Récepteurs de type Toll, réponse inflammatoire et sepsis Toll like receptor, inflammatory response and sepsis

Réanimation 13 (2004) 167 175 www.elsevier.com/locate/reaurg Mise au point Récepteurs de type Toll, réponse inflammatoire et sepsis Toll like receptor, inflammatory response and sepsis O. Huet a, G. Choukroun a,b, J.-. Mira a,b, * a Service de réanimation médicale, CHU Cochin Saint-Vincent-de-aul, assistance publique hôpitaux de aris, 27, rue du Faubourg-Saint-Jacques, 75679 aris cedex 14, France b Institut Cochin, 22, rue Méchain, 75014 aris, France Accepté le 7 février 2004 Résumé L immunité innée, décrite dès le XIX e siècle par Elie Metchnikoff, constitue la première ligne de défense de l organisme. La découverte récente des récepteurs de type Toll (TLR : Toll Like Receptor), une famille de récepteurs présents aussi bien chez les mammifères que les insectes ou les plantes, représente une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires de l interaction hôte pathogène. Les TLRs sont des récepteurs transmembranaires exprimés par les cellules de l immunité innée, comme les monocytes macrophages ou les cellules dendritiques, couplés à une voie de transduction du signal aboutissant à l activation du facteur de transcription nucléaire NF-jB. Les TLRs peuvent reconnaître des structures moléculaires hautement conservées associées aux pathogènes et initient ensuite la réponse immune et la réponse inflammatoire systémique. Ainsi, TLR4 reconnaît le lipopolysaccharide de la paroi des bactéries à Gram-négatif. Bien que leur rôle dans la physiopathologie du sepsis reste mal compris, les récepteurs de type de Toll constituent de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans la prise en charge des états inflammatoires graves qui compliquent parfois les infections microbiennes. 2004 Société de réanimation de langue française. ublié par Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstact The innate immune response, which was firstly described by Elie Metchnikoff over a century ago, is the first line of defense against infectious diseases. The recent discovery of a family of receptors shared by mammals, insects and plants, the Toll-like receptors (TLRs), has revealed new insights on the molecular events initiated by the host pathogen interaction. TLRs are transmembrane receptors, mainly expressed by the immune cells, such as monocytes, macrophages or dendritic cells, which may lead to NF-jB activation. Toll like receptors recognize highly conserved molecular patterns associated with microbial pathogens to initiate the systemic inflammatory immune response. For example, TLR4 detects the lipopolysaccharide (LS) of Gram-negative bacteria wall. Since their role in the pathogenesis of sepsis and septic shock is not clearly understood, the discovery of the TLRs provides new potential targets to counteract the pro-inflammatory systemic response that complicates microbial infections. 2004 Société de réanimation de langue française. ublié par Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Récepteurs de type Toll ; Immunité innée ; Sepsis Keywords: Toll like receptors; Innate immunity; Sepsis 1. Introduction Les infections graves restent actuellement une des premières causes de mortalité dans le monde malgré les progrès * Auteur correspondant. Adresse e-mail : jean-paul.mira@cch.ap-hop-paris.fr (J.-. Mira). 2004 Société de réanimation de langue française. ublié par Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.reaurg.2004.02.002 effectués tant dans la prévention (hygiène, vaccination) que dans le traitement (antibiotiques, antiviraux) de ces pathologies. Lorsque le sepsis (association d un foyer infectieux et d une réaction inflammatoire systémique), s accompagne d une défaillance d organe il répond à la définition de sepsis sévère. Aux États-Unis cette forme clinique grave des états infectieux affecte 750 000 personnes par an et est responsa-

168 O. Huet et al. / Réanimation 13 (2004) 167 175 ble de plus de 220 000 morts par an [1]. our faire face à ce problème majeur de santé publique d importants moyens de recherche sont mis en œuvre visant à mieux comprendre les différentes étapes de l invasion microbienne et les mécanismes physiologiques qui régulent la réaction de l hôte vis-àvis d une agression par un agent pathogène [2]. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires de défense pourrait permettre non seulement de développer de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques mais aussi d expliquer les différences de réaction observées entre différents individus exposés à un même agent pathogène (domaine de l immunogénétique). La découverte récente des récepteurs de type Toll et l identification de leur rôle majeur dans la reconnaissance de l agent pathogène, le déclenchement de la réponse immune innée et l initiation de l immunité adaptative constituent la principale avancée des cinq dernières années dans le domaine de l immunité anti-infectieuse [3]. 2. Immunité innée Lors de l infection par un agent pathogène, l hôte possède deux armes pour se défendre : l immunité innée et l immunité adaptative. La réponse adaptative est le résultat de la sélection de clones lymphocytaires qui se sont différenciés après présentation par les cellules dendritiques de déterminants antigéniques provenant de la dégradation des agents pathogènes à l intérieur des phagolysosomes. Cette réponse adaptative donne naissance à une défense puissante dirigée contre un agent pathogène spécifique et ceci tout au long de la vie. Cette réponse acquise qui repose sur la prolifération de lymphocytes B et T et la synthèse d anticorps met trois à cinq jours à se développer et à être active lors de la première rencontre entre l hôte et le pathogène [4]. Lors des expositions suivantes, cette réponse spécifique est plus rapide (2 jours) et plus puissante. À l inverse de la réponse immune adaptative, présente seulement chez les vertébrés, l immunité innée existe chez tous les organismes multicellulaires sous une forme relativement conservée au cours de l évolution, n est pas dirigée contre un agent pathogène en particulier et ne conduit pas à une «mémoire» immunologique. La propriété principale de la réaction immunitaire innée tient dans sa capacité à fournir une réponse rapide, quasi-immédiate, agissant directement sur l agent pathogène sans mise en jeu de la réaction d induction ou de maturation lymphocytaire. La reconnaissance de composants de l organisme pathogène est la pierre d achoppement de cette réponse immune innée. Afin de ne pas être délétère elle doit pouvoir reconnaître à coup sûr le pathogène tout en épargnant le «soi» [5]. Ainsi durant l évolution certains déterminants moléculaires des pathogènes ont été sélectionnés pour être reconnus de façon certaine. Janeway, immunologiste américain, leur a donné le nom de AMs, initiales de athogen Associated Molecular atterns. Tableau 1 Motifs moléculaires associés aux pathogénes (AM) et TLR correspondant AM athogènes TLR LS Bacilles à Gram-négatif TLR4 Lipoprotéines Eubactéries TLR2 eptidoglycane Bacilles à Gram-positif TLR2 Acide lipotéichoïque Bacilles à Gram-positif TLR2 ± TLR6 Lipoarabinomannane Mycobactéries TLR2 Glycolipides Tréponèmes TLR2 Zymosan Levures TLR2 Flagelline Bactéries à flagelles TLR5 ADN (CpG non méthylé) La plupart des agents bactériens TLR9 Les AMs répondent à différents critères : ils sont spécifiques des pathogènes et n ont donc pas d équivalence chez l hôte (protection du soi) ; ce sont des structures indispensables à la survie et/ou au caractère invasif des micro-organismes, diminuant ainsi la possibilité d une mutation aléatoire rendant le pathogène indétectable ; ils représentent la signature moléculaire de groupes de micro-organismes, ainsi le lipopolysaccharide est une des caractéristiques des bactéries Gram-négatif, et l ARN double brins signe la présence de particules virales (Tableau 1). Un des avantages immédiats de la sélection de ces «marqueurs» par le système immunitaire inné est de limiter le nombre de récepteurs nécessaires à la reconnaissance des envahisseurs. Ces récepteurs sont nommés RRs (attern Recognition Receptors) et sont les acteurs de l initiation de la réponse innée. Il existe deux grandes classes de RRs : les RRs solubles sont des molécules plasmatiques qui se lient aux pathogènes soit pour les opsoniser permettant alors leur phagocytose, soit pour les détruire directement. Les plus étudiés des RRs solubles sont les constituants du complément, les protéines de la famille des collectines (Mannose Binding Lectin et les protéines A et D du surfactant), la protéine liant le LS (ou LB : LS Binding rotein) et les peptides antimicrobiens (défensines, cathélicidines,...) [6] ; les RRs membranaires sont présents à la surface des cellules de l immunité innée mais aussi de certaines cellules épithéliales. Ils permettent la reconnaissance des pathogènes, et leur phagocytose (CD14, récepteur au mannose et scavanger receptor) sans induire de réaction inflammatoire. Il a fallu attendre la fin des années 1990 pour que soit identifiée une famille de récepteurs membranaires capable d induire, en réponse à la détection du micro-organisme, une cascade de signalisation intracellulaire aboutissant à la transcription de gènes de l inflammation tels que TNF-a et IL-6. Ces récepteurs sont les récepteurs de type Toll (Toll Like Receptors ou TLRs) dont le rôle essentiel dans la défense anti-infectieuse a été décrit initialement chez la drosophile [7].

O. Huet et al. / Réanimation 13 (2004) 167 175 169 3. Les récepteurs de type Toll 3.1. Récepteur Toll et réponse immune chez la drosophile La drosophile (ou mouche à vinaigre), comme tous les insectes, ne possède pas de système immunitaire adaptatif. Il revient donc au système immunitaire inné de circonvenir et d éradiquer toute infection microbienne. Chez la drosophile une famille de récepteurs, dont le principal membre est le récepteur Toll, joue un rôle essentiel dans cette réponse anti-infectieuse. Le récepteur Toll est un récepteur membranaire de type I qui possède plusieurs fonctions. Il avait été initialement décrit dans le développement embryonnaire où il intervient dans le contrôle de la polarisation dorsoventrale de la larve. Sa découverte fortuite est à l origine de son nom (Toll signifiant «super» «génial» en allemand) et a valu le prix Nobel au Dr Nusslein-Volhard. Secondairement, le groupe de Jules Hoffman à Strasbourg a découvert l importance de ce récepteur dans la défense antimycotique chez cet insecte, et a été clairement à l origine du regain d intérêt de nombreuses équipes de recherche sur l immunité innée. Ainsi, le rôle de la voie de signalisation de Toll chez la drosophile adulte a d abord été étudié dans la réponse aux infections fongiques. Il a été montré qu une délétion de Toll ou d un des éléments de sa voie de signalisation entraînait une surmortalité liée à un défaut de synthèse d un peptide antimicrobien appelé drosomycine [7]. La découverte d autres récepteurs similaires à Toll et la démonstration de leur rôle respectif dans la distinction des différents pathogènes et la synthèse de peptides antimicrobiens spécifiques de l agresseur, a définitivement confirmé l importance de cette famille de récepteurs dans l immunité innée des insectes [8]. La découverte de récepteurs humains homologues au Toll de la drosophile a permis d étendre ces conclusions aux mammifères. De plus, la signalisation intracellulaire de Toll chez la drosophile est très proche de la voie de signalisation qui relie le récepteur de l interleukine-1 (IL-1) au facteur de transcription nucléaire NF-jB chez les mammifères. Cela a été à l origine de grandes avancées dans la compréhension de la réponse immune anti-infectieuse chez l homme. 3.2. Récepteurs de type Toll chez les mammifères (Fig. 1) Les homologues de Toll chez l homme sont appelés récepteurs de type Toll (TLRs : Toll Like Receptors). Actuellement dix récepteurs de type Toll ont été décrits (TLR1-TLR10) [3]. Ces récepteurs sont de type transmembranaire et ont une structure semblable à celle du récepteur Toll de la drosophile : un domaine extracellulaire composé de la répétition de motifs riches en leucine (22 pour TLR4), une courte portion transmembranaire et un domaine intracellulaire qui comporte une forte homologie avec le récepteur à l IL-1 par l intermédiaire d un domaine commun à tous les membres de cette famille, le domaine TIR (Toll/Interleukine-1 receptor domain) (Fig. 2). Ce domaine TIR a été remarquablement conservé au cours de l évolution [9] et induit une réponse Fig. 1. TLR : Schéma général. anti-infectieuse aussi bien chez les plantes et les insectes que chez les mammifères. Les TLRs diffèrent essentiellement par leur domaine extracellulaire, c est-à-dire la partie directement impliquée dans la reconnaissance et la fixation du AM. Ainsi, TLR2 et TLR4, qui sont deux récepteurs majeurs dans la défense antibactérienne, ne possèdent que 24 % d homologie au niveau de leurs domaines extracellulaires. 3.3. Ligands des récepteurs de type Toll Après la découverte du rôle essentiel des TLRs dans la défense anti-infectieuse, le clonage rapide des dix membres de cette famille a posé le problème de l identification des ligands de chacun de ces récepteurs. De nombreux travaux ont permis au cours des trois dernières années de réaliser des progrès magistraux dans ce domaine en utilisant soit des modèles cellulaires (transfection du récepteur et analyse de la réponse cellulaire à différents agonistes), soit des modèles animaux (souris «knock-out»). Ces études ont aussi permis de mieux définir les composants des agents microbiens responsables de leur pathogénicité (Tableau 1). 3.3.1. TLR4, récepteur au LS Le LS (lipopolysaccharide) ou endotoxine est une protéine constitutive de la paroi des bacilles Gram-négatif (BGN) qui est connue pour jouer un rôle prépondérant dans l apparition et le développement d un état de choc lors d infections à ces bactéries. Le LS est couramment utilisé dans les modèles expérimentaux de choc septique (endotoxinique) car son injection reproduit l ensemble des signes cliniques et conséquences biologiques observés au cours de ce type de choc : fièvre, hypotension, lésions tissulaires et défaillances d organes. Lorsque le LS est libéré dans l organisme, il peut se fixer sur une protéine synthétisée par le foie : la LB (LS Binding rotein), qui permet sa présentation à un récepteur membranaire, le CD14. L importance de ces deux protéines, LB et CD14, dans la réponse cellulaire induite par le LS a été définitivement mise en évidence à l aide de souris knockout pour chacune de ces protéines. Il a ainsi été montré que l injection d une dose de LS habituellement létale chez la souris, est sans effet chez des souris qui n expriment pas la LB ou le CD14 [10,11].

TOLLI TAK-1 TAK-1 170 O. Huet et al. / Réanimation 13 (2004) 167 175 LB LS IL-1RI MD2 IL-1RAcp MyD88 MyD88 cytoplasme TRAF6 IRAK-1 TAB1 TAB2 IRAK-1 TRAF6 IRAK-1 IRAK-4 TRAF6 TAB1 TAB2 Uev1A Udc13 IKK IKKa IKK-g IkB 65 60 MKK3,4,5 JNK 38 65 50 Noyau Fig. 2. Voies de signalisation de IL1R/TLR conduisant à l activation de NF-jB. (1) La fixation du ligand sur IL1R entraîne le recrutement de MyD88 via une interaction TIR-TIR. Myd88 permet le rapprochement d IRAK-4 au complexe récepteur. De façon concomitante la formation du complexe Tollip/IRAK-1 permet à celui-ci de se fixer à MyD88 via son Death Domain (DD). Grâce à l interaction IRAK-1/IRAK-4, IRAK-4 peut phosphoryler IRAK-1, entraînant son activation. TRAF-6 va interagir de façon transitoire avec le complexe par l intermédiaire de la forme activée d IRAK-1. (2) Le complexe phospho-irak-1/traf-6 se détache du complexe récepteur pour ensuite interagir avec le complexe membranaire constitué par TAK1, TAB1 et TAB2, entraînant leur phosphorylation et leur translocation dans le cytosol. IRAK-1 reste au niveau membranaire où elle va être dégradée. (3) Dans le cytosol le complexe multimérique composé par TRAF-6/TAK1/TAB1/TAB2 va interagir avec les ligases ubiquitine Ubc13 et Uev 1A. Ceci permet l ubiquitination detraf-6 indispensable à l activation de TAK-1. (4) Une fois activée TAK-1 phosphoryle le complexe IKK et certaines MA kinase kinases (MKK) spécifiques. IKK dégrade l inhibiteur I-jB de NF-jB en le phosphorylant. NF-jB ainsi libéré, migre dans le noyau où il va interagir avec des promoteurs spécifiques. Les MKKs activées vont à leur tour activer des MA-kinases de la famille JNK/38 conduisant à l activation d autres facteurs transcriptionnels tel que c-jun et c-fos. Néanmoins, malgré l importance prouvée de ces deux protéines dans la reconnaissance et la présentation du LS, aucune d entre elles n a d action directe sur la signalisation intracellulaire induite par le LS. Ainsi, le récepteur CD14, qui est une protéine ancrée sur le versant externe de la membrane cytoplasmique par une queue lipidique lui conférant une grande mobilité (GI-anchored protein), ne possède pas de domaine cytosolique susceptible d induire une signalisation [12]. Durant ces 20 dernières années de nombreux groupes ont recherché le «co-récepteur» du CD14 capable d activer les cellules. L étude génétique de deux lignées murines naturellement résistantes au choc endotoxinique (les souris C3H/HeJ et C57BL10/ScCR) a permis d expliquer par quel mécanisme se fait la transduction du signal lorsque CD14 se trouve en présence de LS [13]. Chez ces souris, le gène défectueux a été localisé au niveau du chromosome 4 et identifié comme étant TLR4 (Fig. 3). Les mutations responsables de la résistance au LS ont été caractérisées : les souris C3H/HeJ contiennent une mutation ponctuelle (proline histidine) dans le domaine TIR de TLR4 responsable de la synthèse d un récepteur inactif ; les souris C57BL10/ScCR présentent une mutation non-sens qui bloque totalement l expression de TLR4 [14]. Ainsi l absence ou l inactivation de TLR4 supprime totalement la sensibilité au LS. Néanmoins, si la présence de TLR4 est nécessaire pour induire un signal cellulaire, elle n est pas suffisante. La transfection du gène tlr4, dans des cellules qui ne l expriment pas naturellement, ne restaure pas la réponse au LS. Une deuxième protéine appelée MD2 est nécessaire. Ainsi lorsque le gène de MD2 est co-transfecté avec celui de TLR4, les cellules deviennent totalement réactives à l endotoxine [15]. TLR4, MD2 et CD14 forment le complexe de reconnaissance du LS (LS-recognition complex) [16]. Des souris knock-out (KO) TLR4 (TLR4 / ) ont été créées confirmant définitivement que la présence de TLR4 est nécessaire dans la voie de signalisation du LS [17]. Ces preuves directes du rôle majeur de TLR4 dans l activation cellulaire par le LS ont été retrouvées chez l homme chez

O. Huet et al. / Réanimation 13 (2004) 167 175 171 Fig. 3. Récepteurs de l endotoxine : étapes aboutissant à la signalisation intracellulaire. La formation du complexe LS-LB (LS binding protein) permet la fixation à CD14 au niveau de la membrane cellulaire. Ce complexe va s associer avec MD2-TLR4 pour activer les voies de signalisation de ce récepteur. qui la présence d une mutation dans la partie extracellulaire de TLR4 est responsable d une insensibilité au LS inhalé [18]. TLR4, en collaboration avec CD14, pourrait aussi être impliqué dans la défense immune innée contre certains virus comme le virus respiratoire syncytial (VRS) [19]. L infection par le VRS est en effet responsable d infections pulmonaires plus prolongées et plus sévères chez les souris déficientes en TLR4 (C3H/HeJ ou TLR4 / ) que chez les souris non mutées. Enfin, d autres ligands de TLR4 ont été rapportés comme les Heat Shock roteins. Cependant, la contamination de ces protéines recombinantes par du LS pourrait remettre en cause cela. 3.3.2. TLR2, le récepteur polyvalent En utilisant une approche similaire à celle employée pour démontrer que TLR4 était le récepteur au LS, il a été rapporté que TLR2 reconnaît différents AMs et détecte ainsi plusieurs classes d agents infectieux. TLR2 apparaît comme le récepteur du peptidoglycane, de l acide téichoïque et des lipoprotéines présents à la surface de bacilles à Grampositif. Il est aussi le récepteur des lipo-arabinomannanes des mycobactéries, des glycopeptides des tréponèmes, et du zymosan composant la paroi des levures [20]. Certains travaux avaient initialement suggéré que TLR2 puisse aussi constituer un récepteur pour le LS qui s est révélé secondairement contaminé par des lipoprotéines [21,22]. Cependant, si l hypothèse de TLR2 comme récepteur de l endotoxine des BGN est définitivement rejetée, il semble que ce récepteur reconnaisse comme ligand le LS d autres micro-organismes comme le spirochète Leptospira interrogans (responsable de la leptospirose) dont le lipide A (portion lipidique du LS) a une structure moléculaire légèrement différente de celle du LS des BGN [23]. Étant donné la relative spécificité des RRs vis-à-vis des AMs, on peut s étonner de la capacité de TLR2 à reconnaître un si large panel de AMs et donc de pathogènes. Les travaux réalisés par les équipes d Aderem [24] et d Akira [25] ont fourni des éléments de réponse à cette question en démontrant que TLR2 possède la capacité de réaliser des homodimères et/ou des hétérodimères notamment avec TLR1 et TLR6. La théorie qui prévaut actuellement est que ces différentes combinaisons associatives permettent à TLR2 non seulement d élargir son répertoire de reconnaissance des AMs mais aussi de mieux préciser le pathogène détecté. Ainsi la reconnaissance de MAL-2 (macrophage activating lipopeptide 2), qui est un lipopeptide de la paroi du mycoplasme, nécessite une collaboration entre TLR2 et TLR6

172 O. Huet et al. / Réanimation 13 (2004) 167 175 alors que la reconnaissance d autres types de lipopeptides ne nécessitent pas la présence de TLR6 [25]. 3.3.3. TLR5, le récepteur des flagelles bactériens La flagelline est le constituant principal du flagelle bactérien qui permet à certains micro-organismes de se mouvoir en milieu aqueux, augmentant ainsi leur pouvoir invasif. L injection de cette protéine purifiée déclenche une réaction immuno-inflammatoire sévère caractérisée par l activation de NF-jB et la stimulation de la NO-synthase inductible. Récemment, le récepteur TLR5 a été identifié comme le récepteur de la flagelline, initiateur des manifestations délétères consécutives à la présence des flagelles des bactéries à Gram-positif ou Gram-négatif [26]. 3.3.4. TLR9 et l ADN bactérien La stimulation des macrophages humains par de l ADN bactérien entraîne la libération de cytokines proinflammatoires telles que le TNF-a et l IL-1. De même l ADN bactérien active fortement les lymphocytes et provoque une sécrétion d IL-12 par les cellules dendritiques. Cette production est supérieure à celle obtenue en stimulant les cellules par du LS. Tous ces effets peuvent également être obtenus en stimulant les cellules par de l ADN de virus, de levures ou de nématodes. Ainsi, l ADN des microorganismes pourrait être directement responsable du développement d un état de choc «septique» [27,28]. À l inverse, l injection d ADN purifié provenant d un mammifère, même à très forte dose, est sans effet chez l homme. Cette différence est due à la présence spécifique de motifs CpG méthylés dans l ADN des mammifères. Cette caractéristique moléculaire est absente du matériel génétique des bactéries du fait de l absence d enzyme de méthylation [29]. Ainsi, l ADN bactérien, comme le flagelle précédemment, correspond parfaitement à la définition d un AM : différent du soi, indispensable à la survie ou à l invasivité du pathogène, inducteur d une réaction inflammatoire. Le RR de l ADN bactérien a été identifié en 2000 comme étant TLR9. Alors que les souris TLR2 / et TLR4 / réagissent normalement à l injection d ADN CpG en synthétisant des cytokines pro-inflammatoires, les souris TLR9 / sont insensibles à cette injection [29]. TLR9 a une autre particularité au sein de la famille des TLRs. Il semble être majoritairement localisé au niveau du cytosol des cellules. La reconnaissance de l ADN bactérien nécessite donc préalablement une étape d endocytose [30,31]. 3.3.5. Les autres TLRs La réplication virale au sein de cellules infectées induit fréquemment la synthèse d ARN double-brin capable de stimuler les cellules immunitaires. Les souris TLR3 / mises en présence d ARN double-brin ont une réponse inflammatoire altérée [32]. TLR3 apparaît donc comme un RR probable pour l ARN viral double-brin. lusieurs types de composants chimiques de la famille des imidazoquinolines semblent correspondre à des activateurs potentiels de TLR7. Ces molécules possèdent une activité antivirale et antitumorale qui est médiée par la synthèse de cytokines dont l IL-12 et l interféron-a (IFN-a) après reconnaissance par TLR7 [33]. Ces données suggèrent que TLR7 participe à la détection de l infection virale bien que son ligand naturel reste inconnu [34]. Ainsi à ce jour seuls deux récepteurs de la famille TLR sont orphelins : TLR8 et TLR10. La réalisation de souris KO pour ces deux récepteurs devrait rapidement apporter des réponses à cette question. 3.4. Expression des récepteurs de type Toll Les TLRs sont exprimés à la surface des cellules qui interviennent en première ligne dans la défense antiinfectieuse (macrophages, polynucléaires), sur les lymphocytes B et T et sur les cellules ayant un contact avec le milieu extérieur (cellules épithéliales pulmonaires, cellules digestives, cellules de l épiderme). Les cellules dendritiques qui sont responsables de l initiation de l immunité acquise contiennent un très large répertoire de TLRs. Ceci est probablement en relation avec leur rôle de cellules sentinelles de l immunité. De façon plus surprenante, des cellules non spécialisées dans les phénomènes de détection des pathogènes expriment des TLRs sur leur surface : cellules endothéliales, cardiomyocytes, adipocytes [35]. Le rôle de ces TLRs n est pas encore bien déterminé. Lorsque l immunité innée n est pas stimulée, l expression des TLRs à la surface des cellules est assez faible, de l ordre de quelques milliers pour les monocytes et de quelques centaines pour les cellules dendritiques immatures. Cette expression se trouve modifiée selon l état de stimulation de la cellule [36]. Ainsi l IL-4 qui est une cytokine antiinflammatoire diminue l expression de TLR4. De même, lorsque des cellules sont soumises de façon répétée à des doses non létales de LS il y a une baisse de l expression de TLR4 et de MD2 pouvant expliquer certains phénomènes de tolérance observés. 3.5. Signalisation cellulaire résultant de la stimulation des récepteurs de type Toll Après avoir identifié les récepteurs TLRs et la plupart de leurs ligands, les chercheurs se sont intéressés aux voies de signalisation déclenchées par la rencontre de ces deux partenaires, en particulier celles responsables de la synthèse des médiateurs de l inflammation. Il a été ainsi montré que les TLRs activaient de nombreux facteurs transcriptionnels (NFkB, A-1, CREB, STAT) et les principales kinases de stress. La voie conduisant à l activation de NF-kB a été particulièrement étudiée et il est surprenant de constater que malgré le nombre important de récepteurs et de leurs activateurs, cette voie est non seulement commune à tous les récepteurs, mais a été extrêmement conservée durant l évolution. 3.5.1. Voie de signalisation commune à tous les TLRs impliquant IRAK-1 La voie de signalisation aboutissant à la translocation nucléaire de NF-jB implique la kinase IRAK-1

O. Huet et al. / Réanimation 13 (2004) 167 175 173 (Interleukin-1 Receptor Associated Kinase-1). Elle avait été décrite initialement pour le récepteur à l IL-1 et est commune à tous les récepteurs de la famille Toll. Après avoir été stimulé, le récepteur TLR recrute, au niveau du domaine TIR (Toll Interleukin Receptor domain) de sa partie cytosolique, la protéine adaptatrice MyD88. Cette protéine possède également un domaine TIR dans sa partie carboxy-terminale qui s hétérodimérise avec celui du récepteur. MyD88 est une protéine essentielle pour la signalisation de tous les TLRs comme le souligne le fait que les souris qui ne possèdent pas cette protéine (MyD88 / ) ne répondent à aucun microorganisme, ni à l ADN bactérien, ni à l ARN viral. La liaison TLR/MyD88 permet alors le recrutement de la sérine thréonine kinase IRAK-1 et sa phosphorylation et son activation par l intermédiaire d une autre kinase de la famille IRAK, IRAK-4 qui forme un complexe avec MyD88 [37]. IRAK-1 devenue active se lie alors avec TRAF6 (TNF Receptor Associated Factor 6) et le complexe IRAK-1/TRAF6 se détache alors de MyD88 pour interagir au niveau de la membrane avec un complexe moléculaire préexistant composée de la kinase TAK-1 (TGF-b-activated-kinase) et de deux protéines de liaisons TAB1 et TAB2 [38,39]. ar un mécanisme encore non élucidé IRAK-1 va permettre la translocation de TRAF6, TAB1 et TAB2 dans le cytosol où elles vont s associer avec d autres protéines pour former un complexe multiprotéique nécessaire à l activation de l activité kinase de TAK1 [38]. Une fois activée, TAK1 va alors phosphoryler IKKa/b qui phosphoryle à son tour Ij-b provoquant sa dégradation et la libération de NF-jB qui peut ainsi migrer dans le noyau et exercer son activité transcriptionnelle. Les études sur les TLRs ont, par ailleurs, permis de découvrir l existence de protéines qui orientent spécifiquement la signalisation vers la synthèse d interféron (TRIF, TIRA). Ainsi l interaction d IRAK avec la protéine adaptatrice Mal/TIRA permet non seulement la translocation de NF-jB mais aussi l activation d un facteur de régulation de l interféron IRF-3 [40,41]. 3.5.2. Régulation négative des récepteurs de type TLRs Le rôle «charnière» et prépondérant d IRAK-1 dans la signalisation intracellulaire des récepteurs TLRs/IL1R explique probablement l existence de systèmes de rétrocontrôle destinés à éviter une activation incontrôlée et délétère. Ainsi, Tollip est une protéine retrouvée dans le complexe IRAK-1/MyD88. Son rôle est pour l instant controversé mais, sa surexpression entraîne une diminution de l activation de NF-jB induite par l IL1, probablement par inhibition de la phosphorylation de IRAK-1 [42,43]. Si le rôle physiologique de Tollip est d empêcher la phosphorylation et l activation spontanées d IRAK-1 en s associant à son domaine catalytique, il est possible qu une synthèse accrue de Tollip bloque l activité kinase d IRAK-1. L emploi de souris knock-out devrait permettre d élucider le rôle précis de Tollip. IRAK-M, un autre membre de la famille IRAK, a un rôle inhibiteur dans la voie de signalisation TLR/IL1R. Les souris knock-out IRAK-M, IRAK-M /, présentent une suractivation spontanée ou provoquée des TLRs et l IL-1R. De même, les macrophages IRAK-M / ont une production significativement plus importante en réponse à la stimulation par différents AMs [44]. Le mécanisme par lequel IRAK-M inhibe la voie de signalisation TLR/IL1R est encore incomplètement élucidé. Il est clair que les macrophages contiennent peu ou pas de cette protéine au repos. Cependant, après stimulation par du LS, IRAK-M est rapidement synthétisé en grande quantité et semble augmenter l affinité de MyD88, IRAK-4 et IRAK-1 les unes pour les autres, inhibant ainsi la phosphorylation d IRAK-1 et donc son activation. Très récemment, Wald et al. ont décrit SIGIRR (Single ImmunoGlobulin IL1R-Related protein) qui se présente comme un pan-inhibiteur de la super-famille de récepteurs TLR/IL1R [45]. Cette protéine transmembranaire semble n exister que dans les cellules épithéliales et pourraient expliquer ainsi pourquoi ces cellules qui expriment les TLRs et sont très exposées aux agents microbiens, ne sont pas perpétuellement activées. SIGIRR agit en séquestrant IRAK-1 et TRAF-6 au niveau du TIR domaine du récepteur bloquant ainsi la signalisation en aval. Les mécanismes d inhibition de l activation de la voie de signalisation de TLR/IL1R apparaissent donc complexes et d autres molécules inhibitrices semblent exister (MyD88s et SOCS-1 notamment). De nombreuses études sont encore nécessaires pour mieux les connaître et décrire leur rôle respectif. 3.6. olymorphismes des récepteurs de type Toll La gravité d une infection ne dépend pas seulement du pathogène mais aussi de l hôte. Ces facteurs inter-individuels peuvent être acquis, liés à une pathologie chronique (diabète, cirrhose), une immunodépression (cancer, chimiothérapie) mais aussi à des facteurs génétiques et en particulier la variabilité génétique de l hôte. Cette variabilité peut avoir un rôle bénéfique ou délétère dans la survenue ou l évolution d une pathologie infectieuse en modifiant les capacités de l hôte à se défendre, créant une réelle inégalité face à l infection. Les polymorphismes des récepteurs de type Toll notamment de TLR2 et TLR4 ont été associés à une augmentation de la sensibilité aux infections. Il existe un polymorphisme de TLR4, qui est le récepteur du LS, responsable d un phénotype de non-réponse au LS. Il semble être spécifiquement associé à des états de choc septique à bacilles Gram-négatif. De même, ce polymorphisme semble favoriser les infections à bactéries Gramnégatif en post opératoire [18,46]. De plus des mutants rares de TLR4 ont été trouvés de façon préférentielle chez des enfants atteints de méningococcémie [47]. De même, deux variants de TLR2, qui changent sa partie cytosolique, bloquent la réponse aux bactéries Gram-positif et aux mycobactéries. Ils ont été associés à la survenue de chocs septiques à staphylocoques et au développement de formes sévères de lèpre [48].

174 O. Huet et al. / Réanimation 13 (2004) 167 175 Récemment, le groupe de Jean-Laurent Casanova a montré que des mutations des protéines de signalisation de TLR, favorisaient la survenue d infections sévères récidivantes chez l enfant (mutant de IRAK-1). Ainsi, il est probable que tout polymorphisme qui modifie la structure ou la quantité d une protéine de signalisation des TLRs puisse provoquer de graves conséquences cliniques [49]. 4. Conclusion et perspectives La découverte du rôle des récepteurs de type Toll a constitué une avancée majeure dans le domaine de l immunité innée. Leur action très précoce dans la reconnaissance du pathogène et dans le déclenchement de la réponse inflammatoire suggère un rôle possible dans la physiopathologie du choc septique qui est caractérisée par le développement d un syndrome inflammatoire systémique intense et incontrôlé responsable d une souffrance cellulaire diffuse. Il apparaît logiquement comme séduisant d élaborer des modèles de recherche visant à réduire l inflammation générée par l activation des TLRs. Le développement d antagonistes des protéines intervenant dans la voie de signalisation des récepteurs de type Toll pourrait jouer un rôle important pour éviter l apparition d une réponse inflammatoire exagérée compliquant parfois les infections bactériennes. Trois stratégies peuvent être mises en jeu pour réduire la voie de signalisation des TLR afin de limiter les conséquences de leur activation. La première serait le développement d analogues solubles des TLRs qui se complexeraient sur leurs AMs respectifs empêchant ainsi leur fixation sur les TLRs cellulaires. La deuxième stratégie consisterait à développer des anticorps spécifiques qui se fixeraient sur la partie extracellulaire des TLR évitant ainsi l action directe des AMs. Un exemple de cette stratégie serait la mise au point d un analogue du LS qui se fixerait sur TLR4 mais qui ne l activerait pas. La dernière de ces stratégies serait la mise au point de molécules intervenant au niveau de la partie intracellulaire des TLRs empêchant ainsi le déclenchement de la voie de signalisation intracellulaire. Ces perspectives thérapeutiques ne sont pour l instant que des hypothèses mais une action sur les TLRs semble très séduisante puisqu elle permettrait d agir très en amont de l initiation de la réponse inflammatoire. Il faut cependant rester extrêmement prudent puisqu un grand nombre des résultats obtenus concernant les TLRs l ont été sur des modèles de choc endotoxinique. Ces modèles restent malheureusement relativement éloignés de la réalité clinique. O Brien et al. ont très bien démontré que si les souris C3H/HeJ, porteuses d un TLR4 inefficace, sont insensibles à une injection létale de LS, il suffit de seulement deux bactéries de Salmonella typhimurium pour que celles-ci meurent alors que chez des souris LS-sensibles il faut en moyenne un inocula de 10 000 bactéries pour que les souris meurent [50]. Ceci rappelle que malgré l effet délétère que peut avoir une activation excessive des TLRs lors d une infection bactérienne, leur rôle est crucial dans la réponse immunitaire initiale. Enfin, la découverte des TLRs et de leurs voies de signalisation devrait permettre de mieux comprendre la susceptibilité aux infections de certains sujets et offrir de nouvelles cibles de recherche de polymorphismes génétiques [18,48]. Il est ainsi fort probable que les avancées récemment réalisées et les études génétiques et pharmacologiques qui vont en découler permettront de proposer de nouveaux agents thérapeutiques destinés à combattre les infections et de mieux cibler les traitements des patients en fonction de leur profil génétique [51]. Références [1] Angus DC, et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med 2001;29(7):1303 10. [2] Levin BR, Antia R. Why we don t get sick: the within-host population dynamics of bacterial infections. Science 2001;292(5519):1112 5. [3] Aderem A, Ulevitch RJ. Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. Nature 2000;406(6797):782 7. [4] ulendran B, alucka K, Banchereau J. Sensing pathogens and tuning immune responses. Science 2001;293(5528):253 6. [5] Medzhitov R, Janeway Jr CA. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition. Cell 1997;91(3):295 8. 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