06/11/13 BENARD Mathilde L2 Génétique Médicale Pr.LEVY 14 pages Génétique chromosomique : Structure des chromosomes/caryotype, Principes des études en cytogénétique et Anomalies de nombres et de structures. Plan : A. Introduction B. Structure des chromosomes/caryotype C. Principes des études en cytogénétique I. Techniques de cytogénétique II. Techniques de marquage III. Caryotype normal et haute résolution D. Cytogénétique médicale I. Introduction II. Circonstances de découverte III. Examen clinique IV.Résultats : les anomalies chromosomiques de nombre et de structures Référence utile en génétique : http://collegegenetique.igh.cnrs.fr/sommaire.html A. Introduction La génétique médicale est une discipline née il y a une trentaine année. Avant, toutes les spécialités médicales "faisaient de la génétique", voyaient des malades atteints de maladies génétiques mais parfois sans savoir même que le patient avait une maladie génétique. Le concept de génétique a évolué, et aujourd'hui devrait s'adapter/ se coller à un autre concept : celui de maladie rare. Les maladies rares sont des maladies chroniques, invalidantes. Elles sont à 80 voir à 90% d'origine génétique et concernent en France 3 millions de malades. La génétique et les maladies génétiques sont donc une priorité de santé publique à laquelle on doit s'intéresser aussi bien sur le plan médical, moléculaire ou de la recherche. On dénombre environ 7 à 8 000 maladies rares qui sont extrêmement diverses. La très grande majorité ont une origine génétique (souvent une mutation ponctuelle ou alors une maladie chromosomique). Ce sont des pathologies qui concernent une personne sur 20 de manière directe (implication directe, dans le sens où la maladie ne concerne pas les apparentés, mais que la personne est directement concernée par la maladie génétique). La génétique concerne toutes les disciplines médicales, tous les organes et tous les systèmes ; cela implique beaucoup d'analyses. C'est une discipline transversale qui traite de la prise en charge des malades comme de la recherche fondamentale ou directe. 1/16
B. Structure des chromosomes/ caryotype Lorsque l'on parle d'adn, de chromatine ou de chromosome, c'est la même molécule qui est le support de l'information génétique avec différents niveaux de compaction et d'association. Cytogénétique : étude morphologique du matériel génétique se présentant sous forme de chromosomes. Le mot chromosome vient de khroma (couleur) et soma (élément). C'est une molécule d'adn associée à des protéines qui est le support de l'information génétique. C'est la modalité d'organisation de l'adn dans la cellule en division (mitotique ou méiotique) par la condensation de la chromatine et l'association avec des protéines structurales. Le nombre de chromosomes est caractéristique de chaque espèce. Exemple chez l'homme : 46 chromosomes, les cellules sont diploïdes (à l'exception des gamètes). Le caryotype correspond à l'analyse globale du génome sous la forme de chromosomes condensés à partir de laquelle on peut déterminer leur nombre mais aussi leur structure. C. Principes des études en cytogénétique I. Techniques de cytogénétique Cytogénétique conventionnelle : o Caryotype standard o Caryotype haute résolution (= Caryotype despiralisé) : permet de définir beaucoup plus finement le niveau de chaque région/sousrégion/bande des chromosomes Cytogénétique moléculaire : o Hybridation in situ en fluorescence (FISH) o Caryotype moléculaire (CGH microarrays =ACPA) 2/16
Cytogénétique conventionnelle Attention, il faut toujours une attestation de consultation et de consentement éclairé. Le matériel cellulaire peut être n'importe quel type de cellules : Lymphocytes T (sang) Fibroblastes (peau, gonades) Amniocytes (liquide amniotique) Cellules trophoblastiques (villosités choriales) Autres : tumeurs, moelle osseuse (Permettent de déterminer le diagnostic précis de certaines formes de cancers et d'en définir le pronostic) Le seul stade de la division cellulaire où les chromosomes sont visibles est le stade de la métaphase. La mitose correspond à des cellules en division, elle est spontanée mais on est obligé, lorsque l'on veut faire des analyses chromosomiques ciblées, de bloquer des cellules lors de leurs mitoses pour pouvoir observer leurs chromosomes ; on effectue pour cela des cultures cellulaires. Différentes étapes : 1) Cellules en division spontanée ou culture cellulaire (stérile) Durée variable en fonction du tissu : Lymphocytes : 7296h Fibroblastes : 3 semaines Amniocytes : 10 jours Cellules trophoblastiques : spontanée ou 10 jours 2) Arrêt forcé du cycle cellulaire au stade métaphasique avec utilisation de la colchicine (inhibiteur du cycle, utilisé dans la goutte) 3) Choc hypotonique (qui est une étape importante) Fragilisation et enlèvement des membranes cytoplasmiques et nucléaires Gonflement des cellules, dispersion des chromosomes 4) Fixations successives 5) Recueil ou étalement des chromosomes (température + hygrométrie contrôlée) 6) Coloration Giemsa et marquage chromosomique : dénaturation Complémentarité des différentes techniques 7) Analyse au microscope à contraste de phase II. Techniques de marquage Pour pouvoir déterminer quel est le chromosome que l'on observe, il faut pouvoir les marquer. Tous les chromosomes ont la même composition initiale (ADN+ protéine) et la même couleur. Il faut donc choisir les régions chromosomiques à observer selon leurs richesses en bases chimiques de l'adn (richesse en bases CG ou AT comportement différent). Certains agents chimiques permettent de définir les différentes bandes des chromosomes. 3/16
Principe : Succession de bandes claires et sombres, longitudinales et caractéristiques de chaque paire chromosomique Nombre de bandes variable en fonction de la condensation de la chromatine. Résolution 300550 bandes/lot haploïde de chromosomes. Types (ne pas apprendre) : Bandes G : dénaturation enzymatique (trypsine) + coloration Giemsa (GTG) Bandes R : dénaturation thermique ménagée + coloration Giemsa (RHG) Bandes C : baryum + coloration Giemsa (hétérochromatine constitutive) Autres : coloration à Ag (NORs), bandes T, bandes Q Bras long : q Bras court : p Indice centromérique : permet de déterminer le numéro du chromosome et sa taille :[p/p+q]. Cet indice permet de classer les chromosomes dans différentes catégories, il y a 7 groupes de A à G. Le groupe A contient par exemple les chromosomes 1, 2 et 3 (les plus gros) et le groupe G les chromosomes 21 et 22 (les plus petits) Bandes R (= Rivers) La première technique qui a permi de colorer les chromosomes et de définir des bandes était une technique utilisant la tynacrine. Mais une autre technique mise au point en Europe a permit de mieux voir les extrémités télomériques (régions importantes dans de nombreuses maladies). a. Coloration Giemsa (= coloration standard) C'est un colorant ayant une affinité pour l'adn (observation des chromosomes et de la chromatine). Elle permet uniquement de définir le nombre de chromosomes, donc de détecter des anomalies chromosomiques de nombre et de les classer par leur taille (avec les 7 groupes de chromosomes). 4/16
b. Classification des chromosomes selon leur indice centromérique Une autre manière de déterminer la classification chromosomique (caryotype) est de classer les chromosomes selon leur indice centromérique. Métacentriques : bras court et long de taille identique. Ex : chromosome 1 Sub métacentriques : taille du bras court < taille du bras long. Ex : chromosomes 12 et 8 Acrocentriques : bras court quasi inexistant (région des organisateurs nucléolaires, ne contient que très peu de gènes codant surtout pour les ARNr). Ex : chromosomes 13, 14 et 22. c. Bandes G Digestion enzymatique ménagée + giemsa Région d'adn riches en AT, correspondant à des régions condensées précocement lors du cycle cellulaire, à réplication tardive, pauvres en gènes actifs. 5/16
d. Bandes R : Reverse Band Dénaturation thermique ménage+ giemsa Régions d'adn riches en GC, condensées tardivement au cours du cycle cellulaire, correspondant à des régions à réplication précoce, riches en gènes actifs. Complémentarité des bandes G et R e. Bandes C Coloration de l'hétérochromatine constitutive : Centromère Constriction II (1916) : centromères très larges Yq12 (chromosome Y) Bras courts des chromosomes acrocentiques Bandes riches en séquences d'adn répétés de types satellites (entre 20 et 60 pb, répétées en tandem, avec une composition qui se colorie spécifiquement). Elle permet aussi de faire la différence entre l'euchromatine (constitutive) et l'hétérochromatine (facultative). 6/16
Rappel : Hétérochromatine facultative Portée essentiellement par le 2 ème chromosome X chez la femme (phénomène de biais d'inactivation d'un des 2 chromosomes X, chromosome méthylé, phénomène de compensation de dosage de gènes). Cependant, tout le chromosome n'est pas méthylé, certains gènes sont actifs (correspondent à peu près à ceux présents sur le chromosome Y). f. Coloration NORs Coloration des bras courts des chromosomes acrocentriques (chromosomes 13 à 15 + 21+22). Coloration des organisateurs nucléolaires (NOR) (ADNr) Coloration à l'argent. Pas de détections d'anomalies de moins de 5 millions de bases sur un caryotype quelque soit la technique utilisée et sa résolution. III. Caryotypes normal et haute résolution Caryotype normal : (faite avec la coloration bandes R et G) Classement : Taille décroissante Indice centromérique Données des bandes R ou G (complémentarité des informations) 7/16
Cellule somatique humaine : 46 chromosomes avec 22 paires d'autosomes : 1 à 22 1 paire de gonosome : XX, XY Formule chromosomique : 46, XX ou 46 XY La localisation du chromosome est indiquée par : N du chromosome Bras (p ou q) N région N bande N sous bande Numérotation du centromère au télomère Résolution de l'analyse : Caryotype standard : 300500 bandes/lot haploïde de chromosomes o 1 bande chromosomique : 12.107 pb o Identification de remaniement de 10 Mb Caryotype haute résolution : 6001000 bandes/lot haploïde de chromosomes o 1 sousbande chromosomique : 15.106 pb o Identification de microremaniement de 45 Mb Résolution à 1000 blh = Caryotype à très haute résolution. Lorsque les chromosomes sont déspiralisés, il est plus difficile de les classer. Jamais en première intention, on l'utilise lorsque l'on sait déjà ce que l'on cherche. 8/16
D. Cytogénétique médicale I. Introduction : C'est l'étude des anomalies chromosomiques congénitales qui peuvent être héritées de l'un des parents ou qui surviennent de novo (accident méiotique ou accident postméiotique). Il faut bien faire la différence entre "la maladie ne peut provenir des parents" et "la maladie est héritée". Une maladie après mutation de novo ne provient pas des parents qui sont sains mais elle est héritée dans le sens où elle provient d'un accident méiotique à partir d'une cellule parentale. Ces anomalies concernent 1 nouveauné sur 100. Elles ne sont pas toujours graves mais représentent 8% des décès néonataux et la moitié des fausses couches précoces (du 1er trimestre). Chaque chromosome, quelque soit sa taille, a à priori la même probabilité d'être impliqué dans une anomalie dite de non disjonction (trisomie, monosomie). Pourtant, on n'a jamais observé de trisomie pour le chromosome 1 ou le chromosome 2. Et à l'inverse il y en a beaucoup pour les chromosomes 13, 18 et 21. Si on part du principe qu'en fonction de la taille d'un chromosome, on va avoir plus ou moins de gènes portés par ce chromosome, il est évident qu'un déséquilibre portant sur la totalité des gènes du chromosome 1 va être plus grave qu'une anomalie portant sur des chromosomes tels que le chromosome 21 qui contient beaucoup moins de gènes. Donc même si chaque chromosome a le même risque d'être impliqué dans des anomalies de type non disjonction, les anomalies portant sur les grands chromosomes vont être létales durant l'embryogenèse très précocement alors que les anomalies qui touchent des plus petits chromosomes et donc moins de gènes sont compatibles avec un développement plus ou moins tardif voir avec une survie de l'individu (c'est le cas de certaines trisomies telles que la trisomie 21). II. Circonstance de découverte : Expression phénotypique très variable, une des situation suivantes : Un nouveauné polymalformé Une ambiguïté sexuelle Un retard des acquisitions/ mental inexpliqué Un impubérisme ou une aménorrhée primaire Azoospermie / oligozoospermie / ménopause précoce Un couple avec des avortements à répétition Il faut se souvenir que les malades que l'on observe ne sont que la "partie émergée de l'iceberg" et que beaucoup d'autres ne passent pas les filtres de la "sélection naturelle" et sont à l'origine d'avortements spontanés. III. Examen clinique Interrogatoire : histoire familiale et personnelle + arbre généalogique Description de la dysmorphie faciale et recherche de malformation des extrémités Malformations viscérales? Évaluation des capacités mentales, développement psychomoteur, trouble du comportement Photos du patient (important +++) Autorisation d'analyse et de stockage du matériel génétique du patient. 9/16
IV. Résultats : les anomalies chromosomiques de nombre et de structure e. Les anomalies chromosomiques de nombre La constitution humaine normale : fécondation de deux gamètes haploïdes (23 chromosomes) Zygote diploïde (23+23 = 46 chromosomes). 1) La triploïdie : Trois copies de chaque chromosome (3 x 23 = 69 chromosomes) Môle hydatiforme Avortement spontané Quelques rares cas arrivent à la naissance 2) La tétraploïdie : 4 exemplaires de chaque chromosome (23 x 4 = 92 chromosomes avortement précoce ++) Ce type d'anomalie est du à une division nucléaire sans division cellulaire. 3) L'aneuploïdie : Copie surnuméraire d'un chromosome = Trisomie o Entraîne des avortements précoces sauf pour les trisomies 13, 18 et 21 (sont souvent létales mais pas toujours) qui donnes des syndromes poly malformatifs sévères o La trisomie des chromosomes sexuels : XXX ou XXY (Syndrome de Klinefelter) ou XYY Phénotype atténué Perte d'une copie d'un chromosome = Monosomie o Toujours létale sauf la monosomie X (Syndrome de Turner) 45 X La trisomie 21 n'est pas une maladie rare (1/700). Elle est favorisée par un âge maternel avancé car les gamètes maternels sont un pool correspondant à un ensemble fini (constant) : les ovocytes sont utilisés au fur et à mesure des cycles. Alors que, chez les hommes, les spermatozoïdes sont renouvelés constamment. C'est donc la sénescence des gamètes maternels qui augmente le risque de trisomie 21. Le dépistage prénatal à la recherche d'anomalie chromosomique (surtout pour la T21) est maintenant très courant. De plus en plus de fœtus qui présentent une trisomie 21 font l'objet d'interruption médicale de grossesse (IMG) ce qui fait que la maladie se "raréfie" et tend à devenir une maladie rare par rapport au nombre de personne atteintes. 10/16
La cause d'une aneuploïdie est le plus souvent une non disjonction méiotique touchant les gamètes fécondants. La non disjonction peut se produire au cours de la première ou de la 2ème division méiotique. f. Les anomalies chromosomiques de structure Réarrangement de la structure d'un ou de plusieurs chromosomes. Équilibrées ni perte ni gain de matériel génétique Déséquilibrées entraîne une monosomie partielle et/ou une trisomie partielle o Ces anomalies peuvent être héritées à partir de parents ayant une structure chromosomique équilibrée. o Un individu qui a une anomalie de structure déséquilibrée portant sur une région de grande taille ne pourra pas transmettre son anomalie car la capacité de reproduction est quasi nulle chez ce sujet. 1) Les anomalies touchant un seul chromosome (a) La délétion C'est une perte d'une partie du chromosome Monosomie partielle qui concerne le segment perdu. La conséquence clinique est variable selon la taille de la région perdue et aussi selon l'importance des gènes qui s'y trouvent. Mais retenir que "lorsque c'est visible au caryotype, c'est grave". 11/16
(b) La duplication Un segment chromosomique répété deux fois (en tandem) dans le chromosome trisomie partielle. Le retentissement phénotypique est variable et dépend de la taille de la région dupliquée et de sa richesse en gènes. (c) L'inversion Cassure d'un segment chromosomique suivie de son recollement après une rotation de 180 Le centromère correspond au point rouge. L'inversion paracentrique se fait sur le même ras chromosomique contrairement à l'inversion péricentrique. Remaniement chromosomique équilibré sans retentissement phénotypique direct sur le porteur mais provoque un déséquilibre dans la descendance!!! Ce sont des remaniements équilibrés car il n'y a aucune perte ou gain de matériel. Mais, pour que ces inversions se produisent, il y a forcément 2 cassures dans la molécule d'adn. Ces points de cassure peuvent se trouver dans des régions qui n'ont pas d'impact fonctionnel (donc remaniement chromosomique équilibré) mais dans certains cas le point de cassure peut se trouver à l'intérieur même d'un gène d'importance. Ce gène ne pourra donc pas produire son ARNm et ensuite sa protéine, cela peut générer une maladie génétique. Cela est beaucoup plus compliqué à détecter et à voir. Des remaniements à priori équilibrés peuvent donc être responsables de pathologies géniques. 12/16
(d) Le chromosome en anneau Perte des deux télomères d'un chromosome suivie d'un accolement des deux extrémités donnant un aspect en anneau au chromosome. Il en résulte une monosomie partielle des deux régions télomériques. (e) L'isochromosome Perte de l'un des deux bras du chromosome suivie du dédoublement du deuxième bras. Monosomie du bras perdu + trisomie du bras dédoublé. Létal sauf lorsqu'il touche aux chromosomes sexuels (grâce au phénomène d'inactivation d'un des deux chromosomes X) 2) Les remaniements touchant deux chromosomes (a) La translocation réciproque C'est un échange entre deux segments chromosomiques. Équilibré : ni de gain ni de perte de matériel chromosomique. Sans retentissement phénotypique Provoque un déséquilibre dans la descendance. Mais peuvent être déséquilibrés si les points de cassure sont localisés sur un gène d'intérêt 13/16
(b) La translocation robertsonienne Fusion centrique entre deux chromosomes acrocentriques. Le caryotype devient alors à 45 chromosomes. Cette anomalie est aussi équilibrée même si l'individu n'a que 45 chromosomes (car les bras courts des chromosomes acrocentriques ne contiennent que peu ou pas de gènes), mais peut entraîner un déséquilibre dans la descendance (Dans l'exemple ci dessous, si le chromosome 13 portant le chromosome 14 est celui transmis à la descendance, l'enfant sera trisomique 14). La translocation peut aussi concerner les deux chromosomes d'une même paire (3ème image) (c) Le mosaïcisme Une anomalie chromosomique peut ne toucher qu'une partie des cellules étudiées (phénomène de nondisjonction mitotique à des stades très précoces et non méiotiques). Faible mosaïque : il faut étudier un grand nombre de métaphases pour détecter l'anomalie. Le degré de mosaïcisme peut varier d'un tissu à un autre o Réaliser un caryotype sur d'autres types de cultures cellulaires (fibroblastes cutanés). (d) La disomie uniparentale Il arrive dans certaines situations que la descendance qui normalement hérite d'une copie de chromosome de chacun de ces deux parents hérite de deux copies du chromosome d'un même parent. Cas normal : 14/16
Cas d'une hétérodisomie uniparentale d'origine maternelle ou paternelle : On peut aussi avoir des isodisomies : il va y avoir une duplication (dont l'enfant va hériter) d'un seul des deux chromosomes parentaux à partir d'une même structure initiale. 15/16
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