MALARIA DIAGNOSTIC MICROSCOPIQUE Philippe Gillet Institute of Tropical Medicine Department of Clinical Sciences Unit of Tropical Laboratory Medicine
DIAGNOSTIC du paludisme 1. [Diagnostic clinique ] 2. Détection des parasites (microscopie) 3. Détection des antigènes parasitaires 4. Détection de matériel génétique (ADN ou ARN) parasitaire (PCR) 5. Détection d anticorps dirigés contre le parasite 6. Détection d une infection par les automates hématologiques ou autres
A n o p h e le s M a n s p o ro z o ite s b lo o d m e a l O o c y s ts * S A L IV A R Y G L A N D S H E M O L Y M P H h e p a tic S c h izo n ts * S c h izo n ts * ookinetes m e ro z o ite s R E D B L O O D C E L L z y g o te S T O M A C H g a m e to c yte s rin g fo rm s o r tro p h o zo ite s m a c ro & m ic ro g a m e te s b lo o d m e a l R E D B L O O D C E L L * = m u ltip lic a tio n
2. Detection (microscopique) petit (qq µm). Immobile. Peu de characteristiques (frottis) MICROSCOPE (500x) 1.000x Coloration
2. Detection (microscopique) QBC. Frottis / GE Coloration - Acridine -Giemsa 3,5 % - ph 7.2 ou 8-20 min.
Seulement pour fixer le frottis trop épais trop mince
GIEMSA principe GIEMSA FIELD S stain RAL ROMANOSKY JENNER LEISHMAN WRIGHT.
Frottis / GE: GIEMSA (hémolyse et) coloration Éosine (acide) colore les éléments basiques Bleu de méthylène (basique) colore les éléments acides Azur(basique) colore les éléments acides Dilution extemporanée du colorant Influence du ph ph AND STAINING
GIEMSA
CELL TYPE SIZE NUCLEUS CYTOPLASM GRANULOCYTES µm FORM COLOUR LEUKOCYTES : POLYMORPHONUCLEAR (GRANULOCYTES) IMMATURE NON SEGMENTED NEUTROPHILS Band forms or S shaped SEGMENTED NEUTROPHILS 12 15 EOSINOPHILS 12 15 Horseshoe, Central curvature is maximum a third part of the width of the lobes 12 15 2 to 5 lobes Usually a bi-lobed nucleus Clear blue purple Deep blue purple Blue purple CHROMATIN STRUCTURE Strands of fine chromatin Rather thick and coarse Rather thick and coarse QUANTITY COLOUR GRANULES abundant +++ +++ Rose +++ Rose Dusty rose (=very small granules) Small granules, light purple or violet Not always present Small granules, Pink or pink mauve Many large, uniform granules, red orange BASOPHILS 11 13 Hardly visible lobes, not well separated (polymorph) Blue purple Rather thick and coarse, covered by granules +++ Light rose Very large, well separated, variable granules Deep purple Small in number Non segmented Neutrophil Segmented Neutrophil Eosinophil Basophil
CELL TYPE SIZE NUCLEUS CYTOPLASM AGRANULOCYTES µm FORM COLOUR LEUKOCYTES : MONOMORPHONUCLEAR (AGRANULOCYTES) CHROMATIN STRUCTURE QUANTITY COLOUR GRANULES SMALL LYMPHOCYTES 7-10 Round or oval Or slightly indented Deep purple Big clumps of intensely stained chromatin (-) or + Sky blue (Often absent) LARGE LYMPHOCYTES 10 15 Round or oval Or slightly indented Red, purple Clumps of deep stained chromatin and other clumps which are less intensely stained ++ Sky blue Absent or a few granules azurophils (rose violet) MONOCYTES 15 25 Round, oval, indented or bean form Blue to slightly violet Fine, spongy like +++ Vacuoles often demonstrable. Grey or blue grey Very fine granules (dusty like), azurophils (rose violet) ERYTHROCYTES 6,7 7,7 Biconcave discus shape Rose None TROMBOCYTES 1,5 2 (5) Slightly blue Reddish Lymphocyte Monocyte
Frottis / GE: GIEMSA GE : FROTTIS Mise en évidence des parasites Quantification (#/µl de sang) Pré différentiation des espèces Différentiation des espèces Quantification (% GR parasités) GE +? frottis
GE et Frottis colorés au Giemsa AVANTAGES INCONVENIENTS Équipement et réactifs simples Sensible : < 5-10 parasites/µl (100 parasites/µl?) Différentiation des espèces Quantification Différentiation de parasitémies actives (asexuées)/ non actives (sexuées) Identification de signes de gravité Détermination des infections mixtes Evaluation possible de l efficacité du traitement Golden standard > 60 minutes avant un résultat Nécessite une expertise Nécessite formation continue Subjectif, (mais moins le frottis que la goutte épaisse) Coûteuse en personnel PRIX : 0.10-0.35 + Détection et identification possible des babésioses, des microfilaires, des trypanosomiases et des fièvres récurrentes.
P. falciparum (caractéristiques en frottis sanguin) Hématies parasitées de taille normale. Normalement pas de schizontes dans le sang périphérique, excepté en cas d'infection grave. Trophozoïtes fins, en forme de bagues; formes accolées; image uniforme, polyparasitisme. Gamétocytes en forme de bananes; une quinzaine de jours après l'invasion initiale des hématies. Taches de Maurer possible (ph=8). Fortes parasitémies possibles pouvant atteindre plus de 50 %.
GE négative (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) Frottis négative (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) GE positive, P. falciparumtrophozoites ++++ (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) Frotis positive, P. falciparum trophozoites (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes)
P. malariae (caractéristiques en frottis sanguin) Hématies parasitées de taille normales ou réduites. Tous les stades évolutifs sont possibles. Forme en bande typique pour les trophozoïtes (rare). Schizontes mûrs à 6-12 noyaux, situées à la périphérie du parasite avec pigment rassemblé au centre. Les parasites sont petits, compacts, foncés Pigment précoce. Parasitémie n'excédant jamais 1%.
GE, P. falciparumtrophozoïtes + (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) Frottis, P. falciparumgametocyte (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) GE, P. malariae schizontes (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) Frottis, P. malariae trophozoïte band form (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes)
Paludisme grave OMS 2010 (P. falciparum) (examen parasitologique) Hyper parasitémie ( 2 % en zone à faible transmission 5 % en zone endémique) Présence de schizontes dans le sang circulant Hémozoïne phagocytée dans les globules blancs (Polynucléaires neutrophiles et/ou monocytes) [Prédominance de trophozoïtes matures (pigment malarien présent dans plus de 20 % des trophozoïtes)]
Paludisme grave OMS 2010 : Hémozoine
QUANTIFICATION en GE 1-9 parasites asexués / 100 champs = + 1-9 parasites asexués / 10 champs = ++ 1-9 parasites asexués / 1 champs = +++ >10 parasites asexués / 1 champs = ++++ The plus system is an old method, which is simple but far less accurate for establishing parasite density in thick blood films. Because of its unreliability, it has been replaced. WHO 2010
QUANTIFICATION en GE Négative si aucun parasite n est retrouvé dans au minimum 100 champs microscopiques à l objectif 100x (ou objectif 50x). Comptage des formes asexuées rencontrées par 200 leucocytes. A partirde la concentration leucocytaire, on peutcalculerle nombrede parasites par µl de sang: Nombre de parasites asexués comptés -------------------------------------------------------- x Numération leucocytaire = Nombre de Parasites/µl de sang Nombre de leucocytes comptés P.S. 1: gamétocytes comptés séparément. P.S. 2: simoinsde 99 parasites/200 GB compterjusqu à500 GB P.S. 3: sinumérationleucocytaireinconnu, l OMSpropose 8.000 leukocytes par µl comme valeur pour tout les patients
QUANTIFICATION en GE Nombre de parasites asexués comptés -------------------------------------------------------- x Numération leucocytaire = Nombre de Parasites/µl de sang Nombre de leucocytes comptés
QUANTIFICATION en frottis Comptage du nombre de globules rouges parasités par des formes asexuées du parasite sur au moins 25 champs microscopiques à l objectif 100x. Faites le comptage dans une zone où le nombre de GR par champs microscopique est de 200 à 250. Nombre d érythrocytes infectés -------------------------------------------------------- x 100 = % d hématies parasitées Nombre d érythrocytes observés P.S. 1: Déterminez le nombre moyen d érythrocytes présents par champs microscopique au 100x P.S. 2: comptez seulement les trophozoites et les schizontes (formes asexués) P.S. 3: si plusieurs parasites/gr = comptez comme 1
QUANTIFICATION en frottis 50.000/µl = 1% des GR 100/µl = 0.002% des GR
P. vivax (caractéristiques en frottis sanguin) Hématies parasitées agrandies et déformées. Tous les stades évolutifs sont possibles. Forme amiboïde typique pour les trophozoïtes âgés. Schizontes mûrs à 16 noyaux ou plus. Granulations de Schüffner fines, mais absentes chez les formes jeunes. Parasitémie n'excédant pas 4%.
P. ovale (caractéristiques en frottis sanguin) Hématies parasitées variables en volume; déformées. Tous les stades évolutifs sont possibles. Parasites moyennement compacts. Schizontes mûrs à 8 noyaux en moyenne, n'occupant pas toute l'hématie. Granulations de Schüffner évidentes. Parasitémie n'excédant pas 4%.
GE, P. ovale trophozoites (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) Frottis, P. ovale trophozoite (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) GE, P. vivax trophozoites (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes) Frottis, P. vivax, 1 gametocyte and 2 trophozoites (Giemsa 3,5 %, ph= 7.2, 20 minutes)
Densité parasitaire/ µl % de GR infecté Parasites/champ microscopique Frottis GE 50.000 1% 2 / 1 champ 50 / 1 champs 5.000 0,1% 1 / 4 champs 5 / 1 champs 500 0,01% 1 / 40 champs 5 / 10 champs 100 0,002% 1 / 200 champs 1 / 10 champs 10 0,0002% 1 / 2000 champs 2 / 100 champs TDR Pv > 90 % TDR Pf > 95% PCR jusqu à 0.004 parasites/µl Microscopie jusqu à 2-5 parasites/µl en labo de référence EN ROUTINE?
Internet links WHO malaria microscopy manual 2010 http://www.searo.who.int/linkfiles/malaria_malaria_microscopy_learners_guide20 10.pdf Site for malaria training (Australian Government): http://www.rph.wa.gov.au/malaria.html
Additional documents http://www.who.int/malaria/publications/atoz/9789241547925/en/index.html http://www.rbm.who.int/toolbox/tool_managementofseveremalariahb.html