Objectifs : 2007 : Evaluation des extracteurs QiaSymphony (Qiagen) et EasyMag (BioMérieux) pour l extraction de l ADN du cytomégalovirus humain à partir du sang total de la salive et du LCR. (CNR Limoges) La quantification du génome du cytomégalovirus (CMV) par PCR en temps réel est largement utilisée pour la surveillance de l infection et de son traitement chez les personnes immunodéprimées. Le sang total représente un prélèvement de choix en raison de la simplicité du traitement préanalytique et du stockage. Le rendement d extraction peut cependant varier selon la méthode utilisée. L automatisation de l étape d extraction améliore la standardisation mais doit être évaluée. Par ailleurs, la salive est, comme nous l avons démontré, un prélèvement accessible et utile pour les enquêtes épidémiologiques. La encore, l extraction automatisée permet de gérer ungrand nombre d échantillons en temps limité, mais aucune méthode actuelle n a été évaluée. Enfin, le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un prélèvement de choix pour le diagnostic des encéphalites et autres atteintes neurologiques à cytomégalovirus. Les techniques de PCR en temps réel permettent d obtenir uen bonne sensibilité pour la détection du virus, Cependant, l extraction automatisée, qui utilise le plus souvent un volume de 200uL n a pas été évaluée dans cette indication Nous avons donc évalué plusieurs extracteurs automatisés pour l extraction de l ADN du CMV dans le sang total, la salive et le LCR. Extraction automatisée sur sang total Méthode : Nous avons testé deux extractions automatisées sur particules de silice magnétiques à partir d une gamme (dilution en sang total d un prélèvement titrant à 10 e 8 copies/ml) et de prélèvements cliniques sur sang total testés en antigénémie. Le QiaSymphony (Qiagen) propose une automatisation complète, du tube primaire ou de décantation au stockage des ADNs élués. L Easy Mag (BioMérieux) propose une automatisation de la lyse à l élution. Les extractions automatisées ont été comparées à l extraction Qiagen DNAblood (Qiagen) manuelle utilisée en routine au laboratoire avec la même prise d essai (200 L). L élution, selon recommandations a été effectuée respectivement dans 200, 110 et 200uL. L efficacité et la reproductibilité de l extraction d ADN du CMV ont été testées avec une PCR quantitative amplifiant un fragment du gène UL83 par une méthode Taqman (Mengelle et al., J Med. Virol., 2003) utilisée en routine au laboratoire sur un Light Cycler 1.0 (Roche Diagnostic) et un Rotorgene (Corbett). Résultats : Sur la gamme (10 e 6 à 10 copies/ml) les trois extractions donnent des résultats similaires. Les différences entre méthodes automatisées et méthode manuelle n excédant pas 0,5 log. Les points 10 et 10 e 2 ne sont pas détectés. La reproductibilité (testée sur les points 10 e 4 et 10 e 6) est excellente quel que soit l amplificateur utilisé et
CV observée en log copies/ml CVobservée en log copies/ml les différences entre deux méthodes constamment inférieures à 0,5log. Sur 11 prélèvements cliniques de charge virale faible : 6/6 sont correctement quantifiés en QiaSymphony, et 3/5 en Easy Mag. Les négatifs ne sont pas détectés. Comparaison sur gamme en sang total : 6,50E+00 6,00E+00 5,50E+00 5,00E+00 4,50E+00 4,00E+00 3,50E+00 3,00E+00 2,50E+00 2,00E+00 1,50E+00 1,00E+00 5,00E-01 0,00E+00 Comparaison des techniques de PCR et d'extraction pour les points 10e4 et 10e6 copies/ml Extraction Qiagen manuelle + Light Cycler cmv 20/10/09 0 1 2 3 4 5 6 7 CV attendue en log copies/ml Extraction Qiagen manuelle + RotorGene cmv 21/10/08 Extraction Qiagen manuelle + Light Cycler cmv Necker 28/10/08 Extraction Qiagen manuelle + LC cmv 28/10/08 Extraction Qiagen manuelle + LC cmv 27/10/2008 Extraction Qiagen manuelle + LC cmv Necker 27/10/2008 Extraction Qiagen Symphony + LC CMV 28/11/2008 + Light Cycler 1(copies/ml) comparaison sur gamme CMV en sang total 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 CV attendue en logcopies/ml + LightCycler 1 Extraction Qiagen + LightCycler 1 + Rotorgene Extraction Qiagen + Rotorgene Extraction QIASymphony + LC CMV 27/11/2008 (copies/ml) qiasymphonybis Comparaison sur échantillons cliniques faiblement positifs : Technique de référence extraction Qiagen DNA Blood manuelle,
1 er essai Extraction manuelle Qiagen + LightCycler 1 + LightCycler 1 + LightCycler 1 + Rotorgene + Rotorgene (copies/ml) (copies/ml) (copies/ml) (copies/ml) (copies/ml) 080015645 0 1730 1421 63 1207 080022819 625 502 0 115 0 080018059 835 0 0 0 220 080025272 1472 296 0 815 0 080025486 2597 1260 1290 4572 4539 080023025 1 832 000 1 755 000 1 228 000 771 700 322 100 080025308 0 0 0 0 0 080025344 0 0 0 0 0 2 ème essai Extraction Manuelle Qiagen QIASymphony + Light Cycler 1 (copies/ml) + Light Cycler1 (copies/ml) 080058226 5480 3280 080036859 3180 10600 080028572 1580 982 080027687 2010 3730 080026399 873 12200 080015090 0 0 080014453 764 23800 Conclusion : Ces résultats montrent les bonnes performances de ces deux automates sur sang total, quelle que soit la charge virale, et particulièrement autour du seuil thérapeutique de 10 e 4copies/mL. Les résultats de cette évaluation ont été présentés au Workshop CMV (Alain et al., Boston, mai 2009).
Extraction automatisée sur salive Méthode :Nous avons comparé l extraction par trois méthodes automatisées : BioRobot EZ1 (Qiagen) que nous avions validé dans un premier travail sur les salives par rapport à une extraction manuelle (Grosjean et al., J clin. Virol., 2009), extracteur Qiasymphony (Qiagen) et extracteur Easy mag (BioMérieux). Dix échantillons de salive de charge virale moyenne (préalablement quantifiés par notre technique maison) ont été réextraits par les trois méthodes et amplifiés en technique maison. Résultats : Numéro EZ1 Log EZ1 EasyMag Log EasyMag Qia Symphony Log QiaSymphony 1 0,25 0,00 non fait non fait 3,50E-01 0,00 2 0 0,00 non fait non fait 0 0 3 0 0,00 non fait non fait 2,80E+00 0,45 4 4,77E+01 1,68 2,88E+02 2,46 1,523 0,18 5 6,64E+01 1,82 3,04E+02 2,48 non fait non fait 6 7,17E+01 1,86 1,05E+03 3,02 non fait non fait 7 7,40E+01 1,87 0 0 1,70E-01 0,00 8 104,3 2,02 non fait non fait 5,38E+01 1,73 9 2,33E+02 2,37 5,12E+02 2,71 2,95E+02 2,47 10 2,66E+02 2,42 non fait 3,16E+02 2,50 11 4,71E+02 2,67 1,58E+03 3,20 non fait non fait 12 4,73E+02 2,67 1,99E+02 2,30 6,62E+02 2,82 13 6,25E+02 2,80 3,08E+02 2,49 1,76E+03 3,24 14 2,49E+03 3,40 non fait 2,29E+03 3,36 15 1,07E+04 4,03 4,49E+04 4,65 non fait non fait 16 3,03E+06 6,48 non fait 6,96E+06 6,84 17 4,23E+06 6,63 5,36E+05 5,73 1,41E+07 7,15
Log copies/ml de salive Log copies/ml EZ1 Conclusion : La corrélation de chaque méthode avec l extraction de référence sur EZ1 est bonne (R 2 > 0,8), meilleure avec le Qiasymphony, ce qui est attendu puisque les deux extracteurs Qiagen utilisent le même procédé. Il faut remarquer la plus grande sensibilité de l extraction Easy Mag sur la salive, pour les échantillons entre 100 et 1000 copies.
Liquide céphalo-rachidien Méthode : Les extractions ont été comparées à partir d une gamme de CMV obtenue en diluant des virions de souche AD169 dans du LCR. La gamme a été testée en PCR hybridation (technique qualitative), et quantifiée par la technique maison, après extraction manuelle à l aide du kit Qiagen DNA mini kit, utilisée en routine au laboratoire pour les LCRs. Résultats :La principale difficulté rencontrée avec l extracteur Qiasymphony est la difficulté d adapter les volumes de prise d essai : en dessous de 200uL, une dilution est nécessaire pour atteindre le volume requis, alors que la prise d essai manuelle et celle de l Easy Mag peuvent être plus faibles. Les résultats ci-dessous ont été obtenus avec une prise d essai de 200uL. Virions CMV 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00 diluant Méthode qualitative (PCR-hybridation) Manuelle pos pos pos neg neg NF NF neg Easy Mag pos pos pos pos neg NF NF neg Qiasymphony pos pos neg neg neg Méthode quantitative (PCr quantitative "maison") Qiasymphony 1 178 400 113 250 15 933 678 neg neg neg neg Qiagen manuelle 2 956 200 576 600 35 250 8058 826 neg neg neg Conclusion : L extracteur Easy Mag montre des résultats équivalents en PCR qualitative à ceux de l extraction manuelle prise en référence. Il peut donc «a priori» être recommandé dans cette application. Soulignons toutefois qu il n a pas été testé avec la PCR quantitative «maison». L extracteur Qiasymphony montre des performances inférieures à celles de l extraction manuelle en PCR qualitative et en PCR quantitative. En l état actuel, cet extracteur ne peut donc pas être recommandé pour extraire les LCRs.