DISS. no ETH. 22414 Strategies Underlying Bacterial Survival on Surfaces A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by IMA AVALOS VIZCARRA Dipl. Biol. t. o., University of Stuttgart born on 11.05.1983 citizen of Germany and Perú accepted on the recommendation of Prof. Dr. Dr. h. c. Viola Vogel, examiner Prof. Dr. Martin Ackermann, co-examiner Prof. Dr. Bradley Nelson, co-examiner 2015
Summary Most bacteria adhering to surfaces within the human body contribute to healthy body functions, while some bacteria exploit their host for their own purposes, which defines them as pathogens. Natural mechanisms to prevent the survival of these pathogens include specialized host cells that search pathogens, adhere to them, and ingest them for clearance. Engineered strategies against pathogens aim to prevent adhesion of bacteria or their growth by antibacterial drugs. Since the interactions between the host and the pathogen are in a dynamic and sensitive equilibrium, the factors that maintain and shift this equilibrium need to be understood to actively devise new strategies against pathogens. So far, bacteria still manage to escape the many approaches directed against them despite careful and rational design of antibacterial drugs. The aim of this thesis is to gain insight on specific bacterial strategies that help bacteria to survive despite natural and man-made anti-bacterial approaches and which thus have the potential to shift the sensitive equilibrium between host and bacterium. To identify if bacteria could defeat previously described, highly efficient antibacterial drugs, antibacterial surfaces which kill bacteria upon contact were 1
produced and tested, and an improved in situ method to monitor bacterial survival on surfaces was introduced. It was found that these surfaces were indeed highly efficient in killing bacteria but that they would fail under conditions inside the host, since host fluids could mask the antibacterial drugs that were immobilized on the surface (Chapter 2). The results from this study indicated that host protein adsorption is an important aspect of bacterial surface interactions which can benefit bacterial survival. Antibiotics are another set of powerful antibacterial drugs that prevent bacteria from multiplying by the bacterial cell division process but bacteria can adapt to escape their effects as well. Many approaches have been described of how bacteria actively counteract the effects of antibiotics. Here we could identify how bacteria managed to exploit a side effect of antibiotics to accelerate their colonization of surfaces: It was found that bacteria could turn the detrimental block of cell division which led to their filamentation into a kinetic advantage when they colonized surfaces that featured adhesive spots in a nonadhesive background. Bacteria continued to grow without completing their cell division, and could thereby bridge the nonadhesive surfaces faster than bacteria that had not been treated with antibiotics (Chapter 3). This study identified unwanted consequences of the use of antibiotics that had not been described before regarding their impact on bacterial surface colonization. Among the biological antibacterial strategies, macrophages are specialized cells of the innate immune system that recognize foreign bodies such as bacteria and internalize them for intracellular degradation. By closely investigating the impact of adhesion efficiency on bacterial survival, it was found that the adhesin type 1 fimbriae of Escherichia coli sped up the adhesion to and internalization by macrophages which had an important consequence for its survival: E.coli could escape the effect of antibiotics by accelerating the entry into the intracellular environment, despite a simultaneous higher risk of being degraded intracellularly. Particularly for pathogenic bacteria with additional virulence factors and survival strategies, the accelerated adhesion and internalization can be a good opportunity to increase their survival chances in cases when they would otherwise be killed by 2
extracellular antibiotics. The defensive act of foreign body internalization for clearance by macrophages is a long-known but still incompletely understood process. To better understand the antibacterial approaches of the host, a recently developed, highly precise magnetic trap was used to study the dynamic macrophage response to foreign bodies. Using magnetic micrometer-sized particles as prey for macrophages, the dynamic mechanical manipulation in terms of pulling, pushing and rotational motions that macrophages exert during the pick-up of their prey could be observed and recorded with high resolution (Chapter 5). The observations made during this study led to the question if particularly the rotation during particle pick-up is important in the interaction between foreign bodies such as pathogens and the host immune system. The high spatio-temporal resolution of the method in particular allowed to investigate for the first time if a wiggling-out strategy could be employed by the model systems for pathogenic microorganisms which would help the prey to evade uptake by immune cells (Chapter 6). Such strategies could also emerge as new applications in modulating immune response or strategies for improved drug delivery by turning mechanical constraints into a constructive therapeutic use. 3
Résumé La plupart des bactéries adhérant aux surfaces internes du corps humain contribuent au bon fonctionnement de l organisme, d autres, dites pathogènes, exploitent leur hôte à leurs propres fins. Les mécanismes naturels pour empêcher la survie de ces bactéries pathogènes, comme certaines cellules-hôtes spécialisées, recherchent ces éléments pathogènes et y adhèrent afin de les ingérer complètement. Les stratégies développées pour lutter contre ces pathogènes consistent à empêcher, soit l adhesion des bactéries, soit leur croissance à l aide de médicaments antibactériens. Etant donné l équilibre dynamique et fragile des interactions entre l hôte et les agents pathogènes, les facteurs responsables du maintien ou de la perturbation de cet équilibre doivent être compris afin de mettre sur pied des nouvelles stratégies de lutte contre ces éléments pathogènes. Jusqu à présent, les bactéries arrivent toujours à échapper aux nombreuses approches faites à leur encontre, et ce, malgré une conception prudente et rationnel des médicaments antibactériens. 5
Le but de cette thèse est de mieux comprendre les stratégies bactériennes spécifiques qui permettent aux bactéries de survivre malgré les démarches antibactériennes, naturelles et artificielles, ayant la capacité de perturber l équilibre s étant créé entre l hôte et la bactérie. Afin de déterminer si les bactéries réussiront à résister aux très efficaces médicaments antibactériens décrits précédemment, des surfaces antibactériennes, ayant la propriété de tuer les bactéries au moindre contact, ont été fabriquées et testées. Un procédé in situ amélioré permettant l observation de la survie des bactéries a également été mis en place. Il a été constate que ces surfaces étaient en effet très efficaces pour tuer ces bactéries mais pourraient échouer, sous certaines conditions, à l intérieur de l hôte en raison des fluides corporels, masquant les médicaments antibactériens déposés sur ces surfaces (Chapitre 2). Les résultats de cette étude montrent que l absorption par l hôte de protéine est un aspect important des interactions bactérie-surface, pouvant aider à la survie bactérienne. Les antibiotiques sont un autre type de puissant médicament antibactérien, qui empêchent les bactéries de se multiplier via la division cellulaire, mais les bactéries peuvent également s adapter afin d éviter ces effets. Différentes démarches ont été décrites, sur les méthodes utilisés par les bactéries éviter les effets des antibiotiques. Ici, nous avons pu identifier comment les bactéries arrivent à exploiter les effets secondaires des antibiotiques afin d accélérer la colonisation des surfaces: Il a été constaté que les bactéries peuvent tourner à leur avantages les effets indésirable de la division cellulaire qui provoquent leur filamentation, en un atout cinétique, lorsqu elles colonisent des surfaces contenant des zones adhésive dans un milieu non adhésif. Les bactéries poursuivent leur croissance malgré une division cellulaire incomplète, et par conséquent peuvent combler les zones non-adhésives plus rapidement que des bactéries ayant été traité à l aide d antibiotiques (Chapitre 3). Cette étude identifie les conséquences indésirables de l utilisation des antibiotiques, non-décrits précédemment, sur la colonisation bactérienne des surfaces. Parmi les stratégies antibactériennes biologiques, les macrophages sont des cellules spécialisées du système immunitaire inné qui reconnaissent les corps étrangers, tels que les bactéries, et les internalisent afin de réaliser une dégradation 6
intracellulaire. En étudiant de près l impact de l efficacité de l adhésion sur la survie bactérienne, il a été constaté que l adhésine type 1 fimbriae d Escherichia coli a accéléré l adhésion et l internalisation par les macrophages, ce qui a eu d importantes conséquences sur sa survie: E. coli pouvait échapper à l effet des antibiotiques en accélérant sa pénétration dans l environnement intracellulaire, et ce, malgré un risque très élevé d être dégradé simultanément au niveau intracellulaire. En particulier pour les bactéries pathogènes avec des facteurs de virulence et des stratégies de survie supplémentaires, l adhésion et l internalisation accélérée peuvent être une bonne technique pour augmenter leurs chances de survie, notamment dans le cas où elles auraient autrement été tuées par les antibiotiques extracellulaires. L acte défensif d internalisation d un corps étranger pour sa dégradation par des macrophages est un procédé connu de longue date, mais reste partiellement incompris. Afin d améliorer notre compréhension sur les approches antibactériennes de l hôte, un piège magnétique, récemment développé et très précis, a été utilisé pour étudier la réponse dynamique des macrophages au contact de corps étranger. En utilisant des particules magnétiques, de l échelle du micromètre, comme proie pour les macrophages, la manipulation mécanique dynamique, comme l action de tirer, pousser ou mettre en rotation, que les macrophages exercent lorsqu ils se saisissent de leurs proies a pu être observé et enregistré en haute résolution (Chapitre 5). Les observations réalisées durant cette étude ont abouti à la question de savoir si les mouvements de rotation durant la saisie de la particule est un aspect important dans l interaction entre le corps étranger, tel que les pathogènes, et le système immunitaire de l hôte. La haute résolution spatio-temporelle, de cette méthode en particulier, a permis d examiner pour la première fois si la stratégie du tortillement est une stratégie envisageable pour des microorganismes pathogènes, qui permettront aux proies d échapper aux cellules immunitaires (Chapitre 6). De telles stratégies pourrait aussi aboutir sur de nouvelles applications dans la modulation de la réponse immunitaire ou dans des stratégies pour l amélioration de l administration de médicaments en utilisant ces contraintes mécanique dans un but thérapeutique constructif. 7