Les Avantages des RabMAbs

haute qualité Les Avantages des RabMAbs RabMAbs (Rabbit Monoclonal Antibodies) Anticorps monoclonaux de lapin Anticorps de qualité supérieure RabMAbs Les anticorps de haute qualité de anticorps Les #4 #5 #6 Haute affinité Haute spécificité Epitopes nouveaux Discover more at abcam.com/rabmabs

Table des matières A propos de la technologie RabMAb 3 Intérêts des RabMAbs 4 Avantages pour les utilisateurs 4 Comparaison entre RabMAbs et anticorps de souris 5 Les avantages des RabMAbs 1. Réduction du bruit de fond 6 2. Détection des modifications post-traductionnelles 7 3. Excellents produits pour l immunohistochimie (IHC) 8 4. Haute affinité 9 5. Haute spécificité 10 6. Reconnaissance d épitopes nouveaux et variés 11 7. Nombreuses applications validées 12 8. Compatibilité avec les échantillons de souris 13 Exemples de RabMAbs 14 2 Avantages des RabMAbs

A propos de la technologie RabMAb Les RabMAbs (Rabbit Monoclonal Antibodies) sont issus d une technologie unique et exclusive permettant de développer des anticorps monoclonaux chez le lapin, au lieu de la méthode conventionelle utilisant la souris. Fig. 1 - Protocole de production des RabMAbs Cette technique, similaire à celle développée pour les anticorps monoclonaux de souris, utilise un partenaire de fusion breveté (lignée cellulaire immortelle) pouvant fusionner avec les cellules B, formant ainsi des hybridomes de lapin. Ces hybridomes sont alors criblés pour sélectionner des clones reconnaissant, de manière spécifique et avec une grande sensibilité, l antigène de choix. Les anticorps sont ensuite caractérisés pour déterminer leur efficacité dans plusieurs applications (Fig. 1). Lapins immunisés Cellules B isolées Partenaires de fusion (240E-W2, US patent 742987) Les anticorps produits par la technologie RabMAb permettent une meilleure reconnaissance antigénique en comparaison avec des anticorps traditionnels de souris. En effet, le système immunitaire du lapin génère une grande diversité d anticorps et optimise l affinité par des mécanismes plus efficaces que ceux présents chez la souris ou autres rongeurs, améliorant ainsi la probabilité d isoler des anticorps fonctionnels pour une plus grande gamme d applications (1, 2). Contrairement à la souris, la réponse immunitaire du lapin induite par des molécules organiques ou des peptides est supérieure. C est souvent pour cette raison que les anticorps polyclonaux sont développés chez le lapin pour la recherche et les applications de diagnostics, allant du dépistage de drogues au diagnostic clinique. Hybridomes Hybridomes criblés par ELISA pour une reconnaissance spécifique de l antigène Caractérisation de l anticorps (Western, IHC, ICC, Flow, IP, test de neutralisation, etc.) 1. Rabbit monoclonal antibodies: a comparative study between a novel category of immunoreagents and the corresponding mouse monoclonal antibodies. Rossi S, [Am J Clin Pathol. 2005 Aug;124(2):295-302] RabMAbs 2. Rabbit monoclonal antibodies show higher sensitivity than mouse monoclonals for estrogen and progesterone receptor evaluation in breast cancer by immunohistochemistry. Rocha R, [Pathol Res Pract, 2008;204(9):655-62. Epub 2008 Jun 18] Discover more at abcam.com/rabmabs 3

Intérêts des RabMAbs Les anticorps monoclonaux de lapin RabMAbs associent les avantages d une meilleure reconnaissance antigénique due au système immunitaire du lapin avec la spécificité et la consistance d un monoclonal, générant ainsi des anticorps d une qualité exceptionnelle. Les résultats publiés par des laboratoires indépendants comparant les anticorps monoclonaux de lapin aux monoclonaux de souris ont démontré que les RabMAbs permettent d augmenter la sensibilité avec une spécificité similaire sinon meilleure. Principaux avantages des RabMAbs: Reconnaissance diversifiée des épitopes Meilleure réponse immunitaire aux épitopes de petites tailles Haute spécificité et affinité Meilleure réponse aux antigènes de souris Avantages pour les utilisateurs Anticorps de haute qualité pour une large gamme d applications. Le système immunitaire du lapin génère une diversité d anticorps et optimise l affinité par des mécanismes plus efficaces que ceux présents chez la souris ou autres rongeurs. La probabilité de récupérer des anticorps fonctionnant dans une large gamme d applications est donc accrue. Les anticorps RabMAbs sont souvent les outils idéaux pour des applications exigeantes telles que l immunohistochimie (IHC) sur tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine. De nouveaux anticorps pour les cibles dites «difficiles». Grâce à la reconnaissance d un large éventail d épitopes et une meilleure réponse immunitaire pour les cibles peu immunogènes (telles que les antigènes de souris, ou les épitopes de petites tailles comme les peptides ou molécules organiques), le développement d anticorps hautement fonctionnels pour ces cibles particulières devient donc possible grâce à la technique RabMAb. Par exemple, des anticorps de qualité ont été développés pour la reconnaissance de sites présentant une double phosphorylation. Des anticorps hautement caractérisés. En plus des nombreux avantages que présente la technologie des monoclonaux de lapin, chaque RabMAb est testé dans de nombreuses applications (ELISA, WB, IHC, ICC/ IF, IP et FACS) et espèces (Humain, Souris et Rat). Ces étapes de validation sont indispensables et permettent de sélectionner des anticorps de haute qualité. 4 Avantages des RabMAbs

Comparaison entre RabMAbs (Monoclonaux de Lapin) et Monoclonaux de Souris Comparaison RabMAbs Monoclonal de Souris RECONNAISSANCE DE L ANTIGÉNE Bonne réponse immunitaire contre les peptides, petites molécules et protéines de rongeurs Reconnaissance diversifi ée des épitopes Réponse immunitaire limitée pour les protéines de rongeurs Peptides et molécules organiques sont souvent de faibles immunogènes Reconnaissance épitopique limitée (immunodominance) AFFINITÉ de l ordre du picomolaire (K D =10-12 M) de l ordre du nanomolaire (K D =10-9 M) SPÉCIFICITÉ Elevée Moyenne APPLICATIONS CDX2 Coupe en paraffi ne d un carcinome de colon humain avec le RabMAb anti-cdx2 (ab76541) en comparaison avec un monoclonal de souris (dilution 1/1000) WB, ELISA, Cytométrie en Flux, IP, ICC, excellents résultats en IHC RabMAb WB, ELISA, Cytométrie en Flux, IP, pas toujours adapté en IHC ou ICC. Monoclonal de souris E-CADHÉRINE Coupe en paraffi ne d un carcinome de sein (humain) avec le RabMAb anti- E-Cadhérine (ab40772) en comparaison avec un monoclonal de souris (dilution 1/50) RabMAb Monoclonal de souris HER2 / ErbB2 Coupe en paraffi ne d un carcinome de sein (humain) avec le RabMAb anti Her2 / ErbB2 (ab134182) en comparaison avec un monoclonal de souris (dilution 1/500) RabMAb Monoclonal de souris Discover more at abcam.com/rabmabs 5

1. Réduction du bruit de fond Les RabMAbs en tant que monoclonaux, détectent un épitope unique limitant ainsi les réactions croisées avec les autres protéines présentes dans l échantillon. Il a été également observé que les RabMAbs se lient à leur cible avec une plus grande affinité, permettant d obtenir un meilleur rapport réponse/bruit de fond qu avec les anticorps monoclonaux de souris à concentrations égales. Par conséquent, les RabMAbs peuvent détecter une protéine d intérêt avec plus de spécificité et présentent une plus grande sensibilité tout en maintenant un bruit de fond minimal. c-myc AMPK alpha 1 (phospho S496) IHC sur coupe en paraffine d un adénocarcinome de côlon humain utilisant un RabMAb anti-c-myc (ab32072). IF sur cellules HeLa utilisant un RabMAb anti-phospho-ampk alpha 1 (ps496) (ab92701). WB sur lysats cellulaires MCF-7 (1), Ramos (2), SW480 (3), Molt-4 (4), Jurkat (5), HeLa (6) utilisant un RabMAb anti-mcm2 (ab108935). Histone H3 (ps10) CD38 Ki67 (Alexa Fluor 488) IF sur cellules HeLa utilisant un RabMAb anti-histone H3 (ps10) (ab32107) FACS sur cellules HuT-78 utilisant un RabMAb anti-cd38 (ab108403) (rouge) et une IgG de lapin (négatif) (vert). IF sur cellules HeLa utilisant un RabMAb anti-ki67 (ab154201). 6 Avantages des RabMAbs

2. Détection des modifications posttraductionnelles Le système immunitaire du lapin peut fabriquer des anticorps qui reconnaissent des épitopes de petites tailles. La détection de modifications post-traductionnelles est également rendue possible (phosphorylation, méthylation, acétylation, sumoylation). Chez la souris, les molécules organiques ou les peptides génèrent une réaction immunitaire beaucoup plus faible que chez le lapin. Exemples de détection par les RabMAbs des modifications sur l Histone H3: Acétylation Méthylation Phosphorylation 1 2 1 2 1 2 WB sur lysat de cellules C6 utilisant un RabMAb anti-histone H3 (Acetyl K56) (ab76307). Colonne 1: non traité, Colonne 2: traité avec TSA WB utilisant un RabMAb anti- Histone H3 (diméthyl K4) (ab32356). Colonne 1: Lysat de cellules Hela, Colonne 2: Histone H3 recombinant (non-méthylé) Exemples de détection par les RabMAbs des modifications sites phosphorylés: Phosphotyrosine (py) Phosphoserine (ps) Phosphothréonine (pt) Double Phospho (pt/ps) 1 2 1 2 1 2 3 4 1 2 WB sur lysat de cellules NIH 3T3 utilisant un RabMAb anti-c-jun (ps63) (ab32385). Colonne 1 et 3: non traité, Colonne 2 et 4: traité avec UV ou Anisomycine WB sur lysat cellulaire Jurkat utilisant RabMAb antieif4ebp1 (pt37) (ab75767). Colonne 1: non traité, Colonne 2: traité à l insuline WB sur lysat de cellules 293T utilisant un RabMAb anti-s6k (pt421/ps424) (ab32525). Colonne 1: non traité, colonne 2: traité avec EGF Discover more at abcam.com/rabmabs 7

3. Excellents produits pour l immunohistochimie (IHC) La haute spécificité et sensibilité des RabMAbs font de ces produits de parfaits outils biologiques pour l immunomarquage, en particulier pour I IHC sur tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine. Les RabMAbs permettent également de travailler à des dilutions plus élevées (5 à 10 fois environ) et peuvent être utilisés dans différentes méthodes de fixation de tissus avec un minimum de prétraitements. De plus, il est possible d utiliser en parallèle un anticorps monoclonal de souris avec un anticorps RabMAb pour effectuer un double marquage sur une même coupe de tissu. RabMAb HER2 / ErbB2 Anticorps Polyclonal de lapin Anticorps Monoclonal de souris 3 ng / ml 20 ng / ml 30 ng / ml Comparaison du RabMAb anti-her2/erbb2 avec un anticorps polyclonal de lapin et un anticorps monoclonal de souris sur coupe en paraffine d un carcinome de sein. Double marquage utilisant les RabMAbs: CK8 et Ki-67 Her2/ErbB2 et ER Alfa AIF et Ki-67 IHC sur tissus humain cancéreux de vessie utilisant un RabMAb anti-ck8 (ab53280) avec Fast Red et un monoclonal de souris anti-ki-67 avec du DAB IHC sur coupe d un carcinome humain du col de l utérus utilisant un RabMAb anti-aif (ab32516) avec Fast Red et un monoclonal de souris anti- Ki-67 avec du DAB. 8 Avantages des RabMAbs

4. Haute affinité L affinité d un anticorps est caractérisée par la constante de dissociation à l équilibre K D déterminée par le rapport des constantes de vitesse cinétique (k off /k on ) ou le rapport des concentrations des constituants à l équilibre. Un faible K D se traduit par une plus grande affinité de l anticorps pour son ligand et une meilleure sensibilité de détection. Alors que la plupart des anticorps monoclonaux thérapeutiques ont un K D à l échelle du nanomolaire (10-9 M), les RabMAbs ont des K D pouvant souvent atteindre le picomolaire (10-12 M) démontrant de façon consistante leur plus grande affinité. Les étapes de sélection peuvent ainsi être évitées. (2) Comparaison des valeurs K D des RabMAbs avec les anticorps thérapeutiques couramment utilisés: Anticorps monoclonaux thérapeutiques K D (M) ER 1.28 x 10-12 ID1 2.82 x 10-12 C29 9.57 x 10-11 TNF-α 1.25 x 10-11 IL-1-β 1.99 x 10-10 Herceptine 5.0 x 10-9 Rituxan 8.0 x 10-9 Synagis 1.0 x 10-9 Remicade 2.0 x 10-10 Avastine 5.0 x 10-10 Echelle d affinité Comparaison de l affinité par les valeurs K D des RabMAbs et anticorps monoclonaux de souris traditionnels. Mesures de K D effectuées sur 850 RabMAbs. 1. Applications And Engineering Of Monoclonal Antibodies. David J. King, 2007. 2. Anti-peptide antibody screening: Selection of high affinity monoclonal reagents by a refined surface plasmon resonance technique. Pope ME, [J Immunol Methods. 2009 Feb 28;341(1-2):86-96. doi: 10.1016/j.jim.2008.11.004. Epub 2008 Nov 28] Discover more at abcam.com/rabmabs 9

5. Haute Spécificité Identité % Réactivité Progestérone 100 17-aHydroxyprogestérone 0.901 Cortisol 0.035 Desoxycorticostérone 1.59 20a Dihydroprogestérone 0.016 20b Dihydroprogestérone 0.02 Pregnenolone 0.764 Pregnenolone-3-SO 4 0.426 La haute spécificité des RabMAbs permet de générer des anticorps d une grande qualité, reconnaissant des changements épitopiques subtiles induits par le clivage protéique ou des épitopes très similaires. Comparaison de plusieurs RabMAbs anti-parp-1 Site de clivage PARP-1 entière Chaque RabMAb anti-parp-1 reconnait spécifiquement différents sites de clivage sans réaction croisée avec les sites de clivages non spécifiques. 10 Avantages des RabMAbs

6. Reconnaissance d épitopes nouveaux et variés Le système immunitaire du lapin est différent de celui de la souris. Ces différences sont largement attribuées à la faible immunodominance du lapin et un large répertoire de cellules B. Lors du développement des anticorps, la reconnaissance épitopique sera élevée chez le lapin. L étude ci-dessous compare, par Western Blot, les réponses immunitaires entre le lapin et la souris. Notre expérience dans le développement d anticorps monoclonaux suggère que le système immunitaire de lapin peut développer une plus grande diversité d anticorps contre gamme plus large d épitopes. Comparaison de la réponse immunitaire: RabMAb & Monoclonal de Souris 5 souris et 3 lapins SOURIS 1 2 3 LAPIN 1 2 3 Le lapin reconnait plus d épitopes 1. Marqueur de poids moléculaire 2. Fibronectine 3. Fibronectine traitée par une protéase Immunisation par la fi bronectine humaine Sérum polyclonal Analyse Western Blot Comparaison en Western Blot des réponses immunitaires de lapin et de souris montrant ainsi que le sérum de lapin reconnait plus d épitopes que celui de souris. La majorité des protéines humaines sont très conservées entre la souris et l humain. Par conséquent, ces protéines ont tendance à être moins immunogènes lorsque que la souris est utilisée en tant qu animal hôte. En utilisant le lapin comme animal hôte, avec son mécanisme unique de diversifi cation immunitaire et de maturation de l affi nité, les RabMAbs peuvent être produits pour une large gamme d épitopes permettant la découverte de nouvelles cibles antigéniques. Discover more at abcam.com/rabmabs 11

7. Nombreuses applications validées Nos anticorps RabMAbs sont tous validés dans plusieurs applications (Western Blot, IHC, ICC/ IF et FACS) ainsi qu avec des échantillons provenant de différentes espèces (humain, souris et rat). En IHC, les RabMAbs ont été testés sur coupes en paraffine (FFPE) de tissus humains afin de valider leur sensibilité et leur spécificité de localisation. Résultats de validation du RabMAb Caspase-3 (Pro) Résultats de validation du RabMAb Caspase-3 (Pro) A) WB sur lysat de cellules HeLa, B) IHC sur coupe en paraffine de carcinome de col de l utérus, C) FACS sur cellules Jurkat et D) ICC sur cellules HeLa 12 Avantages des RabMAbs

8. Compatibilité avec les échantillons de souris Les RabMAbs sont des outils idéaux pour nos clients travaillant sur des échantillons de souris. L utilisation d anticorps monoclonaux de souris sur des tissus de souris peut être problématique et implique un protocole complexe. Les RabMAbs permettent d éviter les problèmes de réactions croisées et le bruit de fond qui sont généralement observés lors de l utilisation d un anticorps secondaire de souris. La technologie RabMAb, utilisant le lapin comme hôte, va produire avec plus de succès des anticorps monoclonaux contre des antigènes de souris. Avec les RabMAbs, il est ainsi possible d utiliser un anticorps monoclonal avec des échantillons de souris en évitant les problèmes de signaux non-spécifiques liés aux réactions croisées avec les immunoglobulines natives de souris. Pour chaque RabMAb, les réactions croisées entre les espèces ont été testées en Western Blot sur des échantillons de souris et d humain. RabMAbs validés en IHC sur tissus de souris EGFR (py1092) Cytokeratine 8 IHC sur coupe en paraffine d intestin de souris utilisant un RabMAb anti-egfr (py1068) (ab40815) GFAP IHC sur coupe en paraffine de cerveaux de souris utilisant un RabMAb anti-gfap (ab68428) MCM2 IHC sur coupe en paraffine d intestin de souris utilisant un RabMAb anti-mcm2 (ab108935) CD3 γ IHC sur coupe en paraffine de rate de souris utilisant un RabMAb anti-cd3 gamma (ab134096) Discover more at abcam.com/rabmabs p120 Caténine IHC sur coupe en paraffine du gros intestin de souris utilisant un RabMAb anti-caténine (p120) (ab92514) 13

Exemples de RabMAbs Anticorps anti-aif [E20] (ab32516) Réactivité: Humain, Souris, Rat Applications: WB, IHC-F, IHC-P, ICC/IF, IP, Cytométrie en Flux WB sur cellules K562 IF sur des cellules HeLa Anticorps anti-atm (ps1981) [EP1890Y] (ab81292) Réactivité: Humain Applications: WB, IHC-P, ICC/IF, IP WB sur lysat de cellules HEK293. Colonne 1: non traité, colonne 2: traité au doxorubicine IHC sur coupe en paraffine d un carcinome humain d endomètre Anticorps anti-caténine beta [E247] (ab32572) Réactivité: Humain, Souris, Rat, Hamster, Macaque Applications: WB, IHC-F, IHC-P, ICC/IF, IP WB sur lysat entier de cellules U2OS IHC sur coupe en paraffine d un carcinome humain du col de l utérus 14 Avantages des RabMAbs

Anticorps anti-c-myc [Y69] (ab32072) Réactivité: Humain, Souris, Rat Applications: WB, IHC-P, ICC/IF, IP IF sur cellules HeLa IHC sur coupe en paraffine d un adénocarcinome de côlon humain Anticorps anti-egfr (py1092) [EP774Y] (ab40815) Réactivité: Humain, Souris Applications: WB, IHC-F, IHC-P, ICC/IF WB sur lysat de cellules A431. Colonne 1: EGF non traité, Colonne 2: EGF traité IHC sur coupe en paraffine d un carcinome humain du col de l utérus Anticorps anti-tubuline Alpha [EP1332Y] (ab52866) Réactivité: Humain, Souris, Rat Applications: WB, IHC-F, IHC-P, ICC/IF, IP, Cytométrie en Flux WB sur lysat de cellules HeLa à 10 μg IF sur cellules embryoniques humaines de rein Discover more at abcam.com/rabmabs 15

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