Les biomarqueurs en 2011 : reflet de la physiopathologie de la thrombose au cours du cancer Christophe Dubois, UMR911, Marseille
D après Bick, N Engl J Med, 2003
Vésicules de taille variable (0,1-1!m) Formées par bourgeonnement cellulaire Surface riche en phospholipides chargés négativement (Annexine V +) Portent des marqueurs antigéniques de la cellule dont elles sont issues (Jimenez et al. 2003) Expression de facteur tissulaire (FT) à leur surface (Langer et al. 2008) Plaquettes agrégées, cellules endothéliales activées, leucocytes activés (Kim et al. 2004) (Ghosh et al. 2008)
Hron et al. Tromb Haemost, 2007 n=20 n=20 La concentration en microparticules circulantes porteuses de FT est 2 fois plus importante chez des patients atteints de cancer du côlon comparés à des sujets contrôles sains.
Tilley et al. Tromb Res, 2008 n=23 n=20 L activité FT est 2,5 fois plus importante dans des échantillons plasmatiques riches en MPs de patients cancéreux comparés à des sujets sains
Clin Cancer Res 2009;15(22) November 15, 2009
1- Détection des MPs par FACS 2- Stabilité des échantillons 3- Durée de vie des MPs in vivo
1-0,2 um, Annexine V + Avec FACS de dernière génération, calibration, entretien spécial Détectable < 0,2 um ou Annexine V (+/-) Indétectable
- En fonction du protocole de collection des échantillons - Vitesse de préparation des échantillons - Congélation des échantillons Variation des résultats - Vitesse de traitement des échantillons Apoptose, activation/agrégation des plaquettes, destruction des membranes
Willekens et al., Blood, 2005 Thomas GM et al., JEM, 2009 % de microparticules en circulation 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Temps après injection des MPs (min) 10
Origine des MPs TF+ circulantes associées au cancer?
Dvorak et al. Sciences, 1981 Line-10 (Hépatocarcinome)! 16 000 Les surnageants de cellules cancéreuses sont composés de vésicules pro-coagulantes
Souris C57BL/6J Cellules cancéreuses de souris ou PBS-/- - Panc02 (pancréas) C57BL/6J - LLC1 (poumons) 5 semaines Thomas GM et al., JEM, 2009
* P<0.05 Origine des microparticules Annexine V + Plaquettes (CD41 + ) Cellules endothéliales (CD31 + CD41 - ) Souris WT (n=8) (!10 6.L -1 plasma) MUC-1+ 117 CA19.9+ 0 Cancer pancréatique (n=8) (!10 6.L -1 plasma) 8951 9383 * 2294 3096 * 135 275 * 1089 * 264 * Cancer pulmonaire (n=7) (!10 6.L -1 plasma) 10018 * 3024 * 164 * 1492 * 127 * Thomas GM et al., JEM, 2009
1- Les cellules cancéreuses produisent «naturellement» des MPs 2- Ces MPs sont détectées circulantes dans un modèle murin
Lignées cellulaires cancéreuses testées : Cancer du sein : Sum 159, Sum 149, MCF7 Cancer du Pancréas: SOJ-6, MiaPaca-2, Panc1, BxPc3, CAPAN-2, Panc02 Cancer du Poumon: LLC-1 A partir de 200 000 cellules cancéreuses : 0,016 0,014 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 Concentration en MPs/cellule P2 SUM 159 P2 SUM 149 A ce jour toutes les cellules cancéreuses testées forment des MPs «NATURELLLEMENT»
17 Tumeur -GFP Panc02-GFP 2!m La tumeur libère des vésicules de taille correspondant à celle des microparticules dans la circulation sanguine
Concentration de FT actif (pmol / mm!) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 SOJ-6 Panc02 LLC1 Les cellules et les MPs cancéreuses expriment du FT actif à leur surface L activité FT par unité de surface est 100 fois dense sur les MPs
0 200 400 600 800 1000 1200 0 Time (s) 50 +Tirofiban +GPRP 100 +MPs +2%PPP + GPRP + Tirofiban Aggregation (%) 150 Les microparticules cancéreuses induisent en présence de plasma : 1) L activation des plaquettes : interaction fibrinogène " IIb # 3 activé 2) La formation de fibrine
Souris C57BL/6J Cellules cancéreuses de souris ou PBS-/- - Panc02 (pancréas) C57BL/6J - LLC1 (poumons) 5 semaines Mesure du temps de saignement Cinétique de formation des thrombi Crémaster Blessure induite au rayon laser Thomas GM. et al JEM, 2009 Temps de saignement (s) 250 200 150 100 50 0 mediane=150 WT n=13 mediane=70 mediane=78 Cancer Panc02 n=11 ** P<0.01 ** ** Cancer LLC1 n=6 20
Souris WT Souris Cancer
Microparticules cancéreuses Cellules cancéreuses Avant injection Avant blessure 2 min après blessure 8 min après blessure Microparticules cancéreuses Thomas GM. et al JEM, 2009
T= 30 sec T= 50 sec T= 80 sec T= 130 sec T= 180 sec WT mice WT mice Panc02 cells WT mice Panc02 cells transfected control WT mice Panc02 cells shut down TF Mezouar S. et al in preparation
! Une tumeur produit «!naturellement!» un nombre important (par rapport aux plaquettes) de microparticules! Dans des modèles murins la thrombose associée au cancer est due principalement au FT porté par les microparticules d origine cancéreuses
Utiliser les MPs d origine cancéreuses en tant que biomarqueurs du cancer et de la thrombose associée au cancer
Concentration en MPs circulantes 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 ANNEXIN + TOTALE * * Contrôle ADK CHIMIO PC N = 7 pour chaque groupe- Médianes * P < 0,01
%&'()*+,$ -%$!"#$
N = 7 pour chaque groupe- Médianes Concentration en MPs circulantes 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 ANNEXIN+ High * * Contrôle ADK CHIMIO PC Concentration en MPs circulantes 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 ANNEXIN + Medium * * Contrôle ADK CHIMIO PC * P < 0,01
N = 7 pour chaque groupe- Médianes CA199 Total CA199 Annexine V+ Concentration en microparticules (nombre/ul) 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 Contrôle ADK PC Concentration en microparticules 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Contrôle ADK PC
N = 7 pour chaque groupe Ceoncentration en microparticules (nombre/ul de sang) 50000 40000 30000 20000 10000 0 MUC-1 total Contrôle ADK PC Ceoncentration en microparticules (nombre/ul de sang) 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Annexine V + MUC 1 Contrôle ADK PC
N = 7 pour chaque groupe- Médianes Concentration en MPs (nombre / ul de sang) 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 * * Contrôle ADK CHIMIO PC 0 ANNEXIN + Antigen 1 TOTALE ANNEXIN + High Antigen 1 ANNEXIN + Medium Antigen 1 * P < 0,01
Les MPs d origine cancéreuses pourraient constituer un bon biomarqueur Comment les détecter/différencier des autres MPs Attention aux maladies inflammatoires
Laurence Dubois Corinne Frère Christophe Dubois Cécile Franceschi Céline Tiffon Rénaté Bonier Roxane Darbousset ANR JCJC «MiniRev» ARC n 1038 Sébastien Germain Christophe.dubois@univmed.fr Soraya Mezouar