8 PATHOLOGIES LIEES A LA GLYCOLYSE

Suite de la glycolyse 8 PATHOLOGIES LIEES A LA GLYCOLYSE 8.1 DEFICIENCES ENZYMATIQUES HERITEES Parmi les patients ayant des défauts au niveau des enzymes glycolytiques, 95% présentent une déficience en pyruvate kinase et 4% en phosphoglucoisomérase. Quelques déficiences conjointes de la pyruvate kinase et de l hexokinase sont exprimées essentiellement dans les érythrocytes. D autres montrent une plus large distribution : la triose isomérase, par exemple, montre des déficiences dans les érythrocytes, les leucocytes, les cellules musculaires et les cellules du système nerveux central. La plupart des patients présentant des déficiences en ces enzymes glycolytiques sont sujets à des anémies hémolytiques qui varient avec la sévérité de la déficience. La déficience en pyruvate kinase dans les globules rouges est très grave. En effet ces derniers ne possèdent pas de mitochondries et dépendent exclusivement de la glycolyse pour leur approvisionnement en ATP. Ceux des patients, présentant une déficience en pyruvate kinase, en contiennent seulement 5 à 25 %. Il s installe alors un mauvais fonctionnement de la glycolyse et une production d ATP, insuffisante pour le fonctionnement, l entretien et le maintien de leur structure membranaire. Dans ces conditions la membrane se déforme et les globules rouges sont prématurément phagocytés par les cellules du système réticulo-endothélial, notamment les macrophages de la rate, ce qui est à l origine de l anémie hémolytique. L activité de la lactase -95% chez l adulte par rapport au nourrisson. De nombreux adultes sont intolérants au lait (au lactose) parce qu ils sont déficients en lactase (problèmes gastro-intestinaux avec production de méthane (CH4) et d hydrogène (H2)). Galactosémie classique : déficit en galactose 1-phosphate uridyl transférase (taux élevé de galactose sanguin, retard de développement chez les enfants (y compris mental, langage), vomissement après ingestion de lait ; hépatomégalie, jaunisse, cirrhose fréquentes ; insuffisance ovarienne ; cataracte qui est une opacification du cristallin par transformation via aldose reductase (consommation d 1 NADPH, H+) du galactose en galacticol osmotiquement actif et l eau diffuse dans le cristallin (symptôme des populations agées consommant du lait). 8.2 ACIDOSE LACTIQUE GLYCOLYSE ANAEROBIE : SOURCE DE LA PRODUCTION D ATP DE SURVIE. L augmentation du lactate dans le plasma, appelée acidose lactique ou lactacidémie, peut survenir à la suite d'accident circulatoire occasionné par un infarctus du myocarde, une hémorragie incontrôlée ou une embolie pulmonaire. L affaiblissement de l approvisionnement des tissus en oxygène perturbe la phosphorylation oxydative et la production de l ATP. Pour survivre les cellules se tournent vers la glycolyse anaérobie et la faible quantité d ATP générée par cette voie peut être suffisante pour ralentir les dégâts en attendant le rétablissement de la circulation sanguine. Dans certaines situations, la teneur en lactate sanguin fournit un moyen rapide, simple et précoce d évaluation de la dette en oxygène. Elle permet d avoir une idée de la sévérité du choc et de suivre la guérison du malade. 1

9 - REGULATION DE LA GLYCOLYSE La glycolyse fournit à la fois de l'atp, essentiel pour couvrir les besoins énergétiques des organismes anaérobies, et des précurseurs biosynthétiques. La vitesse de la glycolyse s'établit de manière à satisfaire ces deux besoins. Le processus est donc régulé. Dans les voies métaboliques les réactions irréversibles sont souvent les lieux de contrôle (lieux de régulation). Les trois sites de régulation se situent au niveau des 3 enzymes allostériques catalysant les réactions irréversibles de la glycolyse à savoir: la phosphofructokinase (étape 3), l'hexokinase (étape 1) et la pyruvate kinase (étape 10). 9.1 REGULATION ALLOSTERIQUE Enzymes allostériques (sites de régulation distincts et sites actifs multiples ) et la courbe de la vitesse de réaction en fonction de la concentration du substrat est sigmoïde indiquant une coopérativité entre les sites actifs. La régulation de la glycolyse est conditionnée par l état énergétique de la cellule. Les principaux signaux qui vont déclencher le phénomène sont : le rapport ATP/AMP, le taux de citrate et le niveau de fructose 2,6-bisphosphate fabriqué par le foie, voir figure. 9.1.1 - PHOPHOFRUCTOKINASE (PFK) La phosphofructokinase (PFK), enzyme allostérique, est l élément de contrôle le plus important de la glycolyse, est inhibé par des taux élevé d ATP et de citrate (formé dans le cycle de l acide citrique qui tourne alors au ralenti) et activé par l AMP et le fructose 2,6-bisphosphate (qui signale dans le foie que le glucose est abondant). Ainsi PFK est actif lorsque de l énergie ou des précurseurs de biosynthèse sont requis. 9.1.2 - HEXOKINASE L'inhibition de la phosphofructokinase entraîne, en amont par voie de conséquence, l'élévation de la teneur en glucose 6. L héxokinase est inhibé par le glucose-6-phosphate qui s accumule lorsque la phosphofructokinase est inhibé. 9.1.3 PYRUVATE KINASE La pyruvate kinase est le troisième enzyme allostérique de la glycolyse. Elle est inhibée par l ATP (et l alanine) mais fortement activé par le fructose 1,6-bis. La pyruvate kinase est donc au maximum de son activité lorsque la charge énergétique est faible et que les intermédiaires de la glycolyse s accumulent. (Fig page 14) 9.2 REGULATION HORMONALE Dans cette régulation, il faut considérer le cas du foie dont le rôle fondamental est de maintenir le taux du glucose sanguin via la régulation réciproque de la glycolyse et de la néoglucogenèse (détaillé au chapitre suivant) mais pour l instant : Cette régulation réciproque est assurée par le taux de fructose-2,6-bis (F-2,6-bis) régulé par la phosphofructokinase-2 dont l'activité sera différente selon son état de phosphorylation. Par l'action du glucagon (hormone hyperglycémiante), PFK2 sera phosphorylée et catalysera la réaction F 2,6 bis-p + H2O -> F6P + Pi. Ainsi la concentration de F 2,6 bis-p diminuera et la glycolyse sera ralentie. Par l'action de l'insuline (hormone hypoglycémiante) PFK2 sera déphosphorylée et 2

catalysera la réaction F6P + ATP -> F 2,6 bis-p + ADP. Ainsi la concentration de F 2,6 bis-p augmentera et la glycolyse sera accélérée. La consommation d un aliment riche en glucides ou l injection d insuline augmente également la teneur du foie en glucokinase, phosphofructokinase et pyruvate kinase via l activation de la transcription des gènes correspondants. L augmentation de ces enzymes active la glycolyse. Inversement la transcription de ces gènes est abaissée et les concentrations des enzymes décroissent lorsque le plasma sanguin est riche en glucagon (jeûne ou diabète). Glycolyse et cancer Chapitre 5 (suite) La Gluconéogenèse (ou Néoglucogénèse) Synthèse du glucose à partir de sources non glucidiques (lactate, acides aminés, glycérol) 1 - INTRODUCTION Le cerveau, les globules rouges, le rein, le cristallin, la cornée de l'œil, et le muscle en contraction ont besoin d'un approvisionnement continu en glucose. Seul le foie est capable d'assurer cette fonction par mobilisation du glycogène et par néoglucogenèse. Les réserves du foie sous forme de glycogène sont évaluées à 190 g. Les besoins journaliers en glucose sont estimés à 120 g pour le cerveau, 40 g pour le reste de l'organisme. Dans les fluides, circulent 20 g de glucose à l'état dissous. On en déduit que les réserves en glucose hépatique couvrent les besoins d'un jour en l'absence d'alimentation glucidique. La néoglucogenèse est activée dans le cas du jeûne (>12 heures sans repas) et dans le diabète. La majeure partie du glucose néoformé (90 %) est synthétisée dans le foie et les 10 % restants dans les reins pour la demande métabolique du cerveau et du muscle (squelettique et cardiaque). Le glucose est synthétisé par la voie de la gluconéogénèse, à partir de précurseurs (glycérol issu de l'hydrolyse des triglycérides dans les cellules adipeuses, lactate, aminoacides). 3

En cas d'exercice physique pendant lequel le glucose musculaire est dégradé en lactate (parallèlement à la production d énergie), 1a néoglucogenèse hépatique est stimulée; pour retransformer le lactate, issu de la glycolyse musculaire, en pyruvate puis en glucose (cycle de Cori). La néoglucogenèse est souvent définie comme la transformation du pyruvate en glucose par les enzymes de la glycolyse qui interviennent en sens inverse (réactions réversibles). Cependant, la néoglucogenèse n'est pas l'inverse de la glycolyse. Et ne peut pas l être parce que : 1. L équilibre énergétique de la glycolyse est très en faveur du pyruvate ( G = -84 kj mol-1) 2. Trois réactions de la glycolyse sont irréversibles et se situent au niveau des sites de contrôle : cose 6 + ADP ( G = -33 kj mol-1) Hexokinase 3 Fructose 6- + ATP Fructose-1,6-bis + ADP ( G = -22 kj mol-1) Phosphofructokinase 10 Phosphoénolpyruvate + ADP Pyruvate + A TP ( G = -17 kj mol-1) Pyruvate kinase17 Les 3 réactions irréversibles sont remplacées par d'autres réactions à équilibre thermodynamique plus favorable, catalysées par des enzymes spécifiques de la néoglucogenèse. Dans la Gluconéogenèse : Pour contourner ces 3 difficultés, la cellule fait appel à d'autres réactions thermodynamiquement plus favorables avec la coopération des mitochondries. 1. Le phosphoénolpyruvate est formé à partir du pyruvate par l intermédiaire de l oxaloacétate grâce à la pyruvate carboxylase (mitochondrie) et la phosphoénolpyruvate carboxykinase (cytoplasme) 2. Le fructose 6-est formé à partir du Fructose-1,6-bis par hydrolyse de l ester-phosphate au niveau du carbone 1. Ceci est catalysé par la fructose 1, 6-biphosphatase (cytoplasme). 3. Le glucose 6 est hydrolysé par la glucose 6-phosphatase (membrane du RE) en glucose. 2 - ETAPES ENZYMATIQUES 2.1 TRANSFORMATION DU PYRUVATE EN PHOSPHOENOLPYRUVATE Le pyruvate, exporté dans la mitochondrie, est d'abord carboxylé par la pyruvate carboxylase avec consommation d un ATP (cf régénération du NAD+ via devenir du pyruvate). La pyruvate carboxylase se rencontre dans les mitochondries du foie et des reins mais pas dans celles des muscles. Pyruvate + CO2 + ATP + H2O oxaloacétate + ADP + Pi + 2H+ L'oxaloacétate formé est décarboxylé et phosphorylé dans le cytoplasme par la phosphoénolpyruvate carboxykinase avce consommation d un GTP pour donner le phosphoénolpyruvate. La somme de ces réactions est donc : CO2 4

Pyruvate + ATP + G olpyruvate + ADP + GDP +Pi + 2H+ En fait, la carboxylation du pyruvate s effectue en trois étapes dans la mitochondrie : HCO3- -PO32- + ADP Biotine-pyruvate carboxylase + HOCO2-PO32- CO2-biotine-enzyme + Pi CO2-biotine- - pyruvate carboxylase + oxaloacétate L enzyme, la pyruvate carboxylase, possède un domaine de capture de l ATP en N-terminal et un domaine de liaison à la biotine (vitamine transporteur de CO2 activé) en C-terminal. Le domaine de fixation de l ATP active le HCO3- (forme de CO2 en solution aqueuse grâce à l anhydrase carbonique) en carboxyphosphate (HOCO2-PO32-) et transfère le CO2 au domaine de liaison à la biotine (carboxybiotine-enzyme, CO2 très activé G= -20 kj mol-1). Cette réaction dépend également de l acetyl-coa qui se fixe à l enzyme (régulation allostérique non représenté ici, cf cycle de l acide citrique). Le CO2 est ensuite transféré au pyruvate. (Figure p.18) La biotine est un coenzyme groupement prosthétique formé de 2 hétérocycles accolés dont l un contient 2 atomes d azote et l autre un atome de soufre qui est réuni à l'apoenzyme par une liaison covalente amide (entre -COOH de la chaîne latérale de la biotine et -NH2 d une lysine de l'apoenzyme) à un résidu lysine de la pyruvate carboxylase. (Partie à compiler avec le chapitre 4). L oxaloacétate quitte ensuite la mitochondrie et retourne le cytoplasme par une navette malateaspartate (voir phosphoprylation oxydative transport d électrons du NADH,H+) avant d être converti en phosphoénolpyruvate. En fait, l oxaloacétate est réduit en malate par une malate déshydrogenase mitochondriale ayant fixé du NADH, H+. Le malate est ensuite transporté de la mitochondrie dans le cytosol, puis réoxydé en oxaloacétate par une une malate déshydrogenase cytoplasmique ayant fixé du NAD+. Le NADH produit dans le cytoplasme est ensuite réutilisé dans la gluconéogénèse. Enfin, l oxaloacétate est simultanément décarboxylé et phosphorylé (grâce au GTP) par la phosphoénolpyruvate carboxykinase pour produire du phosphoénolpyruvate, le CO2 est éliminé. (Fig p.18) Pourquoi carboxyler décarboxyler? L addition directe d un groupe phosphoryle au pyruvate (réaction inverse de la glycolyse) serait très défavorable ( G = +31 kj mol-1). En effet : Phosphoénolpyruvate + ADP Pyruvate +ATP ( G = -17 kj mol-1) Pyruvatekinase (glycolyse) Carboxyler décarboxyler le pyruvate dans la gluconéogenèse aboutit à G = +0,8 kj mol-1 beaucoup plus favorable. (Rq : ce motif métabolique est retrouvé dans le cycle de l acide citrique, la synthèse des acides gras ) 2.2 - TRANSFORMATION DU PHOSPHOENOLPYRUVATE EN FRUCTOSE 1-6 BIS La séquence des 6 réactions inverse de la glycolyse qui vont du PEP au glucose est cytosolique. 5

1) - Enolase 2) glycérate 2- - Phosphoglycérate mutase 3) Glycérate 3- -Bisphosphoglycérate + ADP PhosphoGlycérate kinase 4) 1,3-Bisphosphoglycérate + NADH,H+ glycéraldéhyde 3-+ Pi + NAD+glycéraldéhyde3- deshydrogénase 5) glycéraldéhyde 3-6) glycéraldéhyde 3- -1,6-bis Aldolase Le bilan global de cette séquence de 6 réactions est le suivant: 2 PEP + 2 H2O + 2 ATP + 2 NADH,H+ Fructose-1,6-bis + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ 2.3 - TRANSFORMATION DU FRUCTOSE 1-6 BISPHOSPHATE EN GLUCOSE Une séquence de 3 réactions, dont une réversible, conduit au glucose 2.3.1 - DEPHOSPHORYLATION DU FRUCTOSE-1,6-BIS EN FRUCTOSE 6- Dans la glycolyse, la réaction qui transforme le fructose 6-phosphate en fructose 1-6 bis est catalysée par la phosphofructokinase (PFK) et irréversible. Dans la gluconéogenèse, la réaction inverse qui enlève un groupement phosphate est catalysée par la fructose-1,6 bisphosphatase (FBP), enzyme allostérique clé et site de régulation principal. Fructose-1,6- - + Pi 2.3.2 - ISOMERISATION DU FRUCTOSE 6- EN GLUCOSE 6- La réaction la phosphogluco-isomérase est réversible: Fructose 6- glucose 6-Dans la plupart des tissus, la gluconéogenèse se termine là!! Pourquoi? 1) le glucose 6- ne peut pas être transporté hors de la cellule & 2) il peut être métabolisé en glycogène. 2.3.3 - DEPHOSPHORYLATION DU GLUCOSE 6- EN GLUCOSE (DANS LE FOIE) Le départ du groupement phosphate du glucose 6- est effectué par une hydrolase fortement régulé dans les tissus: la glucose 6-phosphatase, dont l'importance est fondamentale dans le maintien de la glycémie. On la trouve que dans le foie et dans les reins qui ont le «devoir métabolique» de maintenir l homéostasie du glucose sanguin. Le glucose 6- est transporté du cytosol dans la lumière du réticulum endoplasmique ou il est hydrolysé par la glucose 6-phosphatase membranaire. glucose 6-6

7

BILAN ENERGETIQUE : un exemple typique de couplage de réactions dans le métabolisme. se + 4ADP + 2 GDP + 6Pi + 2 NAD++ 2H+. Sur le plan énergétique la synthèse du glucose consomme 4 ATP + 2 GTP soit l'équivalent de 6 liaisons phosphates riches en énergie (2 seulement sont produites dans une réaction de glycolyse!) Total de -38 kj mol-1mais +84 kj mol-1 pour un cycle strictement inverse à la glycolyse : 4 liaisons phosphates riches en énergie représentent le coût pour modifier un processus thermodynamiquement défavorable (l inverse de la glycolyse) en un processus favorable (la gluconéogenèse). 3 - REGULATION RECIPROQUE DE LA GLUCONEOGENESE ET DE LA GLYCOLYSE Ces deux voies métaboliques se déroulent dans le cytosol. Pas de barrière thermodynamique à une activité simultanée. La plupart des métabolites intermédiaires leur sont communs. Des conflits peuventapparaître au niveau de leur utilisation. En effet les deux processus ne répondent pas aux mêmes objectifs : la glycolyse est engagée dans la production de l'énergie et la néoglucogenèse dans sa conservation. La régulation réciproque des 2 processus s'impose de manière à les ajuster en fonction de l'état énergétique et des besoins cellulaires ou des tissus. La glycolyse prédomine si l énergie est requise & quand il y a un surplus d énergie, la gluconéogenèseprend le dessus. Dans ces conditions, les deux voies sont régulées de telle sorte que l'une est inhibée lorsque l'autre est active et vice versa. Comme nous l'avons vu, le principal signal qui règle cette régulation est le rapport ATP/AMP. Trois types de régulation réciproque gluconéogenèse-glycolyse : (1) allostérique (2) concentration sanguine de glucose (3) hormones & transcription de gènes. 3.1 - Régulation allostérique DE LA GLUCONEOGENESE ET DE LA GLYCOLYSE fait intervenir deux couples d'enzymes: Phosphofructokinase & Fructose 1,6-bisphosphatase (PFK & FBP) et Pyruvate kinase & Pyruvate carboxylase (PK & PC). Lorsque le rapport ATP/AMP est très faible, il indique que la cellule a besoin de fabriquer de l'atp. La glycolyse et la phosphorylation oxydative doivent alors fonctionner activement pour satisfaire les besoins en ATP. En revanche si ce rapport est élevé les besoins en ATP et en précurseurs biosynthétiques sont satisfaits. La glycolyse ralentit et l'excès du pyruvate est retransformé en glucose. PHOSPHOFRUCTOKINASE & FRUCTOSE 1,6 BISPHOSPHATASE (PFK & FBP) Le niveau élevé d'amp active la phosphofructokinase de la glycolyse et inhibe la fructose-1,6- bisphosphatase de la néoglucogenèse. Inversement lorsque les concentrations en ATP et en citrate sont très élevées, la glycolyse ralentit. Ce ralentissement est assuré par l'inhibition de la phosphofructokinase par l'excès d'atp et de citrate. Parallèlement la fructose-1,6-bisphosphatase est activée et la néoglucogenèse est stimulée. Ces enzymes sont considérées comme les sites principaux 8

de contrôle de ces deux voies. Un effecteur positif de PFK devient simultanément un effecteur négatif de FBP et vice versa. Ainsi se trouve réalisée une régulation coordonnée des deux voies par le même métabolite. PYRUVATE KINASE & PYRUVATE CARBOXYLASE (PK & PC) La pyruvate kinase et la pyruvate carboxylase constituent le deuxième couple d'enzymes réciproquement régulées, affectant la glycolyse et la néoglucogenèse. Ces deux enzymes sont mitochondriales. En cas de besoin en ATP, le fructose-1,6-bisphosphate stimule la pyruvate kinasepour produire du pyruvate indispensable à la formation de l'acétyl-coa. Par contre, la pyruvate carboxylase est activé par l'acétyl-coa, qui comme le citrate, indique que le cycle de l acide citrique produit de l énergie et des intermédiaires pour les biosynthèses. Rq1: de haut niveau de citrate (cycle acide citrique) indique une situation riche en énergie. Rq2 : fructose-2,6-bis (F-2,6-bis) est abondante quand la glycolyse est très active avec un taux de fructose F-6 élevé. La F-2,6-bis exerce alors un rétrocontrôle positif sur la PFK. 3.2 - Régulation par la CONCENTRATION SANGUINE DE GLUCOSE Un rôle fondamental du foie est de maintenir le taux du glucose sanguin. La régulation réciproque de la glycolyse et de la néoglucogenèse est assurée par le taux de fructose-2,6-bis (F-2,6-bis qui est abondant quand il y a énormément de glucose et donc de fructose F-6 avec une glycolyse très active). Dans ces conditions & dans le foie, le fructose 6-phophate est phosphorylé par la phosphofructokinase 2 (pfk2). 9

Le fructose-2,6-bisphosphate est donc synthétisé par la phosphofructokinase 2 (PFK2) et déphosphorylé en fructose 6-phosphate par la fructose 2,6-bisphosphatase 2 (FBP2). Ces deux activités sont portées par une seule chaîne polypeptidique de 55 kda = l enzyme bi-fonctionnel PFK2-FBPase2. L'équilibre entre les deux activités (et par conséquent le taux cellulaire de F-2,6-bis) est assuré par l hormone glucagon. La transduction se fait par l'intermédiaire de l'ampc comme second messager et par l'intermédiaire de la protéine kinase A qui phosphoryle un résidu sérine de l enzyme bi-fonctionnel PFK2-FBPase2. 3.3 Régulation hormonale (INSULINE ET GLUCAGON) via la transcription de genes La consommation d un aliment riche en glucides (augmente le taux d insuline) ou l injection d insuline augmente la teneur du foie en phosphofructokinase, en pyruvate kinase et de l enzyme bifonctionnel PFK2-FBPase2 via l activation de la transcription des gènes correspondants. L augmentation de ces enzymes active la glycolyse. Inversement la transcription de ces gènes est abaissée et les concentrations des enzymes décroissent lorsque le plasma sanguin est riche en glucagon comme dans le jeûne (la voie de la gluconéogenèse est alors stimulée). De plus, le glucagon stimule la transcription de 2 enzymes clés de la néoglucogenèse : la phosphoénolpyruvate carboxykinase & fructose 1, 6-biphosphatase. Rq1 : La régulation via la transcription de gènes est plus lente que la régulation allostérique par les enzymes. Rq2 : Elle est élégante, ex : le promoteur du gène de la phosphoénolpyruvate carboxykinase possède les séquences de réponse à l insuline & au glucagon ( mais aussi au camp, Glucocorticoïdes, T3, T4 dans 500 pb). 10