Utilisation des cellules dendritiques pour l analyse de l impact de nano particules sur le système immunitaire. Christian Villiers, Rachel Couderc, Heidi Freitas et Patrice Marche. INSERM U823, IAPC Institut Albert Bonniot GRENOBLE Christian.villiers@ujf-grenoble.fr 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 1
Schéma d apprêtement des antigènes CMH-II 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 2
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Le système immunitaire est le gardien de l organisme - Les cellules dendritiques constituent un lien entre l immunité innée et l immunité acquise : Elles Endocytent les structures étrangères Protéolysent les protéines en motifs antigèniques Présentent les antigènes aux lymphocytes T Produisent des médiateurs moléculaires de l inflammation Peuvent orienter la réponse immunitaire pour favoriser une réponse effective ou la tolérance. Un dysfonctionnement peut conduire à une inflammation chronique ou à une réponse de type auto-immune. 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 4
Culture des cellules dendritiques - Culture en deux étapes: 1) Du jour 0 à 10 pour la production de cellules immatures 2) Du jour 10 à 12pour la production de cellules matures Progeniteur : CFU-GM/DC Précurseurs DC immature DC activés IL-6 d0 à d6 FLT3-L d6 à d13 FLT3-L FLT3-L FLT3-L GM-CSF GM-CSF IL-6 GM-CSF TNFα Anti-CD40 CD11c + MHC-II - CD11c + MHC-II int LPS CD11c + MHC-II hi 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 5
Activation des cellules dendritiques Modification de la localisation des molécules de classe II après leur activation 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 6
Activation Migrent des l organisme Produisent -des radicaux oxygénés 1 - des cytokines 3 Endocytent Présentent les antigènes Changent de phénotype 2 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 7
1 Suivi des cellules dendritiques dans l organisme DDAO = 7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one) En collaboration avec P. Rizzo et M. Berger (CEA-LETI, Grenoble) 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 8
1 Injection des cellules dendritiques chargées en sondes fluorescentes avec ou sans activation Jour 0 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 9
1 Analyse du trafic in vivo des cellules dendritiques fluorescentes Injection des cellules non activées injection 24 heures 48 heures Injection de cellules activées injection 24 heures 48 heures 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 10
1 Localisation des cellules dendritiques Ganglion lymphatique Observation par microscope à fluorescence visible Fluorescence Cellules dendritiques 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 11
2 J12 of culture, 24h activation Membrane proteins expressed by DC Immature DC Mature DC 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 12
3 Effet d un stress sur les sécrétions des cellules dendritiques IL12 IL1 beta 1800,00 300,00 1600,00 1400,00 1200,00 250,00 200,00 1000,00 800,00 150,00 600,00 400,00 200,00 100,00 50,00 0,00 unstimilated LPS LPS+antiCD40 0,00 unstimilated LPS LPS+antiCD40 TNF Contrôle Avec stress 1000,00 900,00 800,00 700,00 600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 14/02/2008 unstimilated GRD OR-NANO LYON LPS LPS+antiCD40 13
Ressources biologiques Cellules Dendritiques Fonctions Endocytose Phénotype Radicaux oxygènès Cytokines Présentation Antigène Tests Microscopie confocale Purification compartiments Analyse par FACS Réduction Cytochrome C Chimioluminescence Luminol Fluorescence amplex red Sécrétion par ELISA et FACS ARNm par RT-PCR MLR Apprêtement antigène Activation lymphocyte Migration Trafic cellulaire «In vivo» 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 14
Cellules dendritiques et nano-particules d or 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 15
Mort des cellules dendritiques et particules d or Toxic effect of gold nanoparticules AuS01-01-C02 % of dead cells 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 24H 48H 72H Untreated DC 0.66mM NP 0.46mM NP 0.26mM NP 0.13mM NP 0.066mM NP 0.033mM NP 0.0066mM NP 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 16
Activation cellules dendritiques et particules d or DC activation in presence of gold nanoparticles AuSO1-O3 pe rc e nta ge of a c tiv a te d c e lls 100 80 60 40 20 0 24H 48H 72H Untreated DC 0.0016mM 0.008mM 0.016mM 0032mM 0.064mM 0.11mM 0.16mM Gold NP concentration 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 17
Internalisation des particules d or 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 18
Analyse de la localisation cellulaire des nano particules d or par imagerie confocale 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 19
NANO-HYBRIDES WITH RARE HEARTH OXYDE (2005-2008). Co-ordination P. PERRIAT 5 partners P. PERRIAT : INSA Lyon S. ROUX : Univ. Lyon C. BILLOTEY : ANIMAGE, Univ. Lyon L. CEDRIC : NanoH (Start up) C. VILLIERS : INSERM U548 Grenoble ANR-05-NANO-037-01: NANO-HYBRIDES WITH RARE HEARTH OXYDES : NEW CONTRASTING AGENT FOR COMBINATION OF DIAGNOSTIC AND THERAPY A5- Validation of the efficiency of the nanoparticules as contrast agent in vitro C6- Toxicity tests D1- Internalization of the nanoparticules in dendritic cells for cellular therapy in tumoral pathology Aim of the program is to evaluate the capacity of nanoparticules made of gadolinium oxide to be used as contrast agent. 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 20
Cellular Interaction and Toxicology with Engineered Nanoparticles (2006-2009). Co-ordination R Korenstein Israel Uni of Mainz (C.J. Kirkpatrick) Uni of Muenster (Golla-Schindler) BASF AG (E Leibold) TP21 Gmbh (P Zalud) INSERM Lyon (G Baverel) INSERM Grenoble (P Marche) JRC Ispra (F Rossi) U499, G Baverel U823, P Marche Colorobbia (G Baldi) Uni Tel Aviv (R Korenstein) FP6-2004-NMP-TI-4 : «Nanotechnologies and nanosciences, knowledge-based multifunctional materials and new production processes and devices» 3.4.1.5 : Applications in the areas such as health and medical systems, chemistry, optics, food and the environment 3.4.1.5-2 : Interaction of engineered nanoparticles with the environment and the living world Aim of the program is to evaluate the effects on Health of NanoParticles, used in Medicine, and to provide standardized assays to evaluate them. 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 21
MERCI pour votre attention Inserm U823 Rachel Couderc Heidi Freitas Patrice Marche LETI CEA Philippe Rizzo Michel Berger Programme CellNanoTox Coordinateurs Rafi Korenstein ANR NANOGADO Coordinateur Pascal Perriat 14/02/2008 GRD OR-NANO LYON 22