I A L. Service d Immunologie et d Allergie RAPPORT ANNUEL 2002



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RAPPORT ANNUEL 2002 du Service d Immunologie et d Allergie I A L Professeur Giuseppe PANTALEO Service d immunologie et d allergie Département de médecine CHUV BH19-650 1011 Lausanne le 3 août 2004 IAL rapport annuel 2002, RP/rg 1 / 36

TABLE DES MATIÈRES I. SYNTHÈSE DE L ANNEE 3 II. ACTIVITÉS 4 1. CLIENTÈLE 4 a) Patients ambulatoires 4 b) Patients hospitalisés 4 c) Transplantations 4 d) Laboratoire de diagnostic 5 e) Etudiants 6 2. ACTIVITÉS PRINCIPALES 6 2.1. Soins et Services 6 a) Activité clinique 6 i. consultation ambulatoire 6 ii. patients hospitalisés 7 iii. interactions 7 b) Prestations du laboratoire de diagnostic 7 2.2. Enseignement 8 a) enseignement prégradué 8 b) séminaires 8 c) colloques 8 2.3. Recherche 9 a) recherche fondamentale 9 i. infection à HIV 9 ii. immunothérapie et vaccinologie 14 b) recherche clinique 17 i. allergologie, immunothérapie/vaccination 17 ii. infection à HIV 18 iii. autoimmunité 20 c) thèses 20 d) publications 21 2.4. Enseignement dans d autres cadres 23 3. AUTRES ACTIVITÉS ET FONCTIONS DES MEMBRES DE IAL 24 III. RESSOURCES 25 IV. ETAT D AVANCEMENT DU PROJET DE SERVICE 27 V. CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES 27 VI. ADDENDA ET TABLEAUX 27 IAL rapport annuel 2002, RP/rg 2 / 36

I. SYNTHÈSE DE L ANNÉE L'année 2002 a été marquée par : Laboratoire de diagnostic - LIA Une forte mise à contribution du laboratoire de diagnostic pour des études, la consolidation du test de résistance aux antirétroviraux de HIV. Le maintien des documents de l accréditation ISO/CEI 17025 du laboratoire de diagnostic -LIA. Les évaluations/développements pour l industrie suivants ont été réalisés: Elecsys Anti-HCV et pré-évaluation de l Elecsys HIV Combi. Les optimisations suivantes ont été réalisées: dosage de la β2-microglobuline; dans le domaine des Hépatites virales: anti-hav, génotypage de HCV, confirmation des anticorps anti-hcv; PCR quantitative de HBV introduction de l anticorps anti-actine dans le cadre de l autoimmunité. Préparatifs pour le transfert du système informatique de DMLAB sur MOLIS. Le maintien du site WEB du laboratoire http://www.hospvd.ch/public/chuv/dml/home.htm. Activités cliniques La poursuite de l activité de la consultation multidisciplinaire de l asthme en collaboration avec la Division de pneumologie. La poursuite de la collaboration avec la Division de Gastroentérologie dans le cadre du suivi en commun des patients souffrant d hépatite (virale ou auto-immune). Le renforcement de la consultation multidisciplinaire d immunologie clinique en collaboration avec le Service de rhumatologie et le Service de dermatologie. Activités de recherche Les efforts en vue de la mise en place et du développement d une plate-forme dans les domaines de la vaccinologie et de l immunothérapie se sont renforcés: ainsi, le Centre d Immunothérapie et de Vaccinologie (VIC) s est doté de normes et procédures standardisées (SOP s) dans le domaine clinique (GCP s pour «Good Clinical Practices») basées sur celles du réseau HVTN (HIV Vaccine Trial Network). Ces procédures ont été réalisées en vue de répondre aux critères de qualité utilisés par d autres groupes dans le domaine de la recherche vaccinale, et plus largement dans la recherche clinique. En plus des normes propres élaborées par le centre clinique (VIC), le laboratoire VIC a développé des directives et des procédures pour intégrer l accréditation ISO/CEI 17025 du LIA. D autre part, des démarches vis-à-vis des autorités régulatrices (Commissions d éthique, SwissMedic, notamment) ont été entreprises afin de soumettre et faire accepter plusieurs études cliniques. Un protocole vaccinal relatif à la malaria a pu débuter en décembre 2002, et trois autres protocoles dans le domaine du HIV sont en voie de soumission, dont deux élaborés avec des partenaires européens, respectivement internationaux doivent démarrer dans le courant de l année 2003. Autres La consolidation d un projet de Service en vue de la transformation de la Division IAL en Service d immunologie et d allergie. La construction du site WEB du Service d immunologie et d allergie, est terminée. Grâce à l appui professionnel du groupe WEB-Hospices, ce site verra le jour au 1 er janvier 2003 avec deux portes d entrées http://www.immunologyresearch.ch et http://www.chospvdh/chuv/ial/. Il sera alors en phase de consolidation. La construction d un réseau informatique Novell pour la communication/information et la sauvegarde de la micro-informatique au sein de la Division s est également achevée. Il s agira d assurer la formation continue des collaborateurs en 2003 pour que ce réseau remplisse parfaitement son rôle ainsi que de suivre son développement. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 3 / 36

II. ACTIVITÉ 1. CLIENTÈLE a) Patients ambulatoires Les patients ambulatoires sont référés par des praticiens de Suisse romande, par les médecins d'autres hôpitaux ou d'autres services du CHUV, ou consultent spontanément, une particularité de la spécialité allergologie/immunologie clinique, qui plus que d'autres spécialités, voit une forte proportion de patients consultant de leur propre initiative. Les examens de laboratoire proviennent de la consultation ambulatoire d'immunologie et d'allergie, du Département de médecine et d'autres services du CHUV pour ses patients hospitalisés, et, finalement, dans une moindre mesure des médecins et institutions extérieurs au CHUV (29.8%). En outre, un certain nombre d'examens de laboratoire «non facturables» sont nécessaires dans le contexte des contrôles de qualité internes et externes, et de l'évaluation de nouvelles méthodes. Le nombre total des consultations ambulatoires pratiquées par les médecins de la Division en 2002 a été de 2'692: entre le 1 er janvier 2002 et le 8 novembre 2002, elles ont été effectuées au niveau 07 du CHUV (BH-07), date à laquelle la consultation ambulatoire IAL a été transférée au sein de la nouvelle Policlinique Médicale (PMU). Cette consultation a été intégrée dans la structure dévolue aux Consultations de Médecine Ambulatoire (CMA), à l étage 06 du bâtiment de liaison (BL-06). Les patients ambulatoires sont pris en charge par 3 à 4 médecin-assistants. Ces médecins sont placés sous la supervision de la Dresse A. Leimgruber, médecin-associé et ME, du Prof. F. Spertini, médecin-adjoint et du Dr. P-A. Bart, médecin-associé). La consultation ambulatoire d'immunologie et d'allergie est l une des plus importantes des consultations dites de Médecine 1. Le VIC accueille des patients ambulatoires et des volontaires en bonne santé qui participent à certaines études cliniques. Ces personnes reçoivent un code alphanumérique qui permet de saisir leur admission de façon complètement anonyme dans le logiciel de gestion des patients du CHUV. Les volontaires des protocoles vaccinaux et les patients ambulatoires des protocoles immunothérapeutiques ont été pris en charge par les Drs. M. Khonkarly, médecin-assistante (Protocoles «Cyclosporine», «BMS», «Agouron» et «MOCHA»), C. Deruaz, médecin-assistant et F. Lurati, chef de clinique-adjointe (Protocole «Malaria»), sous la supervision des Profs. G. Pantaleo et F. Spertini et du Dr. P.-A. Bart, médecin-associé. b) Patients hospitalisés Il y a eu plus de 500 consultations auprès de patients hospitalisés. Les patients hospitalisés ont été pris en charge par 3 médecins-assistants. Ces médecins étaient placés sous la supervision du Prof. F. Spertini, médecin-adjoint, du Dr. P-A. Bart, médecin-associé, et du Dr. F. Lurati, chef de clinique-adjointe. La Dresse A. Leimgruber, médecin associé et ME, a fonctionné comme remplaçante du Prof. F. Spertini et du Dr. P-A. Bart. c) Transplantations Ont été typisés en urgence : 13 donneurs d'organes. Des 26 reins disponibles (+5), 19 (+14) ont été transplantés à Lausanne, 18 (+5) envoyés vers des centres extérieurs, 0 inutilisable. 10 reins ont été reçus d autres centres de transplantation. Ainsi 29 (+11) reins de cadavres ont été transplantés à Lausanne. En outre, 1 (-4) rein provenant de donneur vivant a été typisé dans notre laboratoire. Le nombre des transplantés rénaux était de 30 en 2002 (+7). Le nombre moyen de candidats à la IAL rapport annuel 2002, RP/rg 4 / 36

transplantation de reins était de 24 (+1) sur la liste d'attente. 27 nouveaux patients ont été typisés et contrôlés régulièrement pour leurs anticorps anti-hla. 8 patients en attente d'une transplantation cardiaque, 2 d'une transplantation pulmonaire et 17 d'une transplantation hépatique ont été également investigués. L activité dans le domaine de l immunologie de transplantation atteint un niveau de complexité élevé: plusieurs patients reviennent sur une liste d attente pour une seconde ou une troisième transplantation, d autres ont bénéficiés ou sont en attente de transplantations multiples (cœur-rein / foie-rein). D autre part, le don de rein à partir de donneur vivant diminue. Par ces faits, le laboratoire de diagnostic est mis fortement à contribution lors de la préparation et de la mise sur liste des patients en attente d une transplantation. Service de piquet permanent. Ce service est intervenu 23 fois pour typisation HLA de donneurs d'organes, pour cross-match entre cellules de donneurs et sérums de receveurs, ainsi que pour le dépistage des marqueurs du SIDA, des hépatites virales et anti-htlv-1 et 2 dans le sérum des donneurs d'organes. Ce service de piquet (initialement destiné à la transplantation d'organes) intervient pour répondre à d'autres besoins, notamment pour le dépistage du virus HIV dans différentes situations (blessures c/o personnel, ruptures de préservatif, etc.). Total des interventions 98 (+5), avec un total de 333 heures d interventions hors des heures ouvrables. Il est aussi intervenu, en dehors de la transplantation et du SIDA, pour répondre à des demandes formulées par le médecin IAL de piquet lors de situations urgentes d'immunologie ou d'allergologie survenant pendant les week-ends. d) Laboratoire de diagnostic La liste et le nombre des analyses effectuées sont décrits dans le tableau 2. Le nombre total des analyses facturables était de 88 353 (+2.58%). Le tableau 3 montre la recette réalisée par l'institution sur la base de ces analyses. Le 5.8 % des analyses était demandé par la consultation ambulatoire d'immunologie et d'allergie et le 33,2% par le reste du DM (total DM 39%). Le 31,2% des demandes provenait des autres services du CHUV et le 29,8% de l'extérieur du CHUV. Ces résultats ne comprennent pas les analyses destinées aux contrôles de qualité et aux essais de méthodes, ni celles qui émanant de mandats de l'ofsp. Le montant des factures des analyses effectuées pour le CHUV était de fr. 3'175 201.- et représentait le 70.2 % de l'activité. Le 29.8 % restant, effectué pour l'extérieur, correspond à la somme de fr. 1 347 878.-. La valeur totale des analyses effectuées est de fr. 4'523 079.- (+252'194.-). Source des demandes d'analyse 30% 31% 39% DM autres services du CHUV extérieur du CHUV Le nombre total des analyses effectuées dans le contexte du SIDA était de 31'793. Ces analyses comprennent le dépistage de l anticorps anti-hiv1 et 2 et de l antigène p24 par deux tests immunoenzymatiques effectués en parallèle, par les Western blots, la numération des souspopulations lymphocytaires par cytométrie en flux et la mesure de HIV RNA par polymerase chain reaction dans le plasma. 123 (+25) nouveaux sujets séropositifs ont été détectés. L augmentation du nombre de sujets séropositifs est ainsi de 25.5 % pour l année 2002. Il y a eu une croissance IAL rapport annuel 2002, RP/rg 5 / 36

régulière du nombre de sujets séropositifs depuis 1998 (année où le nombre de cas détectés par notre laboratoire (65) est le plus faible). En comparant les données de 1998 à 2002, on constate une augmentation totale de 89.2 %. Le nombre total des séropositifs découverts par le laboratoire, depuis le début de l'épidémie, est de 3 037. e) Etudiants - Durant l année écoulée, notre Division a accueilli et formé: - 6 étudiants universitaires dans nos laboratoires de recherche. - 2 étudiante-médecins a fait un stage d un mois en clinique. - 2 stagiaires FAMH dans le laboratoire de diagnostic. - 8 étudiants de l Ecole de laborantin(e)s ont effectué leur stage de formation (3 en recherche et développement et 5 (-3) en diagnostic et optimalisation). - 1 laborantine a suivi un stage de réinsertion professionnelle en recherche. - 3 apprenti-laborants en biologie ont effectué un stage de formation en laboratoire de recherche. 2. ACTIVITÉS PRINCIPALES Les activités de la Division IAL comprennent quatre missions principales: la consultation auprès des patients, le laboratoire de diagnostic, la recherche et l enseignement. Ces quatre missions sont interdépendantes et s enrichissent l une l autre par synergie. La mission d'enseignement post-gradué comprend, comme tâche majeure, la formation au titre FMH d'allergologie et immunologie clinique. Cette mission pour être accomplie demande l'accès à une consultation de patients ambulatoires et hospitalisés ainsi qu'à un laboratoire de diagnostic (règlement FMH). La mission d enseignement post-gradué comprend également la formation au titre FAMH en immunologie clinique. Cette mission a pour but la formation de responsable de laboratoire d analyses médicales et doit se dérouler en partie dans un laboratoire universitaire de type A selon le règlement FAMH. La mission de recherche inclut à la fois une recherche fondamentale et une recherche appliquée. Dans un cas comme dans l'autre, l'accès à une clinique ambulatoire ou à des patients hospitalisés est une nécessité. L'attrait pour une recherche en collaboration avec l'industrie est également lourdement dépendante de la présence d'un laboratoire de servic e et d'un accès aux patients. La stimulation de ces diverses activités et leur développement est bien entendu dépendant entièrement de l'encadrement par des spécialistes capables d'une activité pratique et théorique dans chacune des activités et des missions incombant à la Division. Point important, la mission de recherche permet d'offrir des salaires non institutionnels payant des assistants qui accomplissent aussi pour une part de leur temps de travail des missions de consultation et de validation des analyses du laboratoire. Le laboratoire de diagnostic supporte également l enseignement aux stagiaires laborantines médicales, ainsi que la formation au titre FAMH en immunologie clinique. 2.1. Soins et services a) Activité clinique i. Consultation ambulatoire La consultation ambulatoire s'est occupée essentiellement de cas d'allergie. Il s'agissait d'hypersensibilité aux venins d'hyménoptères (guêpe et abeille), d'allergologie générale (asthme, anaphylaxie, urticaire, rhinoconjonctivite, allergie alimentaire et réactions médicamenteuses), de pseudo-allergie (investigations d'hypersensibilité aux anesthésiques locaux, aux anesthésiques généraux, aux analgésiques, aux antibiotiques et aux additifs alimentaires). En dehors du chapitre de l'allergie, la consultation ambulatoire a pris en charge le traitement et le suivi de maladies inflammatoires chroniques: hépatites virales (interféron-α, diverses études multicentriques suisses), et auto-immunes chroniques, des IAL rapport annuel 2002, RP/rg 6 / 36

maladies inflammatoires, autoimmunes ou à complexes immuns (lupus érythémateux disséminé (LES), maladie de Sjögren, sclérodermie, mixed connective tissue disease (MCTD), polymyosite, cryoglobulinémie et autres vasculites diverses, notamment. La prise en charge de ces affections inflammatoires a engendré d importants échanges avec l'hôpital ophtalmique, particulièrement dans le domaine des uvéites). Un autre volet de l immunologie pour lequel des patients sont régulièrement référé concerne l investigation et le traitement des différents types d'immunodéficience. Depuis fin novembre 1999 une consultation multidisciplinaire d immunologie a été créée, une fois par semaine, le lundi après-midi, supervisée par la Dresse A. Leimgruber. Cette consultation est organisée en collaboration avec le Service de rhumatologie (Dr. J. Dudler, médecin-associé). ii. Patients hospitalisés Les patients hospitalisés, pris en charge par les médecins IAL, se trouvaient le plus souvent dans le DM, ou dans les Services de neurologie ou de rhumatologie. Ils ont été pris en charge par les mêmes médecins-assistants qu'à la consultation ambulatoire, sous la supervision du Prof. F. Spertini, du Dr. P-A. Bart et de la Dresse A. Leimgruber. La part de l'allergie chez ces malades était moindre que chez les patients ambulatoires. Il s'agissait surtout de maladies inflammatoires diverses, de vasculites ou de toute autre affection dans lesquelles une composante immunopathologique était suspectée ou une approche par un interniste immunologue désirée. iii. Interactions La Division étant un Centre de référence pour les hépatites virales (Dr. A. Mantegani), elle a intensifié ses interactions avec la Division de gastroentérologie dans ce domaine (Prof. P. Michetti, Prof. J-J. Gonvers). Des discussions de cas cliniques ou d'inclusion de cas dans des études multicentriques (SASL) ont été formalisées sur un rythme mensuel entre les membres d IAL et le groupe du Prof. J.-J. Gonvers. Les échanges avec le Service de pédiatrie ont été intensifiés de par le soutien par IAL à hauteur de 10% du Dr. Michael Hofer, médecin associé de pédiatrie, spécialiste FMH en allergologie et immunologie clinique et la poursuite d une collaboration de longue date avec le Dr. B. Pelet, médecin-adjoint. Ces collaborations ont débouché sur la mise en place avec le Dr. M. Hofer d'une discussion de cas communs (pédiatrique et adulte), ainsi que la prise en charge par le Dr. M. Hofer de la formation en allergologie et immunologie clinique pédiatrique des assistants de la division IAL. Cet effort aboutira prochainement à l'organisation d'un programme pédiatrique et adulte en allergologie et immunologie clinique reconnu par la FMH. Depuis la création de la consultation multidisciplinaire d immunologie, la présence régulière du Dr. J. Dudler (FMH en Rhumatologie) a été bénéfique notamment pour l examen est la prise en charge des patients avec atteinte ostéo-articulaire. Elle a également permis d élargir l enseignement dispensé aux médecins-assistants de la Division. La consultation multidisciplinaire de l asthme a permis de rapprocher les deux Divisions (IAL et PNE) et d améliorer la prise en charge de patients asthmatiques. b) Prestations du laboratoire de diagnostic L année 2002 a été fortement marquée par: La consolidation du test de résistance pour HIV introduit le 1er décembre 2000. Dans ce cadre c est un apport unique de compétences entre trois unités du CHUV (PCL: mesure du taux des médicaments; MIN: interprétation clinique des résultats et LIA) qui a été mis en place au bénéfice des praticiens de Suisse et de leurs patients atteints par le virus du SIDA. La nouvelle position OFAS entrera en vigueur dès le 1 er janvier 2003. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 7 / 36

Le maintien des documents de l accréditation ISO/CEI 17025 du laboratoire de diagnostic et la préparation de l intégration du laboratoire du Centre d immunothérapie et de vaccinologie dans le même processus pour 2003. Les évaluations/développements pour l industrie suivants ont été réalisés: Elecsys Anti-HCV et pré-évaluation de l Elecsys HIV Combi. Suite de l évaluation de l'extracteur RNA AMPLIPREP de Roche pour la PCR de l hépatite C qualitative et quantitative. Les optimisations suivantes ont été réalisées: - Introduction de l anticorps anti-actine dans le cadre de l autoimmunité - Optimisation de technologie pour les analyses suivantes: dosage de la β2 microglobuline par néphélémétrie; détection des anticorps anti-hav totaux sur Elecsys; optimalisation du génotypage de HCV; confirmation des anticorps anti-hcv par Inno-LIA AB III (permet une interprétation objective des résultats grâce à un balayage densitométrique des bandelettes, suivi d une analyse informatisée); réalisation de la PCR quantitative de HBV sur l automate Cobas Amplicor. Planification et préparation du cahier des charges pour le transfert du système informatique de DMLAB sur MOLIS au printemps 2003 avec journées de formation sur MOLIS. Le maintien du site WEB de notre laboratoire (LIA) dans le cadre d une plateforme WEB du Département de médecine de laboratoire http://www.hospvd.ch/public/chuv/dml/home.htm. Le laboratoire a continué d'exercer le mandat officiel de laboratoire de confirmation pour le SIDA, attribué par l'ofsp (depuis 1985). La responsabilité en est assumée par le Dr. P. Bürgisser. La supervision du laboratoire se fait au travers de ses cadres médicaux, biologiste-famh et médico-techniques notamment par une réunion hebdomadaire des cadres élargis qui traite des dysfonctionnements et des développements du laboratoire ainsi que du maintien de son accréditation. Une autre réunion hebdomadaire sert de lien avec l ensemble des collaborateurs et à comme objectif l information, la communication et la formation continue. 2.2. Enseignement a) Enseignement prégradué 5 cours ( 60 h). Cf addendum. b) Séminaires postgradués et de formation continue, séminaires sur invitation - 11 séminaires postgradués - 15 séminaires de formation continue - 22 séminaires sur invitation (Cf addendum) c ) Colloques Colloques lausannois d'allergologie et d'immunologie clinique: 15 colloques (Cf addendum) Colloques de formation continue du personnel du laboratoire de diagnostic: organisés par le Dr. V. Aubert 12 colloques (Cf addendum) IAL rapport annuel 2002, RP/rg 8 / 36

2.3. Recherche a) Recherche fondamentale i. Infection à HIV G. Pantaleo 1. Étude comparative du rôle des lymphocytes T cytotoxiques (LTC) chez des patients infectés par le virus de l hépatite C (VHC), chez des patients infectés par le virus d immunodéficience humaine (VIH-1), ou chez des patients coinfectés par le VHC et par le VIH-1. M. Knuchel et D. Ciuffreda en collaboratio n avec le Pr. J-J. Gonvers Le VHC est la cause majeure des hépatites non-a non-b transmises de manière parentérale et est caractérisé par une tendance à la chronicité (80% des cas). La persistance du virus est associée à un risque de développement d une cirrhose ou d un carcinome hépatique. Cependant, les mécanismes entraînants des dégénérescences du foie n ont pas pu êtres caractérisés jusqu à ce jour. Les résultats d études cliniques laissent supposer que le système immunitaire pourrait jouer un rôle dans le développement de cette maladie. Beaucoup de patients infectés par le VIH-1 sont co-infectés par le VHC et la progression de l hépatite C est bien plus rapide chez ces patients. Une étude comparative entre ces deux virus pourrait donc aider à établir des mécanismes de persistance virale et à déterminer plus précisément le rôle du système immunitaire (en particulier les LTC) dans la dégénérescence du foie. Nous avons commencé seulement depuis quelques mois a recruté des patients infectés par le VHC. En parallèle, diverses nouvelles techniques ont été développées ou adaptées à nos besoins: Le marquage tétramerique de VHC-spécific LTC a été développé, le marquage tétramerique de VIH-1-specific LTC sur tissu murin a été reproduit avec succès dans notre laboratoire et l adaptation de ce même marquage sur tissu humain est testée actuellement. Nous avons aussi commencé à développer une méthode d hybridisation in situ pour la détection d ARN de VHC dans le foie et voulons adapter une méthode RT- PCR pour la détection d ARN de VHC dans le foie. 2. L infection ciblée et précoce des lymphocytes CD4 effecteurs spécifiques au VIH fait avorter le développement d une réponse immune CD4 pendant l infection primaire par le VIH. A. Harari, K. Ellefsen, D. Ciuffreda, P-A. Bart en collaboration avec les Drs. J-P. Chave, D. Kaufmann et A. Telenti Plusieurs études effectuées chez la souris ou sur l Homme ont indéniablement démontré le rôle crucial joué par les lymphocytes T CD4 spécifiques aux virus dans le contrôle des infections virales chroniques. Dans le cas de l infection par le VIH, les réponses CD4 helper spécifiques, i.e., lymphoprolifératives, sont rapidement perdues au cours de l infection chronique et plusieurs études ont corrélé ceci à l absence de contrôle du virus pas le système immunitaire. Des lymphocytes CD4 spécifiques au VIH ont pourtant été détectés chez des patients chroniquement infectés sur la base de la capacité des cellules à sécréter de l interféron (IFN)-γ en réponse à une stimulation antigénique spécifique. Afin de mieux caractériser la réponse primaire CD4 anti-virale spécifique, la capacité lymphoproliférative ainsi que la capacité à sécréter de l IFNγ en réponse à une stimulation antigénique spécifique ont été étudiées chez des patients avec des infections primaires et chroniques au VIH mais également au cytomégalovirus (CMV). Des cellules spécifiques au VIH et au CMV sécrétant de l IFNγ ont été détectées chez la plupart des patients avec des infections primaires et chroniques au VIH et au CMV respectivement et IAL rapport annuel 2002, RP/rg 9 / 36

la majorité des ces cellules appartenait à la sous-population lymphocytaire n exprimant pas le CCR7, corroborant les études qui ont montrées que l absence d expression de ce récepteur de chimiokine identifie une population effectrice. L amplitude de la réponse primaire effectrice CD4 spécifique au CMV observée était très significativement supérieure à la réponse primaire effectrice CD4 spécifique au VIH. De plus, une comparaison des réponses primaires et chroniques a montré une forte expansion des cellules effectrices spécifiques au CMV pendant la séroconversion alors qu aucune différence significative n a été observée entre les réponses effectrices primaires et chroniques CD4 spécifiques au VIH. Une analyse phénotypique de la population contenant les cellules spécifiques effectrices, i.e., CD4 + CCR7 -, a montré non seulement un enrichissement significatif de cette population pendant la primo-infection au VIH mais également que cette population se distingue par un fort niveau d expression de CCR5, le co-récepteur principal au virus, ainsi que par une grande capacité proliférative. Comme suggéré par l étude phénotypique, la quantification de la charge virale contenue dans des populations purifiées (CD4 + CCR7 + et CD4 + CCR7 - ) de lymphocytes de patients avec une primo-infection au VIH a établi que cette dernière population, qui contient la majorité des cellules effectrices spécifiques au VIH, est significativement plus infectée. Ces résultats indiquent que l infection précoce et ciblée des cellules effectrices CD4 spécifiques au VIH pendant la primo-infection fait avorter l établissement d une réponse CD4 optimale et explique le rapide déclin, tant qualitatif que quantitatif, de la réponse CD4 spécifique au VIH au cours de l infection. 3. Biais dans la maturation des cellules effectrices mémoires CD4 spécifiques au VIH: Grande concentration de cellules spécifiques au CMV dans la population pleinement mature CD45RA + CCR7 - et accumulation de cellules spécifiques au VIH dans la population pré-mature CD45RA - CCR7 -. A. Harari, K. Ellefsen, D. Ciuffreda, P-A. Bart en collaboration avec les Drs. J-P. Chave et M. Khonkarly La compréhension des lignées de différenciation des cellules T mémoires représente une des questions centrales de l immunologie. Deux études récentes ont permis de porter un regard plus éclairé sur ces questions. La première de ces études a établi que le récepteur aux chimiokines CCR7 permet de distinguer différentes sous-populations mémoires en fonction de leur capacité effectrice ainsi que de leurs préférences anatomiques. Sur la base de l expression de CCR7 et de CD45RA, un marqueur classique des cellules naïves, cette étude a permis d identifier trois et respectivement quatre populations dans les lymphocytes T CD4 et CD8 mais également d attribuer une fonction et une identité à chacune de ces populations. La deuxième étude a clairement établi la lignée de différenciation (CD45RA + CCR7 + -> CD45RA - CCR7 + -> CD45RA - CCR7 - -> CD45RA + CCR7 - ) des cellules CD8 spécifiques à un antigène. De plus, une comparaison de la distribution ex vivo de cellules CD8 spécifiques à un antigène chez des patients avec des infections chroniques au VIH et au cytomégalovirus (CMV) a démontré un biais dans la maturation des cellules CD8 spécifiques au VIH. En effet, alors que la majorité des cellules CD8 spécifiques au CMV avait le phénotype pleinement mature (CD45RA + CCR7 - ), la plupart des cellules CD8 spécifiques au VIH étaient bloquées à un stade pré-mature (CD45RA - CCR7 - ). Une étude approfondie des lymphocytes T CD4 de donneurs sains ainsi que de patients infectés par le VIH a permis de mettre en évidence l existence d une quatrième population (CD45RA + CCR7 - ), jusqu ici non considérée. Cette population contient la plus forte proportion de lymphocytes CD4 spécifiques au CMV sécrétant de l interféron-γ en réponse à une stimulation spécifique, ceci autant chez des donneurs sains que chez des patients chroniquement infectés par le VIH. Par contre, chez ces derniers, la plus forte concentration de cellules spécifiques au VIH se trouve dans la population pré-mature (CD45RA - CCR7 - ). Ces résultats suggèrent que le biais démontré dans la maturation de cellules CD8 spécifiques au VIH existe également dans les cellules CD4. Cette hypothèse est notamment corroborée par le fait que chez les patients infectés par le VIH et dont la réplication virale est contrôlée en absence de traitement (les LTNP), la proportion des cellules spécifiques au VIH dans les différentes sous-populations est très semblable à celle des cellules spécifiques au CMV, soulignant le IAL rapport annuel 2002, RP/rg 10 / 36

rôle primordial des cellules spécifiques aux virus pleinement matures (CD45RA + CCR7 - ) dans le contrôle à long terme des infections virales chroniques. 4. Analyse à grande échelle de l expression génétique chez les lymphocytes T CD4 et CD8 de donneurs ou de patients infectés par le VIH-1. Massimo Nobile Avec le décodage complet du génome humain, les techniques classiques d analyse génétique ne sont plus suffisamment performantes pour les besoins de la recherche fondamentale et clinique moderne dans l étude de l expression de gènes. C est pourquoi, parallèlement à ce décodage, s est développée la technique de «microarray» ou microréseaux qui permet d analyser l expression de plusieurs centaines de gènes simultanément dans la même expérience. Plusieurs événements cellulaires ont été associés à une infection au VIH-1, comme une perte progressive des lymphocytes T CD4 et CD8, un plus haut niveau de lymphocytes T potentiellement dans le cycle cellulaire ou une hyper-activation du système immunitaire. A ce sujet, plusieurs hypothèses ont été émises sans pour autant expliquer clairement ces phénomènes. Dans ce contexte, nous voulons tirer avantage de la technologie de microarray pour identifier les phénomènes moléculaires associés à ces dérégulation cellulaires. Nous analysons donc l expression de 500 gènes environ, comprenant des facteurs de régulations du cycle cellulaire, des cytokines, chimiokines et d autres facteurs immunologiques. Ces analyses sont faites sur des sous-populations cellulaires, parmi lesquelles des lymphocytes T CD4 et CD8 de donneurs sains, de patients en phase chronique de l infection au VIH-1 et stimulées in vitro. Une telle approche peut aussi nous permettre de mettre en évidence une signature spécifique pour l infection au VIH-1, comme déjà décrit par exemple pour certains lymphomes B. Pour se faire, il faudrait étendre l étude à d autres infections chroniques et maladies immunitaires. Dans cette optique, la technologie de microarray ouvre aussi une porte sur le diagnostic. 5. Analyse de la distribution et de la fonction des lymphocytes T CD8 mémoires spécifiques VIH et CMV dans différents compartiments anatomiques. K. Ellefsen, P. Champagne, A. Harari, M. Nobile Grâce à la caractérisation phénotypique basée sur l expression de CD8, CD45RA et CCR7, nous avons pu clairement identifier quatre populations cellulaires VIH-spécifiques dans le sang. L analyse de la capacité de prolifération et de différentiation de ces différentes sous-populations cellulaires CD8 nous a permis d établir une lignée de différentiation (CD45RA + CCR7 + CD45RA - CCR7 + CD45RA - CCR7 - CD45RA + CCR7 - ) pour les lymphocytes T CD8 spécifiques d un antigène. De plus, une comparaison de la distribution dans le sang entre les différents sous-populations CD8 spécifiques d un antigène chez des patients avec des infections chroniques au VIH et au CMV a démontré un défaut dans la maturation des cellules CD8 spécifiques au VIH. En effet, les lymphocytes T CD8 spécifique au CMV sont représenté par 40% de cellules pré-mature (CD45RA - CCR7 - ) et de 50% de cellules matures (CD45RA + CCR7 - ), tandis que les cellules T CD8 spécifiques au VIH montrent une accumulation au stade prémature (70%) et que le stade mature est faiblement représenté (5%). Il est donc maintenant légitime de se demander ce qui se produit pour les cellules T CD8 mémoires spécifiques VIH et CMV dans le ganglion lymphatique. Dans un premier temps, nous avons vérifié la distribution du CCR7 sur les lymphocytes T CD8 spécifiques du VIH et du CMV dans le sang et le ganglion. Nous avons pu observer que la majorité des cellules identifiées par des tétramères spécifiques du VIH et du CMV sont CCR7- dans le sang et le ganglion. Cependant, le pourcentage de cellules se liant à des tétramères spécifiques du CMV dans le sang est de 2.3% comparé a 0.1% dans le ganglion tandis que pour celles se liant à des tétramères spécifiques du VIH la distribution est similaire IAL rapport annuel 2002, RP/rg 11 / 36

dans le ganglion et le sang. Ce qui signifie que la proportion de lymphocytes T CD8 spécifiques au CMV détectée dans le ganglion est nettement plus faible que dans le sang. De plus, nous démontré que les cellules T CD8 CCR7+ et CCR7- VIH spécifiques et CMV spécifiques peuvent sécréter de l interféron-γ en réponse à une stimulation spécifique. Finalement, nous avons comparé la distribution des quatre populations (CD45RA + CCR7 + CD45RA - CCR7 + CD45RA - CCR7 - CD45RA + CCR7 - ) pour les lymphocytes T CD8 VIH et CMV spécifiques dans le sang et le ganglion. Pour une infection par le VIH nous observons la même distribution des quatre populations dans le sang et le ganglion pour les cellules CD8 VIH spécifiques soit une accumulation de la population pré-mature (CD45RA - CCR7 - ). Les données obtenues confirment que la majorité les cellules T CD8 spécifiques au CMV ont le phénotype mature (CD45RA + CCR7 - ) dans le sang et le ganglion. Cependant, nous avons observé une augmentation de la population CD8 + CCR7 + spécifiques au CMV confirmant ainsi la présence plus élevées de cellules mémoires précurseurs dans le ganglion. 6. Détermination de la production des lymphocytes T à partir du thymus à différents stades de l infection par le VIH. K. Ellefsen, G. Mancini, en collaboration avec le Dr. P. Schneider CTS Le thymus est l organe lymphoïde central qui procure un micro-environnement spécialisé pour la maturation et le réarrangement des gènes du récepteur des lymphocytes T (TCR). Les scientifiques ont longtemps pensé que la fonction du thymus déclinait avec l âge et que le thymus était fonctionnel seulement au début de la vie. Cependant, plusieurs groupes ont récemment démontré que le thymus humain peut produire de nouvelles cellules T jusqu à un âge très élevé chez l adulte. Ils ont aussi démontré que les patients infectés par le virus de l immunodéficience humain (VIH) peuvent produire de nouvelles cellules T après un traitement antiviral. Ce qui confirme que le thymus peut développer de nouvelles cellules T tout au long de la vie et qu il est possible de rétablir la fonction du thymus suite à un traitement antiviral. Durant la différentiation intra-thymique des cellules T, les 2 gènes codant pour le récepteur des précurseurs des lymphocytes T-αβ (TCR-αβ) subissent un réarrangement aboutissant à la formation d un ADN circulaire épisomal (ou extrachromosomique) stable (TREC). Cet ADN circulaire ne peut être répliqué durant la mitose et est alors dilué lors de la division cellulaire. Les TRECs sont enrichis dans la population des cellules T phénothypiquement naïves (CD45RA + CD62L + ) et peuvent ainsi servir de marqueur pour les nouvelles cellules T émigrant du thymus (RTE). Dans cette étude nous nous proposons de déterminer la fréquence des RTE dans les populations purifiées des cellules T CD4 et CD8 dans le sang périphérique de sujets sains et de sujets infectés par le VIH à différents stade de la maladie selon leur âge et leur sexe. 7. Analyse des réponses CD4-spécifiques au VIH et au CMV dans des infections primaires et chroniques. A. Harari Les réponses cellulaires CD4 spécifiques au VIH et au CMV ont été étudiées dans des groupes de patients avec des infections primaires et chroniques au VIH et au CMV. Les cellules CD4-spécifiques à ces deux virus ont été identifiées par la sécrétion d'ifn-γ résultant d'une stimulation spécifique. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 12 / 36

Observations: Des cellules CD4 sécrétant de l'ifn-γ spécifiques au VIH et au CMV ont été identifiées chez les patients avec des infections primaires ou chroniques et la plupart de ces cellules étaient contenues dans la sous-population cellulaire n'exprimant pas le CCR7. L'ampleur de la réponse T CD4 spécifique au CMV durant la primo-infection était significativement supérieure à celle observée durant la primo-infection au VIH mais également à celle observée chez les patients chroniquement infectés par le CMV. Au contraire, aucune différence significative ne fut établie entre les réponses chroniques et primaires au VIH. Une forte proportion de cellules T CD4 + CCR7 - étaient infectées par le VIH Conclusions: Ces résultats indiquent qu'une forte expansion de cellules T CD4 spécifiques est présente durant la primo-infection au CMV mais pas au VIH. 8. Analyse moléculaire des sous-populations de lymphocytes T CD8 + mémoire spécifiques du virus VIH. P. Lieby Dans le but de comprendre les mécanismes de la maturation anormale des lymphocytes T CD8 + mémoire spécifiques du virus VIH 1, nous proposons d étudier l expression de gènes impliqués dans la mort et la survie cellulaires au sein des populations T CD8 + mémoire spécifiques des virus VIH et CMV. La suggestion de l existence d un équilibre entre les phénomènes de prolifération, de survie et d apoptose cellulaires, nous conduit à mener l analyse de l expression de gènes anti-apoptotiques et pro-apoptotiques ainsi que d autres possédant une fonction de survie cellulaire 2. Le tri, par cytométrie en flux, de cellules T antigène-spécifiques au moyen de tétramères de classe CMH I (portant des peptides des virus HIV ou CMV) et de marqueurs de surface cellulaire, permet une étude directe de l expression génique par une technique de RT-PCR utilisant un ensemble d oligonucléotides spécifiques des gènes étudiés. Cette approche pourrait apporter de nouvelles informations quant à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation des lymphocytes T CD8 + mémoire. 9. Biais dans la maturation des cellules mémoires spécifiques au VIH. K. Ellefsen Pour caractériser les lymphocytes T CD8 mémoire, nous avons utilisé le récepteur aux chémokines CCR7,un marqueur de la surface cellulaire. Il a été démontré que ce récepteur permet de distinguer entre différentes sous-populations mémoire en fonction de leur capacité effectrice et ainsi que leur capacité à migrer à travers les organes lymphoïdes secondaires. Observations: L analyse ex vivo des lymphocytes T CD8 spécifiques à un antigène nous a permis d identifier 4 populations cellulaires: a) CD45RA + CCR7 + ; b) CD45RA - CCR7 + ; c) CD45RA - CCR7 - ; et CD45RA + CCR7 -. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 13 / 36

La comparaison de la distribution dans le sang entre les différents sous-populations CD8 spécifiques à un antigène chez des patients avec des infections chroniques au VIH et au CMV a démontré un défaut dans la maturation des cellules CD8 spécifiques au VIH. En effet, les lymphocytes T CD8 spécifique au CMV sont représenté par 40% de cellules pré-matures (CD45RA - CCR7 - ) et de 50% de cellules matures (CD45RA + CCR7 - ) tandis que les cellules T CD8 spécifiques au VIH montrent une accumulation au stade pré-mature (70%) et que le stade mature est faiblement représenté (5%). 10. Tétramères de Classe I. K. Ellefsen Le tétramère est une molécule composée de quatre molécules du complexe majeur d histocompatibilité de classe I (CMH) qui lie les lymphocytes T suite une interaction directe avec le récepteur de la cellule T (TCR) (figure). Le tétramère chargé avec un peptide spécifique permet de reconnaître les cellules T spécifiques qui normalement répondent à la présentation de ce même complexe MHC/peptide à la surface des cellules. Nous avons alors produit un éventail très diversifié de plusieurs tétramères qui sont utilisés dans nos études pour cibler les cellules T CD8 spécifique aux réponses virales comme le virus de l immunodéficience huma ine-1 (VIH-1) ou le cytomégalovirus (CMV). Présentement, les tétramères de classe I sont représentés par trois différentes allèles HLA. Chaque CMH de classe I est chargé avec un peptide viral défini pour VIH-1 (11 épitopes), CMV (2 épitopes), virus de l hépatite C (VHC) (6 épitopes), virus d Epstein-Barr (3 épitope) et Papillomavirus humain (VPH) (1 épitope). ii. Immunothérapie et vaccinologie B. Corthésy 1a. Sort des IgA de sécrétion (SIgA) dans les plaques de Peyer murines Afin qu une réponse immunitaire de nature SIgA puisse prendre place, les antigènes doivent être transportés de façon contrôlée à travers l épithélium bordant les muqueuses. Ce processus est médié par les cellules M des plaques de Peyer (PP). Comme les SIgA induisent une réponse immunitaire après administration exogène, nous avons cherché à identifier quels types cellulaires dans le PP pouvait contribuer à ce mécanisme. In vitro, les cellules dendritiques (DC), B et T associent les SIgA. In vivo, le même profil de liaison est observé. De manière remarquable, seules les DC situées au niveau du dôme des PP sont capables d internaliser les SIgA. Ces expériences suggèrent un nouveau mécanisme de présentation contrôlée d antigènes sous forme associées aux SIgA. 1b. Modulation de l activation des cellules dendritiques des plaques de Peyer murines par les SIgA Les SIgA sont considérées comme des molécules d anticorps possédant des propriétés anti-inflammatoires. Nous avons administré par voie orale dans des souris l adjuvant muqueux classique qu est la toxine cholérique (CT) et comparé son effet avec les SIgA. Alors que la CT induit la migration des cellules dendritiques des PP et l induction à leur surface des marqueurs CD80 et CD86, les SIgA conduisent plutôt à la rétention des cellules dendritiques dans la PP, et montrent une cinétique d activation des marqueurs CD 80/86 nettement retardée. Ces données indiquent que les SIgA ciblant les cellules dendritiques les maintiennent dans un état de réponse faible, expliquant au niveau moléculaire pourquoi lces anticorps sont considérés comme anti-inflammatoire. Ces observations suggèrent également un rôle des SIgA dans l homéostase des membranes muqueuses. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 14 / 36

1c. Etude des interactions des IgA de sécrétion avec les cellules dendritiques des plaques de Peyer Les plaques de Peyer (PP) représentent le site d entrée majeur des pathogènes au niveau des muqueuses intestinales. Après avoir traverser la barrière muqueuse, l antigène est pris en charge par des cellules hautement spécialisées: les cellules dendritiques (DC). Ces dernières activent d autres cellules, les cellules T, qui à leur tour activent les cellules B, qui se différencient en plasmocytes sécrétant des anticorps de nature IgA polymérique. Ces derniers sont transportés au niveau de la lumière intestinale où ils se retrouvent associés à la pièce secrétoire (SC) sous form d IgA de sécrétion (SIgA). Des travaux effectués par notre équipe ont démontré que les SIgA, une fois se trouvant dans la lumière intestinale, peuvent être rétro-transportées vers l intérieur des PP, et peuvent de lier de manière préférentielle aux DC. Le rôle biologique de l interactions entre les SIgA et les DC des PP est inconnu. La caractérisation des DC des PP a permis d identifier un nouveau sous-type de DC exprimant le marqueur de surface CD19. La nature des interactions entre SIgA avec les divers types de DC isolées des PP de l intestin de souris est étudiée biochimiquement afin d examiner la contribution de SC et IgA à cette liaison. L effet d internalisation de SIgA par les DC sur leur maturation est analysée en présence et absence d antigène. 1d. Induction de tolérance au lait de vache par administration orale de bactéries lactiques recombinantes L allergie au lait de vache est fréquemment associée à une réponse immune inappropriée à la beta-lactoglobuline (BLG). Un rééquilibrage de cette réponse, correspondant à un état de tolérance, peut être induit par administration orale de formules lactées hypoallergéniques. La présente étude a pour but le développement de souches recombinantes de bactéries lactiques exprimant tout ou partie de la BLG, puis l évaluation de leur potentiel d induction d une tolérance spécifique chez le rat ou la souris, par relargage de cette protéine sur la muqueuse intestinale. Des souches de Lactococcus lactis, produisant à la fois à leur surface et dans le surnageant de culture la BLG sous forme d une fusion avec une protéine bactérienne, ont été obtenues. La caractérisation de ce produit de fusion a permis de mettre en évidence sa très faible immunoréactivité, comparée à celle de la BLG native, vis-à-vis d anticorps IgE obtenus à partir de rats sensibilisés à la BLG. En outre, ce produit mis au contact de mastocytes de rats sensibilisés avec des IgE anti-blg s est avéré provoquer un rela rgage de médiateurs chimiques nettement moindre que la BLG native, confirmant ses propriétés hypoallergéniques. Des expériences visant à évaluer les effets prophylactiques de l administration orale de ces souches de L. lactis sur la réponse hypersensible à la BLG sont en cours. 1e. Vaccination par ADN pour le traitement de l allergie La prévalence des allergies dans la population est d environ 20% et va probablement continuer à augmenter les prochaines années. L allergie au venin d abeille est particulièrement dangereuse, du fait de danger de choc anaphylactique mortel. La désensibilisation dure plusieurs années et implique l injection de doses croissantes d allergènes du venin d abeille. Ce traitement est très lourd et très pénible pour les patients. C est pourquoi la vaccination ADN pourrait apporter une solution pour soulager les patients et réduire la durée du traitement. Nous avons pu montrer que l injection d ADN à des souris sensibilisées à la PLA2 (un des allergènes majeur du venin d abeille) diminue la réponse allergique (Th2) au profit d une réponse de type Th1 avec diminution du risque de choc anaphylactique. De même, un traitement préventif de ces souris avec de l ADN diminue leur réponse allergique. Le seul inconvénient de cette approche est le mode d administration. En effet, l ADN est très instable in vivo et est rapidement degradé IAL rapport annuel 2002, RP/rg 15 / 36

après injection. C est pourquoi, nous nous sommes intéressés aux microparticules biodégradables comme carrier pour l ADN. L encapsulation de l ADN dans ces microparticules permet (1) la protection de l ADN in vivo; (2) le relarguage progressif de l ADN dans les tissus après injection; (3) le ciblage non-spécifique des cellules présentatrices de l antigène par phagocytose. Nous avons pu montrer in vitro que les microparticules pouvaient être très facilement phagocytées par des cellules dendritiques (DC) et que la phagocytose de ces microparticules s accompagne d une maturation des DC. La prochaine étape est l injection de l ADN codant pour la PLA2 encapsulé dans des microparticules de manière prophylactique. Après sensibilisation des souris, la réponse immune sera analysée pour déterminer si les microparticules ont un effet adjuvant en comparaison avec l ADN nu. F. Spertini Deux lignes d'intérêt : d'une part l étude des mécanismes d'activation cellulaire T (via MHC class II ou CD45) et de la régulation de l expression de cytokines proinflammatoires; d'autre part un intérêt pour l'immunothérapie et la vaccinologie, avec en particulier dans le domaine de l'allergologie le développement d'une immunothérapie basée sur les peptides d'allergènes. Ces 2 axes de recherche ont été supporté par les sources de fonds suivantes : 1. Induction of tolerance via the nasal mucosa in a murine model of allergy: analysis of molecular and cellular mechanisms, FNS 059482. C. Barbey In a murine model of systemic allergy to OVA, we analyzed the prophylactic effect of INT on the development of an allergic response, using either the OVA protein or the major T- cell epitope OVA 323-339. Our data showed that prophylactic INT with high doses of OVA induced T-cell tolerance toward subsequent OVA s.c. immunizations, inhibiting the OVA specific T-cell proliferation as well as the IgE and IgG1 production. In contrast, INT performed with OVA 323-339 had no effect on the allergic parameters studie d. In vivo analysis of transferred OVA 323-339 specific TCR transgenic KJ1-26 + T-cells (from naive D011.10 mice) in the cervical, inguinal, bronchial lymph nodes (CLN, ILN and BLN respectively) and in the spleen of BALB/c recipients revealed significant differences in pattern of T-cell distribution in local or systemic lymphoid organs. Indeed, OVA INT preferentially induced long term local activation of KJ1-26 + T-cells in BLN, whereas OVA 323-339 INT activated them in all lymphoid organs tested. In vivo experiments with CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) labeled KJ1-26 + T-cells showed that 4 days post INT, OVA 323-339 induced faster cell division cycles as compared to OVA in BLN. Only OVA INT induced detectable IL-10 secreting CD4 + T-cells, whereas DC were secreting IL-10 in both groups. However, a significantly higher proportion of myeloid type CD11c + DC were isolated from BLN of OVA treated mice than of OVA 323-339 treated mice (majority of lymphoid type DC). Altogether, we conclude from these data that INT with OVA, associated with a local (BLN) cell activation, was inducing an effective systemic tolerance in contrast to INT with OVA 323-339 immunodominant peptide. This suggests that INT with OVA was locally creating an environment capable of inducing IL-10 secreting Treg, and profoundly affecting OVA specific T-cell tissue distribution. Further characterization and mechanisms of induction of the IL-10 + CD4 + T-cell subset and related DC will be a primary objective of this proposal.. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 16 / 36

2. Mechanisms of tolerance to allergen via the respiratory mucosa : Induction of regulatory T-cells and role of dendritic cells. C. Longaretti Allergic asthma is a major complication of atopy characterized by airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness (BHR). Bronchial mucosa is infiltrated by various cell subpopulations, including mast cells, eosinophils and TH2 type lymphocytes. Asthma severity correlates with the presence of activated T lymphocytes and eosinophils in the bronchoalveolar lavage (BAL). As mentioned above, we have previously shown that uptake of high amount of antigen via the nasal route can induce tolerance and reverse the allergic phenotype in models of systemic allergy to PLA2. To evaluate the possibility to induce tolerance in a model of airway inflammation and to determine the cellular and molecular mechanisms underlying T-cell tolerance induction in this setting, we established the following strategy (Fig. 2): 1) sensitization phase : airway inflammation was induced in BALB/c mice first sensitized to OVA by two intraperitoneal injections of alum-adsorbed OVA followed by three aerosols of 0.25% OVA. 2) tolerance induction : to evaluate the possibility to induce tolerance, mice were treated intranasally with doseranging amount of OVA once a week for 2 to 3 weeks. 3) challenge phase : mice were finally challenged by three inhalations of aerosolized OVA 0.25% every other day. Exposure of OVA sensitized mice to aerosolized OVA induced a strong eosinophil and CD4 + T-cell recruitment into BAL as compared to mice exposed to aerosolized PBS as control. Ex vivo, T-cells isolated from spleen and lymph nodes proliferated vigorously upon OVA stimulation. ELISA assays demonstrated an increase in IgE and IgG1 titers, typical of a TH2 pattern of response. INT with OVA reduced drastically cell recruitment into the bronchial lumen with major effects on eosinophils and abrogated OVA specific serum IgE. T-cell proliferation was limited in a dose-response dependent manner in BLN, but not in the spleen. Anti-OVA IgG1 in contrast increased, and specific IgG2a remained unchanged. BAL and lung T-cell TH2 cytokines were down-regulated. Preliminary analysis indicate the presence by intracellular staining and FACS analysis of IL-10 + T- cells in OVA treated group (from BLN) and concomitant down-regulation of BHR. Overall OVA INT led to abrogation of bronchial inflammation and bronchial hyperreactivity with IgE modulation, but without the typical TH1 deviation that was expected. These results strongly suggested that this asthma model was susceptible to immune modulation by applying OVA to the nasal mucosa, and could offer the necessary conditions to analyze the mechanisms of tolerance to allergen in an ongoing lung inflammatory condition. The potential generation of Treg and the role of DC will be a major focus of our research. b) Recherche clinique i. Allergologie, immunothérapie/vaccination Evaluation of the merozoite antigen MSP-3 as a malaria vaccine candidate (in collaboration with the European malaria vaccine initiative) (R. Audran, G. Corradin, P. Druilhe, F. Spertini). Evaluation of the PfCS102 long synthetic peptide from P. Falciparum circumsporozoite molecule as a malaria vaccine candidate (in collaboration with Dictagène, Lausanne) (R. Audran, F. Spertini). Comparison of 2 novel antihistamines L-cetirizine and desloratadine in a nasal provocation test with allergen (C. Deruaz and F. Spertini). Allergens and energy savings, HOPE EU (contract ENK6-CT-2001-00505) in collaboration with EPFL (F. Spertini). IAL rapport annuel 2002, RP/rg 17 / 36

ii Infection à HIV G. Pantaleo 1. Etude multicentrique observationnelle afin d évaluer l efficacité ainsi que les effets immunologiques de l association de l IFN PEG et de la Ribavirine sur des patients infectés seulement avec le virus HCV et co-infectés avec l HIV et l HCV qui n ont jamais été traités pour l HCV. D. Ciuffreda, P.-A. Bart en collaboration avec le Pr. J.-J. Gonvers et le Dr. A. Telenti Aujourd hui, on estime à près de 3% la proportion de la population infectée par le virus de l hépatite C. Dans 85% des cas environ, l évolution se fait vers un passage à la chronicité. La vitesse de progression de l hépatite C chronique vers des complications comme la cirrhose ou le cancer du foie, est variable et dépend de plusieurs facteurs: l âge au moment de l infection, le sexe, la consommation d alcool et la co-infection avec d autres virus tels que HBV et HIV. En fait, les virus HCV et HIV ont les mêmes voies de transmission. On a donc observé un pourcentage élevé de co-infections. Plusieurs études ont démontré que la présence d une co-infection engendre, comme caractéristique principale, une progression plus rapide de l histoire naturelle de HCV, avec augmentation de la mortalité due à l apparition subite de la cirrhose du foie. Durant ces dernières années, on a pu observer une augmentation certaine de l espérance de vie pour les patients infectés par le virus HIV, grâce à l introduction de HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy). Dès lors, on se doit de se préoccuper maintenant de maladies qui n entraient pas en ligne de compte auparavant, en raison de la faible survie des patients atteints du SIDA. Ces maladies concomitantes peuvent même se manifester après plusieurs années, et diminuer ainsi à nouveau l espérance de vie des patients souffrant d une infection par le HIV. Il a été démontré que le traitement HAART seul ne peut arrêter la progression de l hépatite C, et n arrive pas à diminuer les niveaux de HCV-RNA (virémie HCV). De ce fait, la présence simultanée des deux virus donne des problèmes de deux types: HCV menace la santé des patients non seulement de par les complications dues directement à ce virus (apparition rapide d une cirrhose par exemple) mais également en raison de l atteinte fonctionnelle du foie, obstacle important à l utilisation de médicaments antirétroviraux, susceptibles d engendrer une forte toxicité sur le foie. De plus, plusieurs études commencent aussi à démontrer une corrélation inverse entre le nombre de CD4 et la virémie HCV, comme si la présence de HCV empêchait la restauration immunitaire durant une thérapie antirétrovirale. Des résultats préliminaires montrent une réponse soutenue à «long terme» suite à la combinaison de l Interféron et de la Ribavirine sur les patients co-infectés comme pour les patients infectés seulement par HCV. De plus la disponibilité du nouveau IFN PEG peut augmenter les chances d éradication du virus HCV, aussi chez les patients HIV. L étude s avère par conséquent très importante en ce qui concerne les dynamiques relatives entre les deux virus et entre les influences réciproques de la HAART et de la thérapie pour HCV. Il faut également identifier les facteurs acquis favorisant la progression de la maladie de même que standardiser le traitement anti-hcv pour les patients souffrant de HIV. Une étude multicentrique observationnelle est par ailleurs prévue dans notre Division afin d évaluer l efficacité ainsi que les effets immunologiques de l association d IFN PEG et de Ribavirine sur des patients infectés seulement par le virus HCV et co-infectés par HIV et HCV, n ayant jamais été traités pour HCV (patients «naïfs»). Les critères d inclusion sont des niveaux de transaminases (ALAT) augmentés, une virémie positive pour HCV et une histologie montrant des signes d hépatite chronique avec fibrose (Score de Métavir > A1F1). La durée de l étude est de 24 semaines (48 semaines pour les génotypes HCV 1 et 4) avec un suivi («follow up») de 24 semaines. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 18 / 36

L étude prévoit d inclure 200 patients, dans 3 bras différents: les patients monoinfectés par HCV (100 patients). 50 patients positifs pour HIV et HCV (co-infectés) naïfs de toute thérapie antirétrovirale. 50 patients positifs pour HIV et HCV (co-infectés) sous traitement antirétrovirale. Les objectifs primaires de l étude sont d analyser l impact de la thérapie anti-hcv sur des groupes différents de patients, et d établir les avantages de la thérapie anti-hcv avant le début de la thérapie anti-hiv permettant ainsi d établir le «time point» optimal pour le début de la thérapie anti-hcv. De plus, cette étude devrait permettre d estimer l importance de certains facteurs prédictifs d une réponse, comme HCV-RNA et HIV-RNA, les niveaux de CD4 «préthérapie», le génotype, et l apparition d effets secondaires dans les différents groupes traités, et d évaluer la progression du dysfonctionnement du foie durant le traitement. 2. Traitement de la primo-infection au VIH par la cyclosporine A en combinaison de la thérapie antirétrovirale active. P. Rizzardi, M. Khonkarly, P-A. Bart Une caractéristique importante de la primo-infection au HIV est l'hyperactivation immunitaire durant laquelle les cellules T CD4+ activées et en phase prolifération sont les cibles et les foyers de réplication du HIV. Nous avons testé l'efficacité de la cyclosporine A (CsA) en combinaison avec une thérapie antirétrovirale (HAART) durant la primoinfection HIV, ainsi que son effet immuno-modulateur sur des paramètres virologiques et immunitaires durant 64 semaines de suivi. Observations: La suppression de la réplication virale était comparable dans les 2 groupes (groupe sous traitement HAART + cyclosporine versus groupe HAART seul). L'administration de CsA a induit une augmentation drastique - dès la première semaine - du nombre ainsi que du pourcentage de CD4. Cette augmentation a perduré et ces valeurs sont restées plus élevées dans le groupe traité par HAART + CsA. L'administration de CsA n'a pas eu d'effet négatif sur les réponses CD4 et CD8- spécifiques au HIV. Au contraire, après 48 semaines de traitement, la fréquence de cellules CD4 effectrices (sécrétant de l'ifn-γ) était supérieure dans le groupe ayant reçu de la CsA. Conclusions: L'atténuation de l'hyperactivation immunitaire par l'administration de CsA durant la primo-infection au HIV a montré des effets très bénéfiques sur la reconstitution immunitaire et pourrait s'avérer être encore plus profitable à long terme. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 19 / 36

iii Autoimmunité 1. Evaluation of a new automated fluorescence immunoassay for the detection of dsdna antibodies I. Graf Pisler, F. Spertini, V. Aubert,, CHUV); Pharmacia Diagnostic Le test de la maison Pharmacia anti-dsdna développé sur l automate UniCAP (technique FEIA) a été évalué par comparaison avec la recherche des anticorps antinucléaires (ANA) par immunofluorescence indirecte (IF) sur les cellules Hep-2, le dosage des anti-dsdna par EIA de la maison INOVA et la recherche des anti-dsdna par IF sur lames Crithidia luciliae.120 échantillon provenant de notre sérothèque ont été étudiés. Ce travail a démontré une spécif icité élevée du test de Pharmacia proche de celle obtenue avec les lames Crithidia luciliae. Ce nouveau test peut être utilisé comme test de confirmation dans le sérodiagnostique du LED. Même si la sensibilité du test sur UniCAP apparaît légèrement inférie ure à celle obtenue avec la méthode ELISA classique, les résultats obtenus sur des séquences d échantillons obtenues de 5 patients correspondent parfaitement à l évolution clinique. Le dosage de l anticorps anti-dsdna sur l automate UniCAP a l avantage d être automatisable et se profile comme une bonne alternative au monitoring des patients lupiques. 2. Evaluation of a ELISA test for the determination of anti-actin antibodies in autoimmune hepatitis. I. Graf Pisler, F. Spertini, V. Aubert, CHUV; Ruwag AG Le test EIA de la maison INOVA commercialisé par la maison Ruwag a été évalué sur un panel de 235 échantillons de sérum provenant de différentes pathologies et les résultats obtenus comparés avec la recherche des anticorps anti-muscles lisses (ASMA) par immunofluorescence indirecte (IF) sur des coupes de reins et estomac de souris (lames MSK, mouse stomach kidney). La sensibilité des anticorps anti-actine (68.5%) s est avérée être légèrement inférieure à celle des anticorps anti-muscles lisses (71.4%). Par contre la spécificité des anti-actine est bien supérieure (83.5%) à celle des anti-muscles lisses (43%). La valeur prédictive négative de 93.8% des anticorps anti-actine donne toute sa valeur à ce test comme test de confirmation. (publication en cours) c) Thèses Supervision par G. Pantaleo des travaux de thèse de: - Mme Aude Chapuis: Effects of mycophenolic acid on human immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo. Aude G. Chapuis, G. Paolo Rizzardi, Claudia D Agostino, Antoine Attinger, Christian Knabenhans, Sylvain Fleury, Hans Acha-Orbea, Giuseppe Pantaleo Nature Medicine 6, 762-768 (01 July 2000). - M. Alexandre Harari: Investigation of HIV-1 immunopathogenesis in animal models and in humans. - Mme Simone Zimmerli, travail de diplôme en biologie : Capacité proliférative des différentes populations de cellules T CD8 mémoires spécifiques au cytomegalovirus. IAL rapport annuel 2002, RP/rg 20 / 36