Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de Récepteur pour l antigène des lymphocytes B Ontogénèse des lymphocytes B sylvain.dubucquoi@chru lille.fr Plan Récepteur pour l des lymphocytes B : BCR tructure moléculaire Génération du répertoire des Ac Contrôles de qualité du récepteur produit Interactions Ac (paratope épitope) : affinité, avidité, spécificité pdf : sur Moodle ppt : sur le site du Centre de Biologie Pathologie du CHRU de Lille Le BCR : structure moléculaire Domaines variables (CH et CL) Immunoglobuline de membrane : une glycoprotéine composée de 2 chaînes lourdes 2 chaînes légères Identiques 2 à 2 Chaîne légère Chaque chaîne lourde («H» pour «Heavy») est composée de 1 domaine variable (VH) 4 domaines constants (CH) : IgM, IgE ou 3 domaines constants : IgG, IgA, (IgD) VH CH1 VL CL Chaîne légère («L» : «Light») : 1 domaine constant (CL) 1 domaine variable (VL) Chaîne lourde : 5 «isotypes» : IgM, IgD, IgG, IgA, IgE IgG : 4 sous classes : IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA : 2 sous classes : IgA1, IgA2 Chaîne légère 2 isotypes : kappa ( ), lambda ( ) L immunoglobuline peut être sécrétée Chaîne lourde Région «charnière» CH2 CH3 CH4 Domaines constants (CH et CL)
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de Association 2 à 2 des chaînes lourdes Association de chaque chaîne lourde à une chaîne légère ite d interaction avec l = «paratope» (une partie VH et une partie VL) Fragment «Antibody» «Fab» Région charnière = flexibilité ite d interaction avec les partenaires cellulaires ou le complément Fragment «cristallisable» «Fc» Ponts di sulfure ites de glycosylation Monomère Pentamère IgM Pièce jonctionnelle IgG Monomère Dimère IgA «sécrétoire» Pièce jonctionnelle Pièce sécrétoire IgA Monomère Immunoglobuline : «Isotypes», «allotypes», «idiotypes» Parmi les immunoglobulines : des «isotypes» différents : IgM, IgG, IgA, IgE, IgD (chez un même individu) les IgG1 et IgG2, 3, 4 sont également des isotypes différents (par convention, on les appelle «sous classes») Entre des individus différents : des «allotypes» différents On peut distinguer de ponctuelles différences de séquences peptidiques entre 2 IgG1 produites par 2 individus différents (les différences siégent au niveau des fragments Fc) 2 IgG1 produites par 2 LB différents chez un même individu, peuvent ne pas reconnaître le même motif antigénique Leurs séquences peptidiques diffèrent au niveau de la région d interaction de l Ig (paratope) avec l antigène (épitope) Ces séquences sont spécifiques à chacune des immunoglobulines produites par les différents LB Ces séquences qui distinguent deux IgG1 produites par deux LB différents = leur «idiotype» Au sein des idiotypes, il existe des régions variables (d une Ig à l autre) des régions hypervariables (d une Ig à l autre) ite d interactions privilégiées avec l
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de Génération du paratope : séquence peptidique Région variable Région constante équence peptidique linéaire de la chaîne lourde Régions hypervariables = CDR «Complementary Determining Region», CDR1, CDR2, CDR3 «Paratope» tructure tertiaire : (repliement dans l espace) Comment générer une telle diversité de paratopes? 1 immunoglobuline = 1 protéine = 1 gène? 1 immunoglobuline = 1 protéine = une combinaison de gènes! Région variable de la chaîne lourde : assemblage au hasard de 3 segments de gènes V : Variabilité D : Diversité J : Jonction qui s associeront avec le fragment constant Chromosome 14 Région variable de la chaîne légère : assemblage au hasard de 2 segments de gènes V : variabilité J : Jonction (avec le fragment constant) qui s associeront avec la région constante pour coder la chaîne légère «kappa» ( chromosome 2) ou la chaîne légère «lambda» (, chromosome 22) Noter l absence de gène de diversité (D) pour les chaînes légères V 1 V 2 V 3 V 39 V 40 D 1 D 2 D 35 J 1 J Cµ 6 Chromosome 14 40 gènes V 35 gènes D 6 gènes J V C 1 V 2 V 3 V 34 V 35 J 1 J 5 Réarrangement des gènes codant le paratope des immunoglobulines : 35 gènes V ( ) 5 gènes J (33 pour ) Chromosome 2 pour chaîne légère Kappa ( ) Chromosome 22 pour chaîne légère Lambda ( ) V 1 D 2 J 2 Cµ V 2 J 3 C
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de Génération du paratope : séquence nucléotidique (1) Rôle des enzymes «RAG1» et «RAG 2» Chaîne lourde : réarrangement de D et J puis de V avec DJ réarrangé Chaîne légère : réarrangement de V et J (pas de gènes D) Pour préserver le cadre ouvert de lecture, intervention de la «Terminal deoxynucleotidyl Transferase»(Tdt) (enzyme de «raboutage») Introduit ou enlève des nucléotides au hasard Entre D et J et entre V et DJ (chaîne lourde) Entre V et J (chaîne légère) ce qui génère une séquence nucléotidique qui n est pas inscrite dans notre patrimoine génétique Cette séquence nucléotidique est propre à chaque LB (c est à dire différente d un LB à l autre) À ce niveau, la diversité du paratope (encore incomplet) est associée à 1) la recombinaison au hasard des gènes DJ et VDJ = «diversité combinatoire» 2) à l introduction de séquences nucléotidiques non encodées dans le génome = Diversité «N» (ou «jonctionnelle») Région variable Région constante Gène V Gène D Gène J Gène µ (IgM) CDR1 CDR2 Entre les différents gènes V, il existe des régions très variables d un gène à l autre (CDR1 et CDR2) il existe également des régions moins variables d un gène à l autre (en vert) Diversité N (TdT) CDR3 Le CDR3 est composé de séquences nucléotidiques issues de la diversité jonctionnelle (ou diversité «N»)+gène «D» + diversité «N» + gène «J» «Recombinaison somatique» : un phénomène complexe qui peut ne pas aboutir...plusieurs allèles pour un maximum de chances ; Corollaire : notion «d exclusion allélique» LB immature Recombinaison somatique VDJ de la chaîne lourde à partir de l allèle «1» (chromosome 14 maternel, par exemple) Chromosomes maternels (14,2,22) Chromosomes paternels (14,2,22) «Exclusion allélique» (Chrom. 14 paternel) Test Non fonctionnel Mort cellulaire Fonctionnel Recombinaison somatique VDJ (H) à partir de l allèle 2 (chromosome paternel) Recombinaison somatique VJ de la chaîne légère à partir du chromosome paternel (par exemple) d abord Kappa (Chrom. 2) (on commence toujours par ) Non fonctionnel L exclusion allélique empêche la recombinaison somatique des gènes codant la chaîne lourde Fonctionnel (ou légère) au sein du 2 ème allèle si une Exclusion allélique production efficace de la chaîne lourde (ou (kappa maternel légère) a déjà été obtenue à partir de la et lambda paternel et recombinaison des gènes du 1 er allèle maternel) Empêche la formation de LB exprimant plusieurs spécificités d Ac Assemblage H et L Recombinaison somatique VJ (L) à partir du chromosome maternel (kappa) i non fonctionnel : Recombinaison somatique VJ (lambda) à partir du chromosome maternel puis (dernière chance) paternel
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de http://atlasgeneticsoncology.org/educ/polyigfr.html Génération du paratope : séquence nucléotidique (2) La recombinaison somatique des chaînes lourdes et celle des chaînes légères sont indépendantes : Quand elles s associent, elles créent un nouveau motif de reconnaissance À ce stade (final), la diversité du répertoire est liée 1) À la recombinaison somatique de «H» (VDJ) (rôle des RAG) (= «diversité combinatoire») 2) À la diversité N (introduction au hasard de nucléotides) entre D et J et entre V et DJ (rôle de la TdT) 3) À la recombinaison somatique de «L» (VDJ) 4) À la diversité N (introduction au hasard de nucléotides) entre V et J 5) À l association de H et de L (dont les gènes V(D)J se sont recombinés indépendamment) CDR1 CDR2 CDR3 L ensemble de ces mécanismes créent une nouvelle «clé» de reconnaissance Chaîne lourde Chaîne légère CDR1 CDR2 CDR3 Ce qu il faut retenir Au terme de ces premiers éléments, vous devez pouvoir répondre à : Quelle est la structure des immunoglobulines? Que sont les «isotypes», «sous classes», «allotypes» et «idiotypes»? Quelles sont les différentes immunoglobulines (Ig) qu un lymphocyte B (LB) peut produire? Quelles sont les immunoglobulines concernées par le terme «sous classes»? ous quelles formes moléculaires peut on retrouver les IgM, IgG, et IgA? Quels sont les événements moléculaires qui conduisent à la génération de la diversité du répertoire des récepteurs? Quels sont les enzymes qui interviennent dans la production de la séquence nucléotidique du futur BCR? Qu appelle t on «exclusion allélique»? Quels sont les éléments qui conduisent à générer la diversité du répertoire?
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de V 1 V 1 V 2 V 3 J 1 J 2 V 2 V 3 D 1 D 2 J 1 J 2 Cµ V 1 N V 1 NN N Mécanismes de contrôle de la production du BCR Comment tester sa fonctionnalité? Est il capable de reconnaître un? Quels sont les présents dans la moelle osseuse? Beaucoup de hasard dans la génération du BCR Les antigènes du soi (auto antigènes) Pour tester sa fonctionnalité, un LB teste son BCR au contact des du soi Notion de sélections «positive» et «négative» Processus de sélection «positive» et «négative» des LB Évaluation du BCR au contact d du soi élection négative Pas de reconnaissance Faible reconnaissance Forte reconnaissance Pas de signaux de survie délivrés Élimination faible reconnaissance d un antigène du soi = chance de bien reconnaître un étranger ignaux de survie dans la bonne «fenêtre de tir» Trop de signaux de survie délivrés = Danger d autoréactivité élection positive urvie «BCR editing» voire «mort» Non fonctionnel Pas d autoréactivité Autoréactivité Mort LB sort de la moelle osseuse «BCR editing» plus d autoréactivité Il est prêt à reconnaître un étranger (mais il n en a jamais vu ) Mort cellulaire Chaîne légère C VH VL J 5 RAG C LB exprimant déjà un BCR réarrangé (H + L) Réexpression des RAG CH3 CH 4 CH 2 Chaîne lourde RAG Plus rarement Nouveau réarrangement VJ de la chaîne légère (+ rarement H) D 2 J 5 Cµ Expression d un BCR modifié
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de Ce qu il faut retenir Au terme de ces éléments, vous devez pouvoir répondre à : En quoi consiste le contrôle de qualité des BCR nouvellement produits? Vis à vis de quels antigènes les nouveaux BCR sont ils testés Quelles sont les 3 situations que peut rencontrer un LB qui test son nouveau BCR exprimé à la membrane Quelles sont les conséquences pour ce LB selon l affinité du BCR pour l à cette étape Qu est ce que le phénomène de «BCR editing» Interactions Ac Un antigène est une mosaïque d épitopes Épitope 4 Épitope 3 Épitope 2 Réponse monoclonale des Ac tous identiques : paratope, isotype Produits par un seul clone cellulaire Réponse polyclonale des Ac différents par les épitopes qu ils reconnaissent s ils reconnaissent le même épitope, par les affinités différentes qu ils expriment ils peuvent être d isotypes différents (IgG, IgM) ils sont produits par des clones cellulaires différents
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de Réseau Ac Épitope conformationnel Épitope linéaire Épitope conformationnel = natif disparaît si on dénature l Épitope linéaire ( dégradé) persiste si on dénature l Forces d interaction d un Ac avec sa cible : «affinité», «avidité» La somme des interactions non covalentes définit l affinité du paratope Plus un Ac a de l affinité pour sa cible : plus il est «spécifique» La somme des affinités de chaque paratope définit l avidité de l Ac Interactions faibles Forces de van der Waals Liaisons hydrophiles Liaisons hydrophobes Interactions ioniques Pour une même affinité paratopique, une IgM (5 x 2 paratopes) présente une plus forte avidité qu une IgG (2 paratopes)
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de Ac Paratope de forte affinité Ac Paratope d affinité moyenne Ac Paratope non spécifique Ac Paratope d affinité faible Ac Paratope d affinité très faible Ce qu il faut retenir Au terme de ces derniers éléments, vous devez pouvoir répondre à : De quoi se compose un reconnu par un récepteur spécifique de l immunité adaptative Définir une réponse polyclonale Définir une réponse monoclonale Pourquoi la formation de réseaux Ac est elle possible? Qu est ce qu un épitope conformationnel ou natif? Qu est ce qu un épitope séquentiel ou dénaturé? Quelles sont les forces d interaction mises en jeu dans la relation épitope paratope? Pour comprendre : une petite analogie avec le monde du Bowling l Les Ac IgM IgM polyclonales, de faible affinité IgG de bonne affinité Paratope IgG IgM de forte avidité Les Ac sont capables de muter pour encore mieux s adapter à leur cible (on le verra au prochain cours)
Dr ylvain DUBUCQUOI Faculté de Attention Une analogie donne l idée de ce qui se passe, mais est souvent inexacte dans le détail. Trouver les erreurs dans la diapo précédente Pour vous aider : Une IgM est pentamérique : elle exprime 10 paratopes, tous identiques IgG est monomérique et comprend 2 paratopes identiques (ils reconnaissent des épitopes de même structure) Ce sont surtout les paratopes des IgG qui évoluent pour mieux s adapter à leur cible (hypermutations somatiques).