Détection des dangers microbiologiques par les méthodes normalisées ou alternatives validées, intérêts et limites Bertrand LOMBARD Coordinateur Appui scientifique et technique AFSSA-LERQAP, Maisons-Alfort tél: 01 49 77 26 96, mél: b.lombard@afssa.fr
Plan Méthodes normalisées Méthodes alternatives validées Méthodes normalisées et validées dans le contexte de l accréditation des laboratoires et de la réglementation européenne 2
MÉTHODES NORMALISÉES 3
Pourquoi normaliser? Analyse microbiologique des aliments Très variable Analyte vivant Nature biologique des réactifs (milieux de culture, souches, AC) Résultats intimement liés au principe de la méthode Microbiologie conventionnelle (croissance bactérienne) En particulier pour le dénombrement bactérien Pathogènes alimentaires = danger direct pour les consommateurs Besoin de définir des méthodes de référence Normalisation = voie privilégiée pour définir ces méthodes de référence (consensus) 4
Présentation (1) Normalisation des méthodes d analyse microbiologique des aliments o Principalement aux niveaux européen et international ISO/TC 34/SC 9 «Aliments Microbiologie» CEN/TC 275/WG 6 «Analyse des aliments, méthodes horizontales Microbiologie» Sous responsabilité française o + quelques normes de routine NF ( pathogènes) o Suivi français: Commission AFNOR V08B «Microbiologie des aliments» 5
Présentation (2) Méthodes normalisées en microbiologie des aliments Domaine d application étendu = méthodes «horizontales» Tous aliments (homme, animaux) Environnement de transformation/stockage, production primaire + quelques méthodes sectorielles Détection/dénombrement Bactéries surtout + levures/moisissures, virus, parasites Principe analytique Microbiologie conventionnelle dans la plupart des cas large applicabilité Introduction de technologies nouvelles si microbiologie conventionnelle non satisfaisante Titre du diaporama 6
Normes générales Titre du diaporama BPL microbiologie des aliments (NF EN ISO 7218) AQ/performance milieux de culture (NF EN ISO TS 11133-1&2) Préparation échantillons/suspensionmère/dilutions (NF EN ISO 6887-1 à 5) Validation de méthodes (NF EN ISO 16140) Incertitude de mesure en microbiologie quantitative (XP ISO/TS 19036) Essais d aptitude/microbiologie des aliments (projet EN ISO/TS 22117) 7
Méthodes de référence pour les pathogènes (1) Titre du diaporama Bactéries Salmonella détection (NF EN ISO 6579) Dénombrement/NPP miniaturisée (projet NF EN ISO/TS 13305) Sérotypage (projet) L. monocytogenes: détection & dénombrement (NF EN ISO 11290-1&2) Staphylocoques coagulase positive Détection & dénombrement TCC+NPP (NF EN ISO 6888-1,2&3) + entérotoxines (projet) Bacillus cereus: détection & dénombrement TCC+NPP (NF EN ISO 7932, NF EN ISO 21871) + toxines (projet) Clostridium perfringens: dénombrement TCC (NF EN ISO 7937) 8
Méthodes de référence pour les pathogènes (2) Bactéries (suite) Campylobacter: détection & dénombrement TCC (NF EN ISO 10272-1,2&3) Escherichia coli O157: détection (NF EN ISO 16654) STEC: détection (projet NF EN ISO 13136) Vibrio: détection (NF EN ISO/TS 21872-1&2) Yersinia enterocolitica: détection (NF EN ISO 10273) Shigella: détection (NF EN ISO 21567) E. sakazakii (Cronobacter spp.): détection (XP ISO/TS 22964: lait&pl) 9
Méthodes de référence pour les pathogènes (3) Virus dans les aliments et eaux embouteillées Virus hépatite A et norovirus (projet) Parasites (futur) Trichinella Cryptosporidium Giardia 10
MÉTHODES ALTERNATIVES VALIDÉES 11
Pourquoi des méthodes alternatives validées? Méthodes de référence La plupart de microbiologie conventionnelle Méthodes lourdes (main d œuvre) et longues ( bactérien) Processus de normalisation au niveau international = long (3/4 ans) Développement méthodes alternatives Faisant appel aux nouvelles technologies Brevetées/commerciales (kits) Plus rapides, moins lourdes (automatisées) Mais les utilisateurs ont besoin de garanties sur la performance de ces méthodes Systèmes de validation/certification par tierce partie Processus moins long que normalisation (1-2 ans) En France: Validation AFNOR des méthodes alternatives Titre du diaporama 12
Validation AFNOR des méthodes alternatives: présentation (1) AFNOR Certification 1.Etude expérimentale des performances de la méthode Référentiel technique = Norme NF EN ISO 16140 2 protocoles: méthodes qualitatives et quantitatives 2 phases Etude intra-laboratoire (laboratoire expert) Essai inter-laboratoires Evaluation des résultats: Bureau Technique (composition paritaire) 13
Validation AFNOR des méthodes alternatives: présentation (2) 2. Exigences assurance qualité pour fabricant de méthode Base: ISO 9001 Audits réguliers du fabricants et de la ligne de production de la méthode Performance de la méthode = même niveau dans le temps Certification: 4 ans renouvelables Liste méthode validées: www.afnor-validation.org 14
Validation AFNOR des méthodes alternatives: liste méthodes validées (1) Dénombrement staphylocoques 3 milieux de culture Détection Salmonella = 25 tests validés 4 milieux de culture 15 tests immuno-enzymatiques 1 test hybridation moléculaire 5 tests PCR Détection E. coli O157 = 6 tests validés 1 milieu de culture 2 tests immuno-enzymatiques 3 tests PCR 15
Validation AFNOR des méthodes alternatives: liste méthodes validées (2) Détection Listeria spp. = 10 tests validés 2 milieux de culture 6 tests immuno-enzymatiques 2 tests PCR L. monocytogenes = 22 tests validés Détection 9 milieux de culture 4 tests immuno-enzymatiques 2 tests hybridation moléculaire 2 tests PCR Dénombrement 5 milieux de culture 16
MÉTHODES NORMALISÉES ET VALIDÉES DANS LE CONTEXTE DE L ACCRÉDITATION DES LABORATOIRES ET DE LA RÉGLEMENTATION EUROPÉENNE 17
Accréditation des laboratoires Norme NF EN ISO 17025 (2005) Article 5.4.5 sur validation des méthodes Valider méthodes non normalisées Inclut méthodes alternatives NF EN ISO 16140 = outil de choix en microbiologie des aliments Si kits validés AFNOR, pas besoin de validation par le laboratoire utilisateur 18
Contexte réglementaire européen (1) Règlement CE 2073/2005 modifié: critères microbiologiques des aliments Application du règlement 852/2004 (art. 4&12) Applicable Formellement aux exploitants de la chaîne alimentaire Indirectement/en partie aux contrôles officiels Pour chaque critère microbiologique (Annexe I) 1 méthode de référence = Norme EN ISO en général 19
Contexte réglementaire européen (2) Utilisation méthodes alternatives = possible Disposition générale (art. 5) Conditions Méthode validée/méthode de référence en Annexe I Si commerciale, certifiée par tierce partie Selon EN ISO 16140 (ou tout autre protocole similaire internationalement reconnu) Si kit validé AFNOR OK pour autocontrôles (et contrôles officiels en France) vérifier conformité des produits aux critères microbiologiques du règlement 2073/2005 20
CONCLUSION 21
Pourquoi utiliser les méthodes de référence normalisées ou les kits validés? Réduire les sources de variation Faciliter la reconnaissance des résultats/contrôles Relation client/fournisseur Autocontrôles/reconnaissance par DDSV (PH) Contrôles officiels Commerce international Base fiable pour Accréditation des laboratoires Critères microbiologiques réglementaires (règlement 2073/2005) 22