Questions de cours Corrigé Examen première session 2007-2008 Question 1 (Correcteur Serge Hardy, temps conseillé 30 min). Les différentes classes d'arn matures présents dans une cellule eucaryote. Exposer à l'aide de schémas légendés leur synthèse, leurs caractéristiques et leurs fonctions respectives. Chez les eucaryotes, il existe deux grandes classes d'arn : les ARN codants et les ARN non codants. Les ARN codants correspondent aux ARNm. Ceux-ci, comme leur nom l'indique, comporte un message qui dirigera la synthèse d'une chaîne peptidique au cours du processus de la traduction. Les ARN non codants comportent les ARNr, ARNt, ARNsn et ARNsno. Ces ARN peuvent avoir des fonctions structurales, catalytique et régulatrices (0,25 pt). Les ARNm (0,25 pt) Ces ARN sont transcrits par l'arn polymérase II (0,25 pt) sous la forme d'un transcrit primaire appelé ARN pré-messager (0,25 pt). Celui-ci subit plusieurs modifications pour donner l'arnm mature fonctionnel : - ajout d'une coiffe à l'extrémité 5' (0,25). Il s'agit de la liaison d'une méthyl 7 guanosine en position inversée par une liaison phosphodiester 5'- 5' (+ 0,25 pt). - élimination des introns et raboutage des exons par le mécanisme d'épissage (0,25). - clivage de l'extrémité 3' au niveau d'un signal spécifique appelé signal poly(a) (0,25 pt) et addition d'à peu près 200 adénosines = queue poly(a) (0,25). L'ARNm mature peut être représenté par le schéma suivant (1 pt pour un schéma complet ou une description complète) : 5' UTR AUG ORF stop 3' UTR AAAAAA L'ARNm comporte une partie portant le message et qui sera donc traduite. Cette partie est appelée ORF ou phase de lecture ouverte. L'ORF débute au niveau d'un codon spécifique appelé codon initiateur (toujours AUG chez les eucaryotes) et fini par un codon stop. En amont et en aval de l'orf sont présentes respectivement les séquences 5' UTR et 3' UTR. La coiffe et la queue poly (A) protègent l'arnm contre l'action d'exoribonucléase et participent à l'initiation de la traduction (0,25 pt). Les ARNt (0,25 pt) Les ARNt sont transcrits par l'arn polymérase III (0,25 pt). Le transcrit primaire doit subir un ensemble de modifications pour donner l'arnt fonctionnel. Une coupure par une endoribonucléase, appelée RNase P, définit l'extrémité 5' (0,25 pt). Une coupure par une endoribonucléase, appelée Rnase Z, définit l'extrémité 3'(0,25 pt). Les nucléotides CCA sont ensuite ajoutés à l'extrémité 3' par une enzyme appelée ARNt nucléotidyl transférase (0,25 pt). Certains des transcrits primaires d'arnt possèdent un intron. Celui-ci est éliminé par un clivage enzymatique des liaisons phosphodiesters suivi d'une ligature par une ARN ligase. (+ 0,25 pt). Des modifications d'un certain nombre de nucléotides à des positions précises sont également observées. - isomérisation de l'uridine en pseudouridine (0,25 pt). - réduction de l'uridine en déhydrouridine (0,25 pt).
- désamination de l'adénine en C6 pour donner une nouvelle base appelée l'hypoxanthine (0,25 pt). Le nucléoside résultant s'appelle l'inosine. (+ 0,5 pt pour le détail de ces modifications) La molécule d'arnt adopte une structure secondaire dite en feuille de trèfle et une structure tertiaire dite en L inversé. La structure en feuille de trèfle peut être représentée par le schéma suivant (1 pt pour un schéma complet ou une description complète). liaison de l'acide aminé interaction par complémentarité de base avec un codon L'ARNt sert d'adaptateur entre l'acide aminé et le codon porté par l'arnm (0,25 pt). Les ARNr (0,25 pt) Ches les eucaryotes les ARNr sont au nombre de quatre : les ARNr 28S, 18S, 5,8S et 5S (0,25 pt). Les ARN 5S sont transcrits par l'arn polymérase III (0,25 pt). Les ARN 28S, 18S, 5,8S sont transcrit par l'arn polymérase I (0,25 pt) dans le nucléole, sous la forme d'un transcrit primaire appelé ARN 45S (0,25 pt). Toujours dans le nucléole, cet ARN 45S va subir des modifications de certains nucléotides pour donner les ARN matures 28S, 18 S et 5,8S. Ces modifications sont guidées par des petits ARN appelés ARNsno (0,25 pt). Les modifications les plus courantes sont l'isomérisation d'uridine en pseudouridine (0,25 pt) et la méthylation de la fonction 2'OH du ribose (0,25 pt). L'ARN 45S subit ensuite un clivage séquentiel décrit dans le schéma ci-dessous pour donner les ARN 28 S, 18S et 5,8 S fonctionnels (0,5 pt pour un schéma complet ou une description complète).
Au fur et mesure de leur maturation les ARNr adoptent des structures secondaires et tertiaires précises. Ils forment ainsi un squelette qui sert de support pour la fixation coopérative des protéines ribosomales ce qui aboutit à la formation des sous unités ribosomales 60S et 40S. La sous-unité 60S est formée des ARNr 28S, 5,8S et 5S associés à 49 protéines (0,25 pt). La sous-unité 40S est formée de l'arn 18S associé à 33 protéines (0,25 pt). En plus de cette fonction structurale les ARNr peuvent également avoir une fonction catalytique au sein du ribosome. L'ARN 28S intervient ainsi dans la catalyse de la liaison peptidique (+ 0,25 pt). Les ARNsn (0,5 pt) Ils sont au nombre de cinq : les ARN U1, U2, U4, U5 et U6. Ces ARN associés à des protéines forment les snrnp U1, U2, U4-U6 et U5. Ces snrnp forment le cœur catalytique du spliceosome machinerie ribonucléprotéique dans laquelle se déroule l'épissage des exons des ARN prémessagers. Les ARNsno (+ 0,25 pt) Ces ARN associés à des protéines forment des snornp. Ils s'associent à l'arn 45S et guident des modifications covalentes de certains nucléotides (isomérisation uridine en pseudouridine et méthylation de la fonction 2'OH du ribose). Question 2 (Correcteur Yves Le Dréan, temps conseillé 30 min). La réplication du chromosome bactérien chez E. coli : Expliquer en détail comment se réalise ce processus (de l initiation à la terminaison, mais sans vous occuper des phénomènes de régulation qui permettent de ne démarrer la réplication qu une fois par cycle). Attacher une attention particulière à ce qui se passe lors de l élongation de la réplication. Utiliser des schémas correctement légendés, en définissant et orientant les molécules présentes. Il fallait développer 25 idées spécifiques. Un quart de point était donné par idée correctement expliquée. Il suffisait donc d en décrire 20 sur les 25 possibles pour avoir le maximum (5/5). Des points ont été retirés (malus) aux étudiants qui ont mis de grosses bêtises dans leur copie (comme confondre la transcription et la réplication, par exemple) 1) Le génome d E. coli comprend un chromosome circulaire et la réplication de l ADN démarre au niveau d une seule origine de réplication qui est appelé oric (il fallait bien préciser que cette origine est unique) 2) oric possède des sites de liaison pour des protéines initiatrices et également des séquences riches en A-T. Il comprend 2 motifs répétés importants pour sa fonction : - un motif de 9 nucléotides répété 4 fois, qui est un site de fixation pour la protéine initiatrice - un motif de 13 nucléotides répété 3 fois qui correspond à la région riche en A-T (plus facile à ouvrir) où l ADN est initialement déroulé pour donner de l ADN simple brin. (il fallait bien préciser les 2 types de séquences ne parler que de la séquence riche en A-T n était pas suffisant car de telles séquences se retrouvent dans d autres endroits du génome, sans pour autant être une origine de réplication) 3) Chez E. coli, la protéine initiatrice pour la réplication s appelle DnaA et elle interagit avec le motif de 9 nt. 4) Plusieurs protéines DnaA (chacune liée à de l ATP - c est ce qui la rend active) se fixe sur l origine de réplication.
5) On a alors formation d un complexe protéique qui va avoir des conséquences sur la structure de l ADN en amont => torsion de l ADN au niveau de la région comprenant les motifs de 13 nt, riche en A-T => début de l ouverture. 6) DnaA recrute des protéines additionnelles sur l ADN simple brin, dont une ADN hélicase (DnaB) + un facteur auxiliaire, DnaC, qui aide au chargement de l hélicase. 7) DnaB va se déplacer le long de l ADN et donc former un œil de réplication en déroulant l ADN 8) On a formation 2 fourches de réplication qui progressent ensuite en direction opposée jusqu à ce qu elles se rencontrent 9) Pour stabiliser les brins d ADN simple brin et prévenir leur réassociation, des protéines de liaison à l ADN simple brin se lient rapidement sur chacun des brins séparés = SSB (Single Strand Binding protein), 10) La réplication nécessite aussi la présence de topoisomérases pour supprimer le vrillage induit par la séparation des brins 11) La réplication de l ADN est «semi-conservative» 12) La région simple brin qui sert de matrice dirige l addition des nucléotides selon la règle de la complémentarité des bases. 13) Le brin d ADN nouvellement synthétisé va s accroître par extension de l amorce à partir de son extrémité 3 => sens de synthèse de l ADN 5 -->3. 14) Une ARN-polymérase spécialisée = Primase, (il fallait donner le nom) sera ensuite recruter. Cette enzyme va synthétiser les amorces nécessaires au démarrage de la synthèse. 15) L amorce est donc composée d ARN (d un peu plus d une dizaine de nucléotides). L ADNpolymérase pouvant ensuite initier la synthèse d ADN à partir de cette amorce. 16) Chez les bactéries, c est l ADN polymérase III qui ensuite vient prendre le relais pour synthétiser l ADN. (il fallait bien préciser le type de l enzyme) 17) Cette enzyme présente la particularité d être hautement processive car elle est maintenue sur l ADN simple brin grâce à des protéines auxiliaires en forme d anneau (= complexe protéique appelé «noeud β», ou sous-unité β). 18) Cette enzyme est très fidèle car elle possède une activité de «relecture». Cette activité est basée sur une activité exonucléase 3 5 (retour en arrière). 19) Lors de la synthèse, seul un brin d ADN peut être synthétisé de manière continue, au fur et à mesure que la fourche de réplication se déplace. Ce brin nouvellement synthétisé est appelé le brin précoce (ou avancé). 20) La synthèse de l autre brin d ADN est plus problématique puisqu elle doit se faire dans le sens opposé à l avancée de la fourche de réplication. Ce brin est synthétisé de manière discontinue et est appelé le brin tardif. 21) Ces fragments transitoires d ADN sur le brin tardif sont appelés les fragments d Okazaki
22) Les amorces d ARN utilisées pour l initiation sont éliminées par la RNase H = enzyme qui dégrade spécifiquement l ARN qui est hybridé avec de l ADN. 23) Les espaces laissés par l élimination des amorces, sont comblés par une autre ADN polymérase : l ADN polymérase I (il fallait également préciser le type de l enzyme) 24) Les fragments d Okazaki sont au final reliés entre eux par l ADN-ligase, qui catalyse la liaison phosphodiester entre 2 nucléotides adjacents. 25) Une zone de terminaison spécifique se trouve sur le chromosome circulaire d E. coli. Cette région est située à l opposé de oric. Elle contient des sites de liaison (= sites ter) pour des protéines qui vont bloquer les hélicases et donc stopper l avancé des fourches de réplication. Exercice (temps conseillé 1 heure). Corrigé exercice Question 1. (2 pts; 0,25 pt par réponse correcte) Promoteur AAAGACCCTGCCCTCCCCCCTCACCTACTCCATTAATGGCTTCTTTGCTTTTCAATGGCCCAGAAGCTACCAAATAAGGGACAGGCTGCCTGCCGCAGCA 100 Boite TATA Site d'initiation de la transcription Exon 1 TTTTATAAAAGAGCTCCCACTGACTCCTCAACTCCAGGCAGCGTATAAATTGACAGCTCAGTCCCCATGGCAGCACCCAGCCAATTCAATCACACAAGAA 200 NcoI CGGCGGATCCAGTACTCCCAGAAGGAGGACAAATATGAAGAGGAAATTAAGGTTCTTACAGATAAACTGCAAGGAGGTGAGCGCATTATTCTACATCGTA 300 Site 5' d'épissage AGCTCGGGCTCAGAGAGCGCGCAAAACGCCACACAAAAAAAAGCATTCTCTTTTTGGCTGCAGTCGGCTTATATGCAGCATCGACGTGCATGCGCATGGC 400 Intron ATATGGATTATCTTTGGGGTTTCTAGATCGGGCGATGGGAAAAATCTGGTGATTGTATATCCAGATGTGCAATATTTATTTATTTTCTAGTTACTTTGTT 500 XbaI ATTTGAAATTTGTACATAAGATGTTCAAGTGCTGGAGAAGTAGCTAAATTTGTCTAATCCATCTTTCCCCTTCTCCTCAGACTAGAAACCGTGCTCGGAA 600 d'épissage Site de branchement Site 3' Exon 2 GAGTTTGCAGAGAGGACAGTATAAAAGTTGGAAAAGTCCATTGATCGATTTACAAGGTAAATAAAACTCACGTCCTACCCTAACACCTTCATTTTTTTTT 700 TTTTGTGTTTCGCGCAGATCTGCAGCGCCGTTGAAC BglII Rgion riche en U et G/U Hexanucléotide Site de clivage Signal de polyadénylation
- Pour l item 1 la réponse : «région intergénique» a été considérée comme fausse car il avait été indiqué en cours que les régions régulatrices non transcrites (donc le promoteur) étaient comprises dans la notion de gène. - Pour l item 3, la réponse INR-box, qui est située au niveau du site +1 a été considérée comme bonne. Question 2 (2 pts) Séquence 5' UTR jonction exon 1/exon 2 5' AGGCAGCGUAUAAAUUGACAGCUCAGUCCCCAUGGCAGCACCCAGCCAAUUCAAUCACACAAGAACGGCGGAUCCAGUACUCCCAGAAGGAGGA CAAAUAUGAAGAGGAAAUUAAGGUUCUUACAGAUAAACUGCAAGGAGACUAGAAACCGUGCUCGGAAGAGUUUGCAGAGAGGACAGUAUAAAAG UUGGAAAAGUCCAUUGAUCGAUUUACAAGGUAAAUAAAACUCACGUCCUACCCUAACAAAAAAAAAA..AAAAAAAAAA 3' Séquence 3' UTR queue poly A ( 200 A) ORF : écrite en caractères rouges - 0,25 pt a été enlevé par item faux ou manquant (/jonction mauvaise, absence queue poly(a), - 1 point si la séquence correcte de l'arnm est donnée mais que celle-ci n'est pas annotée - 0,75 pt si la séquence est correcte, mais non annotée et sans queue poly-a : t - 0,5 pt si la séquence est correcte, mais non annotée et que la jonction des exons n'est pas visible : - 0,5 pt si la séquence de l'arnm correspond uniquement à l'orf correctement épissé :. - 0 pt si la séquence est inversée et s ans annotation - 0,75 pt si la séquence est inversée et que les annotations sont correctes (0,25 pt pour l épissage, 0,25 pt pour les seq UTR et 0,25 pt pour la queue poly-a) Question 3 (1 pt) - 0,25 pt pour le contrôle actine : Bien que la légende de la figure 2 indique que des quantités équivalentes d'arn ont été déposées sur les deux pistes, le Northern blot réalisé avec la sonde actine permet de vérifier qu'il n'y a pas eu de problème durant les différentes étapes expérimentales. Ce contrôle permet de comparer l'intensité des signaux obtenus avec la sonde exon 1 du gène mx2. - 0,25 pt pour un commentaire sur l intensité des signaux : Un signal d'intensité équivalent est observé dans les deux pistes indiquant que l'expression quantitative du gène mx2 n'est pas perturbée chez la souris M1. P - 0,25 pt pour un commentaire sur la taille des ARNm : par contre les ARN ont des tailles différentes. Chez les souris sauvages un ARN d'une taille de 435 nt est observé. Cette taille est en accord avec la structure du gène donnée dans la figure 1. Taille de l'arnm = exon 1 + exon 2 + queue poly(a). Chez les souris M1, un ARN d'une taille de 750 nt est observé. - 0,25 pt pour toute tentative d explication : L'augmentation de la taille de l'arnm mx2 chez les souris M1 pourrait être du à un problème d'initiation ou de terminaison de la transcription ou un problème d'épissage. Pour ce dernier point il a été souvent proposé comme explication la mutation sur un codon stop. Cette réponse est fausse et vaut 0 point. Elle démontre malheureusement une confusion importante entre la transcription et la traduction pour nombre d'entre vous.
Question 4 (1 pt) Souris sauvage 5' GCTAAATTTGTCTAATCCATCTTTCCCCTTCTCC 3' Souris M1 5' GCTAAATTTGTCCCCCCCATCTTTCCCCTTCTCC 3' 0,5 pt par séquence correctement orientée 0,25 pt par séquence si la séquence du brin transcrit et correctement orientée a été donnée. Pour ceux qui ont écris la séquence de l ADN double brin, les points n'ont été donnés que s ils avaient indiqué clairement quel est le brin non-transcrit. Question 5 (1 pt) - 0,25 pt pour la localisation de la mutation. Séquence TAAT remplacée par CCCC - 0,25 pt pour l'identification de cette séquence. Celle-ci correspond au site de branchement et plus précisément le point de branchement responsable de la première réaction de transestérification est muté. - 0,5 pt pour l'explication. La première réaction de trans-estérification du processus d'épissage ne peut donc pas avoir lieu et l'intron compris entre l'exon 1 et l'exon 2 n'est pas excisé. Il s'en suit la formation d'un ARNm qui comprend l'exon 1 l'intron et l'exon 2 d où une taille beaucoup plus importante que chez les souris sauvages. Question 6 (2 pts) Amorce 1 : 5' AGGCAGCGTATAAATTGACA 3' OU 5' CAGGCAGCGTATAAATTGAC 3' (0,5 pt) (TM de cette amorce est égal à (8X4) + (12X2) = 56 C) Amorce 2 : 5' TGTTAGGGTAGGACCACGTG (0,5 pt) (TM de cette amorce est égal à (11X4) + (9X2) = 62 C) Protocole d'amplification : Dans un premier temps on réalise le mélange de réaction en ajoutant dans un tube eppendorf (0,25 pt): 2 µg d'adn génomique un large excès molaire des amorces 1 et 2 les quatre dntp la Taq polymérase S il manque un ingrédient, la PCR ne marche pas, donc 0. On conçoit ensuite les différentes étapes d'un cycle de la PCR (0,75 pt) - une étape de dénaturation à 94 C (pendant 30 sec à 1 min).
- une étape d'hybridation des amorces 1 et 2. Le Tm des amorces peut être calculé d'après la formule Tm = 2(A + T) + 4(G + C). Tm amorce 1 = 56 C, Tm amorce 2 = 62 C. On se place à une température légèrement inférieure au Tm le plus faible soit 51-54 C. - une étape d'extension des amorces à 72 C. Le fragment à amplifier ayant une taille de 550 nt la durée de cette phase sera comprise entre 30 sec et une minute 0,25 pt a été donné par étape correcte, avec notamment une obligation d expliquer le choix de la T de l étape 2 par rapport au Tm des moarces. Si les T et les temps sont donnés sans dire à quoi cela sert, ni justification => 0,25 pt seulement pour le total Ce cycle sera répété n fois pour obtenir 1 µg d'adn (+ 1 point extra barème pour ceux qui ont un bon calcul) Calcul : 1 molécule ADN double brin de 550 pb aura une masse de 550 X 660 = 363000 Da soit 6,02 10-19 g. On veut obtenir 1 µg d'adn soit 10-6 g i.e. 10-6 /6,0210-19 = 1,66 10 12 molécules. La masse du génome haploïde est de 2,5 10 9 X 660 X 1,66 10-24 = 2,7 10-12 g On a au départ 2 µg d'adn génomique soit 0,74 10 6 génomes haploïdes soit 7,4 10 5 x copies du gène xm2. On veut donc avoir une amplification de 1,66 10 12 /7,4 10 5 =.2,24 10 6 On a donc 2 n = 2,24 10 6 soit n = log 2 (2,24 10 6 ) = Ln (2,24 10 6 )/ Ln (2) = 14,62/0,693 = 21 cycles Question 7 (1 pt, 0,25 pt par item correct) Le vecteur PUC possède : - une origine de réplication, notée ori, qui permet sa réplication autonome dans la bactérie. - un site multiple de clonage, noté SMC, avec 6 sites de restriction uniques pour l'insertion d'un fragment d'adn exogène. - un gène de résistance à l'ampicilline, noté ampr, qui permet de sélectionner les bactéries ayant intégré le plasmide. - les promoteurs T7 et T3 en amont et en aval respectivement du SMC qui permettent de transcrire l'adn placé au niveau du SMC. Question 8 (+1,25 pt) Le plasmide C1 non digéré migre sous la forme de deux bandes qui doivent correspondre à de l'adn circulaire super enroulé (forme CC) et de l'adn circulaire relâché (forme OC) (+ 0,25 pt). Le plasmide incubé avec l'enzyme de restriction EcoRV a le même profil de migration que le plasmide non digéré. On peut en déduire qu'il n'y a pas de site EcoRV dans le plasmide recombinant C1. Le fragment PCR avec des extrémités franches a été introduit dans le site EcoRV du plasmide Puc dans une des deux orientations possibles et les sites EcoRV n'ont pas été reformés. (+ 0,25 pt). Il était nécessaire d expliquer pourquoi EcoRV ne coupe pas pour avoir le quart de point
Le plasmide incubé avec l'enzyme de restriction NcoI migre sous la forme d'une seule bande. Le plasmide C1 a donc été linéarisé ce qui nous permet de déduire la présence d'un seul site de restriction Nco1. La taille de cette bande d'adn linéaire est de 3550 nt ce qui est en accord avec la taille théorique attendue (3000 + 550) (+ 0,25 pt) Il était nécessaire d expliquer que la taille observée est en accord le plasmide recombinant pour avoir le quart de point Le plasmide incubé avec l'enzyme de restriction BamH1 migre sous la forme de deux bandes. On peut donc en déduire que le plasmide C1 possède deux sites de restriction. Un site est présent dans le site multiple de clonage du vecteur Puc et le deuxième dans l'exon 1 du gène mx2 (+ 0,25 pt) La taille des fragments produits permet de déduire le sens d'insertion du fragment PCR dans le vecteur Puc (+ 0,25 pt). On peut avoir théoriquement deux plasmides recombinants C1 Le premier où le fragment PCR s'est inséré tel qu'il est présenté dans la figure 1. La digestion par produit alors un fragment de 90 pb et de 3460 pb ½ EcoRI EcoRV (50) 90 pb ½ EcoRV Le deuxième où le fragment PCR s'est inséré en sens inverse La digestion par produit alors un fragment de 550 pb et de 3050 pb ½ EcoRI EcoRV (50) 500 pb ½ EcoRV On peut donc en conclure que le fragment PCR s'est intégré en sens inverse. Question 9 (+ 0,5 pt) Le fragment PCR étant intégré en sens inverse il faut utiliser le promoteur T3 pour transcrire in vitro l'arn pré-messager mx2 (+ 0,25 pt). Il faut au préalable linéariser le plasmide recombinant par une enzyme de restriction en aval du site de restriction EcoRV telle que, KpnI et XbaI. Le mélange réactionnel suivant est ensuite réalisé (+ 0,25 pt): ADN plasmidique C1 linéarisé les quatre rntp la T3 ARN polymérase