Caractérisation des syndromes lymphoprolifératifs chroniques en conversion leucémique par cytomètrie en flux. F.Harieche, N.Abdennebi, F.Boukhemia, A.Talbi, S.Akhrouf, S.Abderrahmani, F.Boumansour, H.Bouarab, S.Bellataf, L.Kouici, L.Chikhi, F.Zerhouni, R.M.Hamladji.
Syndromes Lymphoprolifératifs Chroniques Points communs: SLPC Cellules tumorales de phénotype mature Évolution spontanée chronique Hétérogénéité clinique Variabilité morphologique: cellules lymphoïdes Passage sanguin Distinction difficile avec les diverses variétés de LLC
SLPC: diagnostic Cyto Histo Immunophénotype Cytogénétique conventionnelle Cytogénétique moléculaire FISH Biologie moléculaire Dialogue clinicien/ biologiste.
Expérience du laboratoire d`hématologie du CPMC 1997: introduction de la CMF (FacsCalibur 3C) Applications: Immunophénotypage des L.A, Num des CD34 (contrôle de qualité des greffons de CSH), Immunophénotypage des SLPC: 2001
Patients: (N=404) Étude rétrospective: Jan 2001 Dec 2009. Caractéristique Résultat Sexe Ratio: 164 1,64 Hommes 251 Femmes 153 Age (années) Médiane [extrêmes] ] 66 [34 95] GB (G/L) Médiane [extrêmes] 36 [1,8 666] Lymphocytose (G/L) Médiane [extrêmes] 24 [1,1 646]
Échantillons biologiques gq Sang total: EDTA Numération sanguine. Formule leucocytaire avec étude cytologique des cellules lymphoïdes au frottis. Immunophénotypage. Prélèvements médullaires: Peu ou pas de cellules lymphoïdes anormales(leucopénie ou non). Seule la MO est infiltrée
Méthodes: 1- Examen morphologique: wright. Petit ly LLC Ly clivés Cellules lymphomateuses
proly Morphologie: Grains de café TrichoL Ombre de Gumprecht
FAB (1989) LLC typique: Petits lymphocytes matures (>90%), chromatine mottée, <10% proly Nombreuses ombres de Gumprecht au frottis
LLC atypique Atypie: Contingent de cellules: LLC/PL: prolymphocytaires [10%-55%] LLC mixtes plasmocytoides et/ou clivées> 15% LLC B polymorphe (petits ly + grandes cellules
Méthodes: 2- Immunophénotypage Suspension cellulaire: sang total ou mo filtrée. LW: lyse + lavages IFD 2 et 3 couleurs Incubation Lavage Analyse Au cytomètre
Panel ACM Molécules de différenciation Cellules B Cellules T Cellules NK CD19, CD20, CD24, CD22, CD7, CD5, CD2, CD4, CD8 CD16, CD56, CD57 Récepteur à l`ag Ig de mb (μ, δ,γ,λ,k), CD79b Marqueurs de CD5, CD10, sous populations FMC-7 CD3, TCR αβ, YCRγδ. Marqueurs CD23, CD25, DR, CD25 d`activation
Cytométrie en flux Quantitativement: % de cellules positives Situation 1: Population homogène (LLC typique) population hétérogène: proportion de cellules pathologiques est importante, bien individualisée /pop totale. Situation 2: Pop cellules anormales n`est pas majoritaire (HCL, certains lymphomes ) Marquage est faible (nbre de sites antigéniques faible): le % sous estime la pop de cellules exprimant ce marqueur!
Qualitativement: Analyse des intensités de fluorescence pour chaque marqueur. faible: <10 2 moyen: 10 2-10 3 fort:>10 3 Résultats doivent être considérés dans le contexte : De la morphologie cellulaire Proportion de cellules pathologiques dans l`échantillon Intensités d`expression de chaque marqueur Interprétation: les résultats trouvés avec l`ensemble des marqueurs du panel (positifs et négatifs).
3 questions: lymphocytose y Q1: Processus s réactionnel ou prolifération clonale? Q2: Si prolifération clonale, lignée B ou T? Q3: Peut on faire un diagnostic précis dans ce cas? Q1 Q2
Q3 Démarche diagnostique clone B/CD5+ CD23 + Fort CD23 ou faible CD20 faible IgS faible CD20 moyen /F IgS moyenne/ F CD20 Fort IgS Fort CD10 CD10 CD10 FMC7 -/+ FMC7 +/- FMC7 +++ cyto LLC B (4,5) LLC mixte (3,4) MCL
Démarche diagnostique clone B/CD5- CD10 + CD10 - CD20 + Fort IgS Forte CD23 -/+ CD20 Fort IgS Forte FMC7 +Fort Cytologie LF (0,1) LPL, HCL, SLVL
1 point 1 point 1 point 1 point CD79b 1 point LLC B (score 5)
Résultats
Résultats (Cyto + I/Phénotype) Diagnostic Nombre (%) SLPC B LLC (18 LLC mixtes) 310/401 (77,3) 401/404 (99,2%) SLPC T 3/404 (0,8%) Leucémie prolymphocytaire B 4/401 (1) Leucémie à tricholeucocytes 7/401 (1,7) Lymphome splénique à lymphocytes villeux 2/401 (0,5) Phases leucémiques de lymphomes: Lymphome du manteau 48/401 (12) Lymphome folliculaire 16/401 (4) Lymphome lymphoplasmocytaire (W) 8/401 (2) SLPC B inclassables 6/401 (1,5) Syndrome de sezary. 1 Leucémie à grands lymphocytes à grains (LGL) 2
Cyto / phéno Pathologie Cyto I/Phénotype LLC typique 292 292 LLC B LLC atypique 28 18 LLC B 10 LF LF 6 (noyau en grains de café) 6 MCL 46 LNH? (cellules lymateuses) 46 MCL 2 LA? (blastes!) 2 MCL blastoide variant LPL 4 (>55% Proly) 4 LPL B HCL, SLVL 9 cas Ly «chevelus» 7 HCL 2 SLVL LLP (pic monoclonal) 8 (Ly/plasmo) 8 LGL 2 grands ly à grains 2 LGL T Sezary 1 (noyau cérébriforme) 1 T CD4+
Résultats score de Matutes Score 45 4,5 3 2 1 0 LLC N=292 LLC mixte LPL B N= 4 LF N= 16 MCL N= 48 HCL N= 7 SLVL N= 2 LLP N= 8 N= 18 271 4 0 0 0 0 0 0 (92,8%) (22,2%) 21 14 0 0 2 0 0 0 (7,2%) (77,8%) (4%) 0 0 2 4 24 0 0 1 (50%) (25%) (50%) 0 0 2 10 22 1 0 1 (50%) (62,5%) (46%) 0 0 0 2 0 6 2 6 (12,5%) SLPC Inclassables: 1 score 2, 4 score 0
LLC vs MCL LLC avec CD23 faible (score 3). CD5 CD20
LLC mixtes: Score 3: CD22 fort! FMC7 +
I/phénotype (IgS, CD38) LLC vs lymphomes leucémisés. IgS LLC. (N=310) MCL (n=48) LF (n=16) Nombre (%) Nombre (%) Nombre (%) Chaînes μ 56 (18%) 1 (2%) 10 (62,5%) Chaînes μ + δ 254 (82%) 47 (98%) 3 (18,75%) Chaînes γ 0 0 3 (18,75%) Chaînes k 204 (66%) 9 (18 %) 10 (62,5%) Chaînes λ 106 (34%) 39 (81%) 6 (37,5%) CD38 LLC (n=111) 42 (37,8%)
Examen morphologique: Discussion Première approche: critères cytologiques (villosités lymphocytaires, proly, noyaux cérébriforme, Centrocyte,ombres de Gumprecht, cellules lymphomateuses clivées ) Orientent le diagnostic (LPL, ) le choix des AC monoclonaux (CD11c, CD103 et CD 25) Insuffisant dans les phases leucémiques de lymphomes (MCL, LF) Indispensable dans les LLC atypiques (10LF/28 LLC mixtes.) Nécessite de l`immunophénotypage pour mieux Nécessite de l immunophénotypage pour mieux caractériser certaines entités (LF, MCL)
Conclusion Dc des SLPC Multidisciplinaire: clinique Cytologie Immunologie Histologie cytog+bio-mol