf si [Ag1] >> [Ag2] ou si colocalisation)

III.5 Système révélateur Inconvénients : Protocoles longs Pas de colocalisation Contraste insuffisant si [Ag] faible Substrats potentiellement carcinogènes Diffusion du précipité (précision)

III.6 Amplification du signal 1) Technique directe non amplifiée Avantages : peu d étapes peu de bruit de fond Inconvénient : peu sensible

III.6 Amplification du signal 2) Technique indirecte non amplifiée Avantages : Utilisable pour des Ac Iaire différents Inconvénients :peu sensible

III.6 Amplification du signal 2) Technique indirecte amplifiée Biotine - streptavidine (avidine) Complexe streptavidine (avidine) - biotine - peroxydase préformé PAP et APAAP

Système complexe streptavidine (avidine) - biotine - peroxydase préformé 4 3 2 1

III.6 Amplification du signal Avantages : Peu de gène stérique Liaison biotine - streptavidine irréversible (covalente) Amplification considérable possible Inconvénients : bruit de fond Biotines endogènes

III.7 Analyse de la technique

III.7 Analyse de la technique La technique a-t-elle marchée? Importance des témoins positifs

Glandes non tumorales : +++ Tumeur : 0%

III.7 Analyse de la technique Le marquage obtenu est il spécifique? = Bruit de fond

1 2 Fixation non spécifique de l Ac Iaire: rare

Fixation non spécifique de l AC IIaire

Solution: pré incubation avec sérum isotypique à l AC IIaire 3 2 1

Chromogène = substrat d enzymes endogènes: peroxydases (cellules myéloides, PN +++)

Solution: pré incubation avec un inhibiteur des péroxydases endogènes: eau oxygénée

Liaison de l avidine aux biotines endogènes: foie ++

III.8 Contrôles du marquage 1) Contrôle positif - témoins externes - témoins internes 2) Contrôle négatif - sans incubation avec Ac spécifique: omission - incubation avec un Ac Iaire de même isotype à la même [ ] dirigé contre un Ag absent du tissu (mab) - incubation avec sérum correspondant à l AC IIaire (pab) - incubation de l Ac sur un tissu ne renfermant pas l Ag 3) Extinction - Pré incubation avec l Ag en excès (x 50 à 100)

anti Fib1 anti Fib1 + protéine IgG1a

anti Fib1 anti Fib1 + protéine IgG1a

anti Fib1 anti Fib1 + protéine IgG1a

anti REβ anti REβ + protéine Ig non specif.

anti REβ anti REβ + protéine Ig non specif.

anti REβ anti REβ + protéine Ig non specif.

IV Analyses des résultats 1- Analyse qualitative

IV.1 Analyses qualitative La protéine est elle présente? Quelle est sa topographie?

Marquage cellulaire Quelles cellules sont positives? Quelle partie de la cellule est positive?

Matrice extracellulaire

Possibilité de doubles marquages Pas de colocalisation

IV.2 Analyses quantitative DOSAGE BIOCHIMIQUE IMMUNOHISTOCHIMIE QUANTITATIVE Avantages et inconvénients - beaucoup de matériel - topographie non précisable - réputé facile et reproductible - peu de matériel - dosage dans un compartiment tissulaire précis - quantitatif?

Préalable: déterminer les conditions d un marquage optimum Concernant le conditionnement des échantillons: - conditions de conservation de l'ag - détermination des conditions de fixation Concernant la technique d'immunomarquage: -démasquage - concentration de l'ac I aire - concentration des Ac II aire Marquage spécifique maximum Marquage non spécifique minimum Reproductibilité

Durée de démasquage : 0 min

Durée de démasquage : 5 min

Durée de démasquage : 10 min

Durée de démasquage : 15 min

Durée de démasquage : 20 min

Durée de démasquage optimisée 300 250 200 Score 150 100 50 c 0 0min 5min 10min 15min 20min 25min 30min Durée de démasquage

Méthodes Méthodes semi quantitatives : visuelle Comptage de structures marquées par unité de surface, appréciation de l intensité de marquage Méthode analytique Méthode globale Méthodes quantitatives : analyseur d'images Le choix de la méthode dépend : - du type de marquages - des moyens disponibles

1) Méthode analytique : Compteur + grille (quadrillage): comptage cellule/cellule - sur zone préalablement choisie (zone la plus marquées, ) - sur l'ensemble de la préparation Long et fastidieux

2) Méthode globale

V. Hybridation in situ 1- Sur quel matériel 2- Choix du fixateur 3- Prétraitement 4- Les différentes étapes 5- Révélation 6- FISH 7- Quantitatif 8- Qualitatif

V. Hybridation in situ Détection spécifique d une séquence d acides nucléiques dans un tissu par hybridation d une sonde de séquence connue

V.1 Les sondes Plusieurs types Cosmides: séquence courte d ADN 10 à 40 Kb Sondes alpha satellites: séquences répétitives proche des centromères, spécifiques d un chromosome le plus souvent Marqueurs: Radioactifs Non radioactifs: fluorescent, biotine, digoxigénine

V.2 Sur quel matériel? Frais ou congelé > paraffine Si paraffine: prétraitement, ne pas utiliser des fluorochromes Appositions ou cytocentrifugation > coupes (superpositions nucléaire)

V.3 Choix du fixateur Fixateurs compatibles avec l ISH: Formol tamponné 10%, paraformaldehyde, Fixateur de Karnovsky (16% paraformaldehyde, 50% glutaraldehyde) Fixateurs non compatibles avec l ISH: Fixateurs à base d acides (acide picrique, etc.) Alcools si utilisés seuls..

V.3 Prétraitement ADN: entouré de protéines hydrolyse et/ou digestion enzymatique préalables surtout si coupes en paraffine ARN: travailler en milieu RNAse free

V.4 Différentes étapes Dénaturation sonde par chauffage (70 C) avec formamide 50 à 70% Dénaturation de l ADN cible / plaque chauffante (72 C) Hybridation: une nuit à 37 C-42 C Lavages dans une solution stringente (SSC) pour éliminer les hybridations non spécifiques

72 C HER2 Chr 17 Chr 17

HER2 A T A G C T A T A T C G A T P

V.5 Révélation Si sonde marquée avec un fluorochrome: lecture directe possible Si signal trop faible ou sonde marquée par une molécule non fluorescente: méthode indirecte Anticorps secondaire fluorescent IHC secondaire

HER2 F

Exemple d amplification: 3 ADN cible Sonde 1 2

V.6 Fish: lecture, interprétation Excitation : lumière UV + filtre Émission dans le visible Photo-oxydation : extinction du fluorophore

V.7 Quantitatif: difficile Délétion, microchimérisme - Appositions > coupes -Compter de très nombreux éléments (2000) Seuil à partir d un tissu témoin++

V.8 Qualitatif: plus facile Translocation: selon les sondes, point de fusion par colocalisation ou au contraire «split» t(14;18) IgHC, Bcl2

Ex Cish: amplification génique Amplification de HER-2 dans un carcinome mammaire

Ex CISH: détection d ARN viral Sondes EBER dans un lymphome T/NK nasal

VI Combinaisons de techniques Hybridation in situ fluorescente (Fish) et immunofluorescence.

VII. Place de ces techniques pour l étude des cellules souches?

Identification des cellules souches en culture Non, CMF plus performante

Suivi de la différenciation des cellules souches (cellules souches adultes, ES et MAPC) in vitro? Oui, car ébauche de structures pluricellulaires

VII.1 Différenciation in vitro de mmapcs Insert retroviral: expression d un gène codant pour une protéine fluorescente : cellules egfp+ Expression d un gène marqueur codant pour une β galactosidase: cellules Gal+ Culture avec cytokines spécifiques Jiang Y et al: Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow, Nature 20 June, 2002

egfp+ Anti vwf-cy3 egfp+ Anti vwf Cy3 + VEGF: phenotype endothélial egfp+ Anti albumine-cy3 egfp + albumine-cy3 + FGF4 + HGF: phénotype épithélial hépatocytaire egfp +Anti GFAP-Cy5 egfp + Anti-NF-Cy3 + bfgf: phénotype astrocytaire et neuronale mmapcs egfp+

VII.2 Devenir somatique des MAPCs chez la souris? MAPCs porteuses d un gène marqueur codant pour une β galactosidase Injection de MAPCs dans des blastocytes de souris puis transplantation dans utérus de souris mères Coupes de souris entières colorées par le X- gal: β galactosidase entraîne l hydrolyse du X- Gal conduisant à la production d un précipité bleu

Pas de chimérisme Chimérisme à 45%

Cerveau Peau Muscle strié Myocarde Foie Grêle Rein Rate

Coupes de cerveau: Cortex avec un chimérisme = à 45% Anti-β-gal-Cy3, anti-gfap-cy5 et anti-neun-fitc

Grêle Anti-β-gal-FITC anti-cd45-pe et anti-panck-cy-5 Poumon Anti-β-gal-FITC anti-cd45-pe et anti-panck-cy-5

VII.3 Différenciation des mmapcc en cellules tissulaires spécifiques chez la souris adulte? Injection intraveineuse de mmapcs chez des souris SCID Sacrifice après 4 semaines Destination des cellules gal+ determinées par immunofluorescence (AC anti Gal) Doubles immunomarquages pour identifier les cellules

Coupes de foie contrôle L, m, n: Anti-β-gal-FITC anti-ck18-cy-5, anti-cd45-pe O: Anti-β-gal-FITC anti-albumine- Cy-5

VII.4 Microchimérisme et HIS Après greffe de moelle, donneur masculin, receveur féminin: suivi des cellules souches hématopoïétiques du donneur: foie, coeur, cerveau Microchimèrisme foeto-maternel

Syndrome du lupus néonatal: NLS Pathologie auto-immune de développement intra utérin Bloc cardiaque souvent létal, myocardite, hépatite Prélèvements autopsiques de 4 nouveaux nés NLS masculins + prélèvements autopsiques de nouveaux nés masculins contrôles Stevens A et al: Myocardial-tissue-specific phenotype of maternal microcherism in neonaral lupus congenital heart block, Lancet, 362:1617-24, 2003

Coupes de myocarde d un nouveau-né NLS Coupes du noeux atrioventriculaire d un nouveau-né NLS Sonde anti-x sonde anti-y 0,03 à 2,2% de cellules maternelles (/2000 cel) pour 0 à 0,1% dans le cœur contrôle: que sont ces cellules?

Sur la même coupe de myocarde Microscope à fluorescence Microscope optique Sonde anti-x sonde anti-y cellules CD45+, cellules actine sarcomérique + 2/661 cellules CD45+: XX

Sur la même coupe de myocarde Microscope à fluorescence Sonde anti-x sonde anti-y Microscope optique cellules CD45+, cellules actine sarcomérique + Plus de 80% des cellules maternelles sont des myocytes

Sur la même coupe de myocarde Microscope optique Microscope confocal sonde anti-x Anti-CD45 Anti-actine α sarcomérique: vector red, rouge en MO

Différenciation en myocytes de cellules souches maternelles Réaction auto-immune contre ces cellules semiallogéniques responsable de la maladie

FIN

Solution: Préincubation avec un inhibiteurs des biotines endogènes