Vers la production dans les plantes transgéniques de protéines à usage pharmaceutique P. Lerouge*, V. Gomord*, L. Faye* points FORTS De très nombreuses glycoprotéines thérapeutiques (protéines plasmatiques, anticorps, vaccins, enzymes, etc.) ont été produites sous forme fonctionnelle dans des plantes transgéniques. Les plantes répondent à plusieurs des critères recherchés pour la production de protéines thérapeutiques : elles ont une machinerie cellulaire capable de produire des molécules complexes et sophistiquées ; elles ne portent pas de pathogènes associés aux infections humaines ; leur contenu cellulaire, hormis la protéine recombinante, est connu de l humain par son utilisation en alimentation. Les plantes peuvent être propagées à l infini, leur production à grande échelle fait partie du patrimoine culturel de toutes les nations et elles représentent la biomasse la moins onéreuse à produire à ce jour. Les processus de glycosylation diffèrent entre les plantes et les mammifères. Cela conduit à l introduction sur la protéine recombinante de résidus glucidiques spécifiques des plantes et immunogènes chez l homme. Les recherches actuelles visent à modifier la glycosylation endogène de la plante afin de produire une glycoprotéine recombinante compatible avec une application thérapeutique chez l homme. Produire des protéines à usage pharmaceutique dans les plantes transgéniques Les thérapies à base de peptides ou de protéines font l objet d un très fort développement. Le nombre d études de peptides ou protéines dépassait déjà les 400 à la fin de * CNRS UMR 6037, IFRMP 23, université de Rouen. l année 1999. Compte tenu de cet essor, les systèmes de production actuels de ces molécules thérapeutiques pourront difficilement répondre aux demandes, que ce soit en termes de volume ou de qualité. Bien qu ayant subi des améliorations importantes durant la dernière décennie, les technologies de production utilisant des bactéries ou des levures ont démontré leurs limites pour la production de protéines thérapeutiques. Les systèmes utilisant des cellules eucaryotes plus évoluées, notamment les cellules de mammifères, ont, en revanche, démontré leur capacité à produire des protéines complexes. Cependant, ces technologies souffrent toujours des deux principales limitations inhérentes à la production en bioréacteur, limitations liées aux volumes limités accessibles par cette technologie et aux investissements importants que nécessitent la construction et mise en œuvre d une unité de production. Si la production en fermenteur permet dès aujourd hui de disposer de protéines recombinantes d une haute efficacité thérapeutique, les coûts de ces molécules seront très difficiles à supporter pour les systèmes sociaux de santé. Face à ce problème, il est devenu indispensable de mettre en place des systèmes alternatifs de production à faible coût et tout aussi efficace. La demande sans cesse croissante de capacité de production en protéine à usage pharmaceutique a stimulé, dès les années 1980, le développement des plantes comme usine cellulaire. Les plantes répondent à plusieurs des critères recherchés (1, 2) : elles ont une machinerie cellulaire complexe et sophistiquée ; elles ne portent pas les pathogènes associés aux infections humaines ; leur contenu cellulaire, hormis la protéine recombinante, est connu de l humain pour son utilisation en alimentation. Les plantes représentent la biomasse la moins onéreuse à produire à ce jour et peuvent être propagées à l infini. Les différents systèmes végétaux de production de protéines recombinantes Dans la plupart des systèmes végétaux utilisés pour la production de protéines recombinantes à grande échelle, la plante mature constitue l usine de production et, à ce titre, les plantes se distinguent des autres systèmes de production. Deux types de tissus, le feuillage et la graine, ont été développés pour bénéficier des sources de biomasse les plus accessibles et peu onéreuses. Concernant le tabac, la luzerne et quelques autres espèces, le feuillage 88 Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), n o 2, mars/avril 2003
est la cible de l expression de la protéine d intérêt. Concernant le maïs, le colza, le carthame, le soja et le riz, les vecteurs d expression stimulent la production et l accumulation des molécules recombinantes dans la graine. Au cours des dernières années, de nombreuses protéines d intérêt pharmaceutique ont été produites avec succès dans les plantes transgéniques. Il est important de mentionner que, quelle que soit la protéine d intérêt thérapeutique produite, ces protéines recombinantes présentent des activités biologiques analogues à celles des protéines naturelles. Le tableau I résume les principales réalisations. Par ailleurs, la moléculture (production de Tableau I. Protéines à usage pharmaceutique produites dans les plantes transgéniques Catégorie Protéine Application Plante Réf. Protéines sanguines Albumine Contrôle du volume sanguin, excipient pomme de terre, tabac 3, 4 et plasmatiques Aprotinine Antifibrinolytique maïs 5 Enképhalines Analgésique tabac 6 Hémoglobine Substitut sanguin tabac 7, 8, 9 Collagène I Agent homéostatique, scellant tissulaire tabac 10 et autres Vaccins Antigène de l hépatite B Hépatite B tabac et pomme de terre 11 Toxine de V. cholera Choléra pomme de terre 12 Sous-unité de la toxine B Choléra pomme de terre 13 du choléra Glycoprotéine B du CMV Cytomégalovirus tabac 14 Peptide D2 de Vaccin mucosal ne requérant pas haricot noir 15 Staphylococcus aureus d adjuvant Hémagglutinine Traitement de la grippe tabac 16 Entérotoxine B de E. coli Diarrhée pomme de terre, tabac 17 Épitope de P. falciparum Malaria tabac 18 Protéine de capside Diarrhée causée par le virus de Norwalk tabac, pomme de terre 19 du virus de Norwalk Protéine G Rage tabac, épinard, tomate 20 du virus de la rage Glycoprotéine gp41 Virus du VIH haricot 21 Anticorps IgG C5-1 Anti-IgG diagnostique luzerne 25 IgA contre S. mutans Dans la prévention de carie dentaire tabac 26 IgG contre Anticorps diagnostique tabac 27 la créatine-kinase IgG contre l antigène Cancer du côlon tabac 28 tumoral CO17-1A Anticorps contre antigène Cancer céréales 29 carcinoembryonnaire Hormones, cytokines GM-CSF Facteur de croissance hémopoïétique tabac 31, 32 et facteurs de croissance dans le traitement de neutropénie Interféron α Traitement d hépatite B et C tabac 33 Interféron β Traitement d hépatite B et C tabac 34 Somatotropine (hgh) Traitement des désordres de croissance tabac 35 Érythropoïétine Traitement d anémie tabac 36 Epidermal Growth Factor Contrôle de prolifération cellulaire tabac 4 (EGF) Enzymes Trichosanthine Inhibe la réplication du VIH tabac 37 Enzyme de conversion Hypertension tabac et tomate 38 de l angiotensine I Lipase gastrique de chien Mucoviscidose tabac 39 Protéine C Anticoagulant tabac 40 Glucocérébrosidase Maladie de Gaucher tabac 40 Autres Hirudine Anticoagulant tabac, colza 41 Lactoferrine humaine Antimicrobien tabac 42 Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), n o 2, mars/avril 2003 89
molécules recombinantes dans les végétaux) est passée, en une dizaine d années, du stade de la validation de concept au stade de la production industrielle. Protéines sanguines et plasmatiques De nombreuses protéines plasmatiques ont déjà été produites dans les plantes (tableau I). Ainsi, l albumine humaine, une protéine plasmatique utilisée dans le contrôle de l hypovolémie et de l hypoalbuminémie dans certaines chirurgies et comme excipient de plusieurs médicaments, a été produite avec succès dans la pomme de terre et le tabac (3, 4). D autres protéines, comme l aprotinine (5), des enképhalines (6) et l hémoglobine (7, 8, 9) ont également été obtenues dans divers végétaux. Le collagène I (10), une molécule assemblée en hélice triple impliquée dans plusieurs mécanismes complexes comme l organogenèse, l attachement et la prolifération cellulaire, l hémostase et la régénération de tissus, a également été produit dans des plants de tabac en vue d une utilisation en thérapie mais aussi dans l industrie cosmétique. Vaccins La nature comestible des plantes représente un atout majeur dans la production de vaccins, qu ils soient destinés à l homme ou aux animaux. En effet, il est possible de déclencher une réponse immunitaire par l administration d un antigène par voie orale. Le virus de l hépatite B affecte plus de 2 milliards d individus et un vaccin pouvant être facilement distribué et administré dans les pays en voie de développement est hautement souhaitable. Des études menées chez la souris ont démontré que l ingestion de pomme de terre exprimant un antigène de surface du virus de l hépatite B déclenche une réponse immunitaire (11). Au cours des dernières années, d autres types d antigènes destinés à une administration orale ou par injection ont également été produits dans les végétaux (tableau I). Citons comme exemple la production de protéines vaccinales contre la toxine du choléra (12, 13), le cytomégalovirus (14), le Staphylococcus aureus (15), le virus de la grippe (16), l entérotoxine B du E. coli (17), le parasite de la malaria (18), le virus de Norwalk (19), le virus de la rage (20) et même contre le virus du VIH (21). La principale difficulté dans l emploi d un vaccin destiné à une administration orale est le dosage précis de la quantité d antigène consommée. Les études précliniques et cliniques en cours permettront de mieux définir le potentiel des vaccins produits dans les plantes. Plusieurs groupes tentent actuellement de démontrer que l utilisation des plantes permettra de produire des vaccins peu coûteux pouvant facilement être distribués et administrés à la population et contribueront ainsi à diminuer les coûts globaux de vaccination. Anticorps Les thérapies à base d anticorps (immunothérapies) connaissent actuellement un essor insoupçonné. Les anticorps représentent aujourd hui plus du tiers des protéines en cours d essais cliniques aux États-Unis. Plus d une centaine d études cliniques utilisant des anticorps sont actuellement en cours pour diverses pathologies comme les désordres du système immunitaire, les maladies inflammatoires, certains cancers, les désordres du système nerveux central et les maladies infectieuses. La plupart des applications proposées nécessitent l utilisation d anticorps complets. Exception faite des hybridomes, seules les cellules de mammifères ou d insectes, les animaux transgéniques ou les plantes transgéniques sont capables de correctement associer les chaînes lourdes et légères constitutives des anticorps. La culture de cellules mammifères est un procédé coûteux et de capacité limitée. Le coût de production d un anticorps produit via des cellules mammifères est estimé à environ 200 millions de dollars par an pour une capacité de 200 kg d anticorps (22). À titre d exemple, le traitement du cancer du sein par l anticorps Herceptin requiert l administration de plusieurs grammes d anticorps par dose. La popularité de ce traitement fera probablement croître la demande au-dessus du niveau des 100 kg par an. Si l on considère que la capacité totale annuelle de production d anticorps monoclonaux (en hybridomes ou recombinants) ne dépasse actuellement pas 1 000 kg, tous anticorps confondus, on imagine aisément les difficultés à court terme d approvisionnement en anticorps thérapeutiques. De telles quantités pourraient non seulement être produites par moléculture mais, de surcroît, pour environ le dixième des investissements de départ et des coûts de production en fermenteur (23). La première démonstration de production d anticorps dans des plantes a été effectuée par Hiatt et al. en 1989 (24). Depuis cette date, d autres anticorps ou fragments d anticorps à usage thérapeutique ont été produits dans divers systèmes végétaux. Ces anticorps recombinants sont usuellement appelés planticorps. Citons notamment des anticorps dirigés contre des immunoglobulines humaines (25), un antigène du Streptococcus mutans (26), la créatinekinase (27) et contre un antigène tumoral d un cancer du côlon (28). Un anticorps a également été produit contre l antigène carcinoembryonnaire (29), un marqueur de croissance tumorale. Facteurs de croissance, hormones et cytokines Les facteurs de croissance, les hormones et les cytokines représentaient plus de 75 % des ventes totales des biopharmaceutiques en 1998 (30). Les principales molécules dans cette catégorie sont l érythropoïétine, les colony stimulating factors et l insuline. Plusieurs hormones et facteurs de croissance ont été exprimés dans le tabac : le 90 Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), n o 2, mars/avril 2003
GM-CSF (31, 32), les interférons alpha (33) et bêta (34), la somatotropine (35), l érythropoïétine (36) et l epidermal growth factor (4). Enzymes et autres Au niveau thérapeutique, de nombreuses enzymes sont actuellement utilisées dans le traitement de thromboses (urokinase), de la maladie de Gaucher (algucérase) et de la fibrose kystique (dornase). La démonstration a été faite que les plantes peuvent également produire des enzymes à potentiel thérapeutique, telles que la trichosanthine alpha (37), une enzyme inhibant la réplication du VIH ; l enzyme de conversion l angiotensine I (38), la lipase gastrique de chien pour le traitement de la mucoviscidose (39), la protéine C et la glucocérébrosidase (40). Cette dernière enzyme, utilisée dans le traitement de la maladie de Gaucher, est actuellement isolée et commercialisée à partir de placenta humain ou produite de façon recombinante dans des cellules de mammifères. Parmi les autres succès de production de protéines thérapeutiques dans des plantes transgéniques, citons la production d hirudine (41) et de lactoferrine (42). Conformité des protéines recombinantes produites dans les systèmes végétaux Les plantes sont capables d assembler des molécules complexes Les quelques exemples cités précédemment montrent que les plantes offrent un très fort potentiel pour la production en masse et à faible coût de protéines recombinantes d intérêt thérapeutique. Les machineries de biosynthèse et de maturation des protéines d une cellule animale ou d une cellule végétale sont suffisamment homologues pour que des protéines d origine mammifère soient produites avec succès dans des plantes transgéniques. Ces protéines sont généralement indiscernables de leurs homologues naturels du point de vue de leurs activités biologiques, leurs conformations ou séquences protéiques. Parmi les succès majeurs, on peut rappeler la production de différents types d anticorps recombinants tels que des IgG ou des IgA secrétoires. Les immunoglobulines de classe IgG sont constituées de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères reliées entre elles par des ponts disulfures comme l illustre la figure 1A. Les études récentes que nous avons menées sur les planticorps montrent que ces molécules présentent un niveau d assemblage entre chaînes lourdes et légères analogue aux IgG naturelles. La complexité d une IgA sécrétoire est encore plus grande puisque ces immunoglobulines sont constituées de deux molécules d IgG reliées entre elles par deux polypeptides. L assemblage d une IgA sécrétoire nécessite l intervention successive de deux types cellulaires distincts chez les mammifères. Ces molécules ont été produites avec succès sous forme biologiquement active par transgenèse végétale (26), ce qui illustre la grande capacité de la machinerie cellulaire végétale à assembler des protéines de mammifères, même extrêmement complexes. Les protéines thérapeutiques produites dans des plantes transgéniques présentent des glycanes immunogènes La production dans des plantes transgéniques constitue une des voies les plus prometteuses d accès à des protéines thérapeutiques peu onéreuses et dénuées de contaminations potentielles par des agents pathogènes. Ainsi, à titre d exemple, les planticorps devraient certainement remplacer progressivement les anticorps monoclonaux produits par des hybridomes pour de nombreuses applications comme le diagnostic ou l immunothérapie. Cependant, l utilisation en thérapie, chez l homme ou chez l animal, d anticorps et, plus généralement, de glycoprotéines recombinantes d origine végétale, présente encore une très forte limitation. En effet, pour les plantes, comme d ailleurs pour tout autre système hétérologue utilisé pour la production de protéines recombinantes, la glycosylation est différente de celle observée chez les mammifères et n est pas toujours compatible avec une application thérapeutique chez l homme. Depuis une quinzaine d années, notre laboratoire étudie les processus de glycosylation des protéines végétales. Plus récemment, nous nous sommes intéressés à l ingénierie de ces processus, de telle sorte que le système d expression végétal soit mieux adapté à la production de glycoprotéines compatibles avec une utilisation thérapeutique chez l homme. Notre travail a principalement porté sur le modèle planticorps. Ainsi, les analyses de l anticorps monoclonal Guy s 13, spécifique d une adhésine de Streptococcus mutans, une bactérie responsable de la carie dentaire (43) et de l anticorps Mgr-48, spécifique de nématodes (44), ont montré que, qu ils soient produits dans des hybridomes murins ou dans des plantes Glycanes Anticorps Glycanes Souris Tabac GlcNAc Man β(1,2)xyl α(1,3)fuc β(1,4)gal α(1,6)fuc Figure 1. Structures des N-glycanes associés à un anticorps murin et à un planticorps. Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), n o 2, mars/avril 2003 91
de tabac, ces anticorps sont glycosylés par des structures oligosaccharidiques (N-glycanes) de structures proches mais non identiques. Ainsi, comme il est illustré dans la figure 1B, les IgG d hybridomes portent sur le core glucidique (signalé en rouge) des résidus α(1,6)-fucose et des résidus β(1,4)-galactose terminaux alors que les planticorps correspondants présentent sur ce même core des résidus β(1-2)-xylose et α(1,3)-fucose (figure 1C). Ces différences structurales résultent, comme l illustre la figure 2, des différences tardives dans les processus de maturation dans l appareil de Golgi des N-glycanes entre plantes et mammifères. Les faibles différences structurales observées entre N-glycanes de plantes et de mammifères ne remettent pas en question la capacité des planticorps de reconnaître les antigènes. Cependant, la présence d oligosaccharides typiquement végétaux associés aux planticorps limite actuellement leur utilisation en thérapie chez l homme. L addition sur les N-glycanes des résidus β(1-2)-xylose et α(1,3)-fucose, spécifiques des plantes et absents chez les animaux, leur confèrent une forte immunogénicité chez certains mammifères et en particulier chez l homme (45). Par conséquent, l exposition prolongée à des quantités importantes de ces N-glycanes végétaux immunogènes, quantités nécessaires pour certaines thérapies in vivo, aboutirait très probablement à une sensibilisation à ces antigènes de nature glucidique. Vers une humanisation des glycoprotéines recombinantes d origine végétale Pour les plantes, comme pour les autres eucaryotes, la N-glycosylation débute par le transfert dans le réticulum endoplasmique (RE) d un précurseur oligosaccharidique. Elle est suivie de sa maturation dans le RE, puis dans l appareil de Golgi lors du transport de la glycoprotéine le long du système endomembranaire de sécrétion (figure 2) (46). Comme mentionné précédemment, les différences entre plantes et mammifères apparaissent lors des maturations tardives des N-glycanes dans l appareil de Golgi conduisant à l addition des résidus β(1,2)-xylose et α(1,3)-fucose potentiellement immunogènes (45). Afin d utiliser pleinement l énorme potentiel du système végétal pour la production de protéines à usage pharmaceutique, il est nécessaire de bloquer ces maturations typiques des plantes pour obtenir sur les glycoprotéines recombinantes d origine végétale des N-glycanes compatibles avec une utilisation thérapeutique. De nombreux travaux sont actuellement en cours afin de modifier la machinerie de glycosylation des plantes. La plupart des stratégies développées afin d humaniser les N-glycanes concernent la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, l inhibition de glycosyltransférases résidentes de l appareil de Golgi ou l expression de nouvelles glycosyltransférases dans ce compartiment. Des résultats encourageants ont déjà été obtenus au laboratoire par ces stratégies sans pour autant qu on ait encore réussi à produire des glycanes complètement humanisés. Les principaux acquis actuels sont développés ci-après. La rétention de la protéine recombinante dans le reticulum endoplasmique L analyse structurale de la glycosylation des protéines résidentes du réticulum (47, 48) a montré que ces réticuloplasmines naturelles portent des glycanes de structure oligo-mannosidique, communes aux plantes et aux mammifères (figure 2), et par conséquent très probablement non immunogènes. Cette observation est à l origine d une des stratégies mise en œuvre afin d éviter l association de glycanes immunogènes aux glycoprotéines recombinantes d origine végétale. Cette stratégie consiste à stocker la glycoprotéine recombinante dans le RE. Un RE Appareil de Golgi Mammifère Précurseur Plante glycanes oligomannosidiques glycanes complexes Glc GlcNAc Man β(1,2)xyl α(1,3)fuc β(1,4)gal α(1,6)fuc Figure 2. Biosynthèse des N-glycanes pour les mammifères et les plantes. 92 Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), n o 2, mars/avril 2003
tel stockage dans le RE est possible puisque l addition à l extrémité C-terminale d une protéine recombinante d un tétrapeptide de séquences K/HDEL permet sa rétention dans le RE des cellules végétales (49). Tirant avantage de ce processus, nous avons montré que l expression chez des plantes des chaînes lourdes et légères d un anticorps fusionnées à des séquences KDEL conduit à la production d un planticorps retenu de façon efficace dans le RE et glycosylé par des structures oligomannosidiques (figure 3C) (50). Si toutefois la structure des N-glycanes associés à ce planticorps diffère de celle des anticorps murins, elle ne présente plus le caractère potentiellement immunogène des planticorps secrétés. L ingénierie de la machinerie de glycosylation Une autre stratégie prometteuse d humanisation des N-glycanes végétaux est l expression de nouvelles glycosyltransférases qui vont compléter et/ou inactiver par compétition la machinerie endogène de maturation des N-glycanes de la cellule végétale. Dans le cadre de ces stratégies de complémentation, plusieurs laboratoires ont émis l hypothèse que l expression d une β(1,4)-galactosyltransférase (GalT) animale dans des compartiments précoces du Golgi végétal pourrait permettre une humanisation partielle des glycanes végétaux et éventuellement prévenir l association de β(1,2)-xylose et α(1,3)-fucose par compétition. En accord avec cette hypothèse, Palacpac et al. (51) ont montré que l expression d une GalT humaine dans des cellules de tabac en culture permet le transfert de résidus galactoses sur les résidus N-acétylglucosamine terminaux des N-glycanes végétaux. Plus récemment, nous avons montré que l expression d une immunoglobuline dans des plantes de tabac exprimant la GalT humaine conduit à la production d un planticorps partiellement humanisé. Ce planticorps présente des séquences N-acétyllactosamine (Galβ1-4GlcNAc) terminales identiques à celles associées aux N-glycanes d anticorps produits dans des cellules de mammifères (figure 3D) (44). Perspectives Les résultats encourageants obtenus dans le cadre des travaux d humanisation de la N-glycosylation permettent d entrevoir l obtention de systèmes végétaux permettant la production de protéines compatibles avec une utilisation en thérapie humaine ou animale. Actuellement, nos efforts portent sur l association de stratégies de complémentation décrites plus haut à des stratégies d inhibition des transferts des deux résidus immunogènes. Nous espérons pouvoir ainsi, à court terme, produire dans des plantes transgéniques des planticorps présentant une glycosylation identique à celle des anticorps murins. Anticorps Souris Rétention dans le RE GlcNAc Man β(1,2)xyl α(1,3)fuc β(1,4)gal α(1,6)fuc Tabac exprimant la GalT humaine Figure 3. Structures des N-glycanes associés à un planticorps retenu dans le RE ou produit dans un plant de tabac exprimant une galactosyltransférase humaine. Comparativement aux autres protéines plasmatiques, les anticorps présentent une glycosylation relativement simple. Notamment, les planticorps ne portent pas d acides sialiques terminaux. Les acides sialiques sont importants, en particulier pour la demi-vie des glycoprotéines circulantes de mammifères. L absence de tels résidus conduit à une élimination rapide de la protéine du flux sanguin via l intervention de récepteurs de surface des cellules hépatiques. Les acides sialiques sont absents dans les plantes. L obtention de N-glycanes sialylés dans les plantes, en adaptant la machinerie de maturation des N-glycanes végétaux, nécessiterait le transfert d au moins cinq différents gènes hétérologues codant des enzymes impliquées dans la biosynthèse de l acide sialique dans le cytosol et son transport dans l appareil de Golgi. Les enzymes manquantes de cette voie métabolique devraient non seulement être exprimées de façon stable mais aussi être adressées de façon correcte et, enfin, être actives dans la cellule végétale. Pour ces différentes raisons, la production de glycoprotéines recombinantes sialylées dans les plantes représente un nouveau challenge dans le domaine des biotechnologies végétales. Cependant, dès aujourd hui, il paraît techniquement possible d atteindre cet objectif ambitieux. La purification de la protéine d intérêt à partir de plantes transgéniques constitue l un des autres challenges actuels de la moléculture. La molécule recombinante doit présenter une haute pureté en fin de processus et doit notamment être dénuée de toute contamination par des métabolites végétaux potentiellement toxiques. Cette étape de purification peut représenter un des principaux coûts lors de la production industrielle. S il a pu être montré, par exemple, que la purification sur colonne de protéine A immobilisée permet d obtenir en une étape un planticorps pur à partir d extraits végétaux (25), la purification d autres protéines thérapeutiques à partir de plantes pourrait s avérer beaucoup plus délicate. Références 1. Faye L, Landry N, Lerouge P et al. La production de protéines à usage biopharmaceutique dans les plantes. Médecine/Sciences 2001 ; 17 : 867-77. 2. Stoger E, Sack M, Fischer R, Christou P. Les planticorps. Biofutur 2002 ; 225 : 49-54. 3. Sijmons PC, Dekker BM, Schrammeijer B et al. Production of correctly processed serum albumin in transgenic plants. Bio/Technology 1990 ; 8 : 217-21. Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), n o 2, mars/avril 2003 93
4. Goddjin OJM, Pen J. Plants as bioreactors. Trends Biotechnol 1995 ; 13 : 379-87. 5. Zhong GY, Peterson D, Delaney DE et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Mol Breeding 1995 ; 5 : 345-56. 6. Vandekerckhove J, Damme JV, Lijsebettens MV et al. Enkephalines produced in transgenic plants using modified 2S storage proteins. Bio/Technology 1989 ; 7:929-32. 7. Dieryck W, Pagnier J, Poyart et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco. Nature 1997 ; 386 : 29-30. 8. Halling-Sorensen B, Nors Nielsen S, Lanzky PF. Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment. Chemosphere 1998 ; 36 : 357-93. 9. Dieryck W, Gruber V, Baudino S et al. Expression of recombinant human hemoglobin in plants. Transfus Clin Biol 1995 ; 2 : 441-7. 10. Ruggerio F, Exposito JY, Bournat P et al. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants. FEBS Letters 2000 ; 469 : 132-6. 11. Richter LJ, Thanavala Y, Arntzen CJ, Mason HS. Production of hepatitis B surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Nat Biotechnol 2000 ; 18 : 1167-71. 12. Arakawa T, Chong DK, Langridge WH. Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin subunit vaccine. Nat Biotechnol 1998 ; 16 : 292-7. 13. Arakawa T, Yu J, Langridge WH. Food plant-delivered cholera toxin B subunit for vaccination and immunotolerization. Adv Exp med Biol 1999 ; 464 : 161-78. 14. Tackaberry ES, Dudani AK, Prior F et al. Development of biopharmaceuticals in plant expression systems: cloning, expression and immunological reactivity of human cytomegalovirus glycoprotein B (UL55) in seeds of transgenic tobacco. Vaccine 1999 ; 17 : 23-4. 15. Brennan FR, Bellaby T, Helliwell et al. Chimeric plant virus particles administered nasally or orally induce systemic and mucosal immune responses in mice. J Virol 1999 ; 73 : 930-8. 16. Beachy RN. Use of plant viruses for delivery of vaccine epitopes. In : Engineering plant for commercial products and applications. Ann N Y Acad Sci 1996 ; 25 : 43-9. 17. Mason HS, Haq TA, Clements JD, Arntzen CJ. Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT) : potatoes expressing a synthetic LT-B gene. Vaccine 1998 ; 16 : 1336-43. 18. Turpen TH, Reinl SJ, Charoenvit Y et al. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobacco mosaic virus. Bio/Technology 1995 ; 13 : 53-7. 19. Tacket CO, Mason HS, Losonsky G et al. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes. J Infect Dis 2000 ; 182 : 302-5. 20. McGarvey PB, Hammond J, Dienelt MM et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes. Bio/Technology 1995 ; 13 : 1484-7. 21. Buratti E, McLain L, Tisminetzky S et al. The neutralizing antibody response against a conserved region of human immunodeficiency virus type 1 gp41 (amino acid residues 731-752) is uniquely directed against a conformational epitope. Virol 1999 ; 13 : 930-8. 22. Steiner UP. Assessment of the economics of transgenic technologies for biologicals, Bayer Biotechnology, Bayer Corp., communication dans le cadre du congrès Production and economics of biopharmaceuticals, CA, 13-15 janvier 2000. 23. Kusnadi A, Nikolov ZL, Howard JA. Production of recombinant proteins in transgenic plants : practical considerations. Biotechnol Bioeng 1997 ; 56 : 473-84. 24. Hiatt AC, Cafferkey R, Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants. Nature 1989 ; 342 : 76-8. 25. Khoudi H, Laberge S, Ferullo JM, et al. Production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants. Biotech Bioeng 1999 ; 64 : 135-43. 26. Ma JKC, Hiatt A, Hein MB et al. Generation and assembly of secretory antibodies in plants. Science 1995 ; 268 : 716-9. 27. Conrad U, Fiedler U, Artsaenko O, Phillips J. High-level and stable accumulation of single-chain Fv antibodies in plant storage organs. J Plant Physiol 1998 ; 152 : 708-11. 28. Verch T, Yusibov V, Joprowski H. Expression and assembly of a full-length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector. J Immunol 1998 ; 220 : 69-74. 29. Vaquero C, Sack M, Schuster F et al. A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco. FASEB J 2002 ; 16 : 408-10. 30. Therapeutic proteins 1999 : a seven country analysis and forecasts to 2007. Data Monitor 2002. 31. James EA, Wang C, Wang Z et al. Production and characterization of biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified plant cells. Protein Expr Purif 2000 ; 19 : 131-8. 32. Lee JS, Choi SJ, Kang HS et al. Establishment of a transgenic tobacco cell suspension culture system for producing murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor. Mol Cells 1997 ; 7 : 783-7. 33. De Zoeten GA, Penswick JR, Horisberger MA et al. The expression, localization, and effect of a human interferon in plants. Virology 1989 ; 172 : 213-22. 34. Edelbaum O, Stein D, Holland N et al. Expression of active human interferon-beta in transgenic plants. Interferon Res 1992 ; 12 : 449-53. 35. Staub JM, Garcia B, Graves J et al. High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. Nat Bio Technol 2000 ; 18 : 333-8. 36. Matsumoto S, Ikura K, Ueda M, Sasaki R. Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells. Plant Mol Biol 1995 ; 27 : 1163-72. 37. Kumagai MH, Turpen TH, Weinzettl N et al. Rapid, high-level expression of biologically active alpha-trichosanthin in transfected plants by an RNA viral vector. Proc Natl Acad Sci USA 1993 ; 90 : 427-30. 38. Hamamoto H, Sugiyama Y, Nakagawa N et al. A new tobacco mosaic virus vector and its use for the systematic production of angiotensin-i-converting enzyme inhibitor in transgenic tobacco and tomato. Bio/Technology 1993 ; 11 : 930-2. 39. Gruber V, Berna PP, Arnaud T et al. Large-scale production of a therapeutic protein in transgenic tobacco plants : effect of subcellular targeting on quality of a recombinant dog gastric lipase. Mol Breeding 2001 ; 7 : 329-40. 40. Cramer CL, Weissenborn DL, Oishi KK et al. Bioproduction of human enzymes in transgenic tobacco. Ann N Y Acad 1996 ; 792 : 62-71. 41. Parmenter DL, Boothe JG, van Rooijen GJ, Yeung EC, Moloney MM. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning. Plant Mol Biol 1995 ; 29 : 1167-80. 42. Salmon V, Legrand D, Slomianny MC et al. Production of human lactoferrin in transgenic tobacco plants. Prot Exp Purif 1998 ; 13 : 127-35. 43. Cabanes-Macheteau M, Fitchette-Lainé AC, Loutelier-Bourhis C et al. N-glycosylation of a mouse IgG expressed in transgenic tobacco plants. Glycobiology 1999 ; 9 : 365-72. 44. Bakker H, Bardor M, Molthoff JW et al. Galactose-extended glycans of antibodies produced by transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA 2001 ; 98 : 2899-904. 45. Bardor M, Faveeuw C, Fitchette AC et al. Immunoreactivity in mammals of two typical plant glyco-epitopes, core-α(1,3)-fucose- and core-β(1,2)-xylose. Glycobiology (sous presse). 46. Lerouge P, Cabanes-Macheteau M, Rayon C et al. N-glycoprotein biosynthesis in plants : recent developments and future trends. Plant Mol Biol 1998 ; 38 : 31-48. 47. Pagny S, Cabanes-Macheteau M, Gillikin JW et al. Protein recycling from the Golgi apparatus to the endoplasmic reticulum in plants and its minor contribution to calreticulin retention. Plant Cell 2000 ; 12 : 739-55. 48. Navazio L, Baldan B, Mariani P, Gerwig GJ et al. Primary structure of the N-linked carbohydrate chains of calreticulin from spinach leaves. Glycoconjugate J 1996 ; 13 : 977-83. 49. Gomord V, Denmat LA, Fitchette-Lainé AC et al. The C-terminal HDEL sequence is sufficient for retention of secretory proteins in the endoplasmic reticulum (ER) but promotes vacuolar targeting of proteins that escape the ER. Plant J 1997 ; 11 : 313-25. 50. Bardor M, Sriraman R, Sack M et al. Retention of recombinant antibodies in the plant endoplasmic reticulum results in production of plantibodies lacking plant specific and potentially immunogenic core-xylose and core-α(1,3)-fucose residues. Biochemistry (soumis à). 51. Palacpac NQ, Yoshida S, Sakai H et al. Stable expression of human beta1,4-galactosyltransferase in plant cells modifies N-linked glycosylation patterns. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 96 : 4692-7. 94 Métabolismes Hormones Diabètes et Nutrition (VII), n o 2, mars/avril 2003