ETUDE DES LYMPHOCYTES T INFILTRANT LE TISSU TUMORAL

DÉBORA LÛSCHER ETUDE DES LYMPHOCYTES T INFILTRANT LE TISSU TUMORAL Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en biologie cellulaire et moléculaire pour l'obtention du grade de Maître es sciences (M.Se.) DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MEDICALE FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC 2006 Débora Lûscher, 2006

ii Résumé La présence de lymphocytes T infiltrant (TILs) a été démontrée dans plusieurs types de cancer. Par contre, la fonctionnalité des TILs est affectée par de nombreux facteurs qui font du milieu tumoral un environnement inhibiteur pour ceux-ci. Notre hypothèse de travail était qu'il est possible de prendre avantage des TILs encore activés afin d'élaborer une stratégie anti-tumorale. Nous avons mis au point un système qui permet d'isoler spécifiquement les TILs activés. Pour ce faire, nous avons construit un vecteur contenant le gène codant pour la partie extracellulaire et transmembranaire du CD 19 (ACD19), que nous avons mis sous le contrôle du promoteur minimal de l'interleukine 2. Nous avons démontré que le ACD19 est exprimé de façon stable à la surface cellulaire, que le vecteur est inductible suite à l'activation des lymphocytes T et qu'il est possible d'isoler spécifiquement les cellules exprimant le ACD19. Finalement, nous avons caractérisé un modèle tumoral animal et déterminé les conditions nécessaires pour tester notre hypothèse in vivo.

Avant-propos Je voudrais en premier lieu remercier le Dr Pedro O. de Campos-Lima, mon directeur de recherche, pour m'avoir accueillie dans son laboratoire et pour m'avoir permis de travailler sur ce projet de recherche. Je tiens également à le remercier pour sa disponibilité et son amour de la science qui ont fait de mon premier contact en laboratoire une expérience plaisante et enrichissante. J'aimerais remercier tous les membres de notre équipe de travail, pour avoir fait du laboratoire un environnement de travail agréable : Annick Lalonde, pour m'avoir appris les techniques utilisées au laboratoire ainsi qu'en culture cellulaire, pour nos discussions de filles et pour m'avoir fait connaître la ville de Québec ; Olivier Désy, pour les injections intraveineuses des souris ainsi que pour son sens de l'humour et ses petites blagues ; Damien Carignan, pour être différent des autres et pour m'avoir dépanné avec mes problèmes informatiques. Je désirerais remercier tout le personnel de soutient du centre de recherche, plus particulièrement Anne Julien et Richard Boutet pour le soin des animaux et leurs précieux conseils. Finalement, je voudrais également remercier le Centre de Recherche de PHôtel-Dieu de Québec de m'avoir octroyé une bourse de recherche à la maîtrise.

iv Table des matières Résumé ii Avant-propos iii Table des matières iv Liste des figures vi Liste des tableaux vii Liste des abréviations viii Partie 1 : Introduction 1 1.1 Le cancer 1 1.2 Le cancer du sein 1 1.2.1 Thérapies utilisées 2 1.3 Cellules immunitaires infiltrant le tissus tumoral 4 1.3.1 La cellule dendritique 4 1.3.2 Le lymphocyte T 5 1.3.3 Recrutement des lymphocytes T infiltrant au niveau de la tumeur 8 1.3.4 Destruction des cellules tumorales 10 1.3.5 Les lymphocytes T infiltrant le cancer du sein 11 1.4 Environnement tumoral 12 1.4.1 Système d'évasion des cellules tumorales 15 1.4.2 Lymphocytes T régulateurs 17 1.4.3 Cellules dendritiques 19 1.4.4 Antigènes associés aux tumeurs 21 1.4.5 Système en constante évolution 22 1.5 Objectifs de recherche 23 1.6 Éléments de la stratégie 24 1.6.1 CD19 24 1.6.2 Activation des lymphocytes T 27 1.6.3 Production d'interleukine 2 29 Partie 2 : Matériel et méthodes 31 2.1 Construction des ACD19 31 2.1.1 Construction des ÀCD19 humains 31 2.1.2 Construction des ACD19 murins 34 2.2 Culture cellulaire 36 2.2.1 Milieux et culture des cellules 36 2.2.2 Transfections 36 2.2.3 Transduction de lignée cellulaire 37 2.2.4 Isolement des lymphocytes T périphériques 37 2.2.5 Transduction des cellules primaires 38 2.2.6 Activation 39 2.2.7 Analyse par cytométrie de flux 39

2.2.8 Isolement CD 19 40 2.3 Souris 40 2.3.1 Génotypage 41 2.3.2 Induction de tumeurs 42 2.3.3 Extraction de lymphocytes 42 2.3.4 Isolement des précurseurs 43 2.3.5 Transduction des précurseurs 44 2.3.6 Reconstitution de moelle osseuse 44 Partie 3 : Résultats 46 3.1 Construction des vecteurs contenant le ACD19 46 3.2 Fonctionnalité des ACD19 49 3.2.1 Expression constitutive du ÀCD19 murin et humain à la surface cellulaire 49 3.2.2 Inductibilité du ACD19 murin et humain 51 3.3 Transduction des cellules primaires humaines 53 3.3.1 Efficacité de transduction des lymphocytes humains 54 3.3.2 Inductibilité du ACD19 humain dans les lymphocytes humains 55 3.3.3 Efficacité du tri des lymphocytes exprimant le ACD19 humain 56 3.4 Mise en place d'un modèle tumoral in vivo pour l'étude des TILs 58 3.4.1 Induction et pourcentage d'induction des tumeurs chez la souris Apc Mm 59 3.4.2 Temps écoulé avant l'apparition de tumeurs chez les souris Apc Mw 61 3.4.3 Croissance de tumeurs chez la souris Apc Mm 62 3.5 Expérimentation chez la souris Apc '" 63 3.5.1 Efficacité du tri des précurseurs 64 3.5.2 Efficacité de transduction des précurseurs 65 3.5.3 Analyse du transfert de gène dans les leucocytes in vivo 66 3.5.4 Pourcentage de cellules GFP positives 68 Partie 4 : Conclusion 69 4.1 Discussion 69 4.2 Perspectives 74 Bibliographie 77 V

vi Liste des figures Figure 1.1 : Molécules d'adhésion impliquées dans l'adhésion transitoire entre un lymphocyte T et une cellule dendritique [8] 9 Figure 1.2 : Les trois phases de l'immunoétition [24] 13 Figure 1.3 : Fonctions des cellules T dans l'activité anti-tumorale 25] 14 Figure 1.4 : Mécanismes de suppression des Tregs [36] 19 Figure 1.5 : Représentation du CD19 humain [40] 26 Figure 1.6 : Sentiers intracellulaires impliquées dans l'activation du lymphocyte T 8]..30 Figure 3.1 : Représentation schématique des différents vecteurs utilisés lors des expérimentations 48 Figure 3.2 : Analyse par FACS de l'expression à la surface cellulaire du ACD19 murin 50 Figure 3.3 : Analyse par FACS de l'expression à la surface cellulaire du ACD19 humain 51 Figure 3.4 : Analyse par FACS de l'inductibilité ACD19 murin 52 Figure 3.5 : Analyse par FACS de l'inductibilité ACD19 humain 53 Figure 3.6 : Analyse par FACS de l'efficacité de transduction des cellules primaires 54 Figure 3.7 : Analyse par FACS d'une induction sous-optimale 56 Figure 3.8 : Analyse par FACS du tri cellulaire pour le CD19 humain 57 Figure 3.9 : Graphique représentant la proportion des souris ayant développé des tumeurs mammaires suite à l'injection d'enu 60 Figure 3.10 : Photographie d'une souris Apc Mln ayant développé une tumeur mammaire 61 Figure 3.11 : Graphique de l'étude du pourcentage de souris sans tumeurs dans le temps 62 Figure 3.12 : Graphique de l'étude du taux de croissance moyen des tumeurs 63 Figure 3.13 : Analyse par FACS de l'efficacité du tri cellulaire 65 Figure 3.14 : Analyse par FACS de l'efficacité de transduction des précurseurs 66 Figure 3.15 : Analyse par microscopie de l'efficacité du transfert de gène 67 Figure 3.16 : Analyse par FACS de l'efficacité du transfert de gène 68 Figure 4.1 : Schéma représentant l'essai in vivo qui pourrait être effectué 75 Figure 4.2 : Schéma représentant l'essai clinique proposé 76

vii Liste des tableaux Tableau 2.1 : Description des constructions contenant le ACD19 35

Liste des abréviations aa Acide aminé ADN Acide désoxyribonucléique AP-1 Facteur de transcription, hétérodimère de Fos et Jun Apc Adenomatous polyposis coli APC Cellule présentatrice de l'antigène ARN Acide ribonucléique pvm pvmicroglobuline B7 Ligand du signal de costimulation de l'activation des lymphocytes T Ca 2+ Calcium CD2 Molécule d'adhésion impliquée dans l'activation des cellules T CD3 Transduction du signal des TCR CD4 Corecepteur du lymphocyte T se liant au CMH de classe 11 CD4+ Lymphocyte T auxiliaire CD8 Corecepteur du lymphocyte T se liant au CMH de classe I CD8+ Lymphocyte T cytotoxique CD 19 Marqueur de cellules B, fait partie du corecepteur ACD19 CD 19 tronqué CD21 Récepteur 2 du complément, fait partie du corecepteur des cellules B CD25 Chaîne a du récepteur de l'il-2 CD25+ Lymphocyte T régulateur CD28 Récepteur du signal de costimulation de l'activation des lymphocytes T CD44 Marqueur des cellules T activées, rôle dans l'adhésion cellulaire CD45 Antigène commun des leucocytes CD69 Marqueur des cellules T activées CD80 Molécule de costimulation B7.1 CD81 Fait partie du corecepteur des cellules B CD86 Molécule de costimulation B7.2 CD95 Marqueur des cellules T activées, antigène Fas cm 3 Centimètre cube CMH Complexe majeur d'histocompatibilité CO2 Dioxyde de carbone cppt Suite centrale de polypurine Csk Kinase de la famille Src en C-terminal CTLA-4 Protéine-4 associée aux lymphocytes T cytotoxiques DAG Diacylglycérol DC-SIGN Lectine retrouvée exclusivement à la surface des cellules dendritiques datp Désoxyalanine tri-phosphate dntp Désoxynucléotides tri-phosphate ENU N-nitroso-N-ethylurea

ix FADD Protéine associée à Fas possédant des domaines de morts Fas Induit l'apoptose FasL Ligand du Fas FITC Isothiocyanate de Fluorescéine Fos Facteur de transcription se liant à Jun pour former AP-1 Fyn Protéine kinases de la famille Src g Gramme GFP Protéine verte fluorescente Gy Gray, unité de dose d'irradiation absorbée équivalente à 100 rads HER2 Récepteur 2 du facteur de croissance épidermique hpgk Promoteur dérivé de la phosphoglycérate kinase humaine htert Télomérase humaine IK-B Précurseur de NF-KB ICAM-* Molécule d'adhésion intercellulaire IDO Indoléamine 2,3-dioxygénase IFN-y Interféron gamma IP3 Ionositol 1,4,5-trisphosphate lp3-kinase Phosphatidylinositol 3-OH kinase IL-* Interleukine ITAM Motif permettant l'activation des immunorecepteurs via une tyrosine Jnk Jun kinase Jun Facteur de transcription se liant à Fos pour former AP-1 Kg Kilogramme LAT Lien d'activation dans les cellules T Lck Protéine kinases de la famille Src LCL Lymphocytes B humain immortalisés avec le virus Epstein-Barr LFA-1 Antigène associé à la fonction des lymphocytes 1 LT Cellule de reconstitution à long terme LTR Longue répétition terminale MAP kinase Protéine kinase activée par un mitogène Min Néoplasie intestinale multiple min Minute MIP3a Protéine inflammatoire des macrophages 3a mm Millimolaire mm 3 Millimètre cube MPP Progéniteur multipotent mscf Facteur de cellule souche murine MUC1 Antigène provenant de la mucine ng Nanogramme NF-KB Facteur de transcription nucléaire activé par le DAG NF-AT Facteur nucléaire des lymphocytes T activées p53 Gène suppresseur de tumeur impliqué dans l'arrêt du cycle cellulaire pb Paire de base PBL Lymphocyte du sang périphérique PBS Tampon salin de phosphate PCR Réaction en chaîne de la polymérase

PE Phycoérythrine PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate PKC Protéine kinase C PLC-y Phospholipase C-y PMA Phorbol 12-mystrate 13-acétate Ras Petite protéine G qui active la voie des MAP kinases Rac Petite protéine G qui active la voie des MAP kinases rpm Rotation par minute s Seconde SH-2 Domaines d'homologie Src-2 SLP-76 Protéine de leucocyte contenant des domaines SH-2 ST Cellule de reconstitution à court terme TAA Antigène associé à la tumeur TAP Protéine associée à Papprêtement de l'antigène Treg Lymphocyte T régulateur (CD4+ CD25+) TCR Récepteur à l'antigène des cellules T TGF-P Facteur de croissance tumoral TIL Lymphocyte T infiltrant TP Température pièce U Unité VEGF Facteur de croissance de l'endothélium vasculaire VLA-4 Molécule d'adhésion retrouvée à la surface des cellules T effecteurs VSV-G Protéine G du vesicular somatitis virus WPRE Séquence régulatrice du woodchuck hepatitis virus ZAP-70 Protéine associée à zêta C Degré Celsius j.g Microgramme 0,L Microlitre (J.M Micro molaire

Partie 1 : Introduction 1.1 Le cancer Le cancer est la première cause de décès prématuré au Canada selon les statistiques de l'année 2001. Pour l'année 2005, environ 69 500 décès et 149 000 nouveaux cas de cancer ont été enregistrés au Canada. D'après les taux actuels, on estime que 38% des Canadiens et 44% des Canadiennes seront un jour atteints d'un cancer et qu'environ un Canadien sur quatre décédera des suites d'un cancer. On note une augmentation de l'incidence du cancer avec les années. Cette augmentation est due principalement au vieillissement de la population ainsi qu'à la croissance démographique. En effet, les personnes âgées sont plus susceptibles au cancer puisqu'on note que 44% des nouveaux cas et 60% des décès surviennent chez des personnes âgées de plus de 70 ans. Parmi tous les cancers, trois types sont responsables de 50% des nouveaux cas. Il s'agit chez l'homme, du cancer de la prostate, du poumon et du cancer colorectal et chez la femme, du cancer du sein, du poumon ainsi que du cancer colorectal. Ces trois types de cancers, chez l'homme et chez la femme, présentent également les plus hauts taux de mortalité [1]. 1.2 Le cancer du sein Chez la femme, le cancer du sein est le cancer pour lequel on retrouve le plus haut taux d'incidence. De plus, ce type de cancer se situe au deuxième rang pour le taux de mortalité après le cancer du poumon. Pour l'année 2005, on estime que 5 300 décès et 21 600 nouveaux cas de cancers du sein ont été répertoriés chez les Canadiennes [1]. Depuis les dix dernières années, on remarque une diminution du taux de mortalité par cancer du sein. Cette baisse peut

2 être attribuée, entre autre, à la mise en place de programmes de mammographies de routine, à des diagnostics de plus en plus précis et à l'utilisation de traitements appropriés selon le type de cancer du sein. Par contre, malgré le fait que le taux de mortalité diminue, le taux d'incidence est toujours en constante augmentation. Pour l'instant, il est difficile de freiner cette augmentation du taux d'incidence à cause du manque de connaissances quant aux mécanismes régissant la carcinogénèse du cancer du sein et aux facteurs de risques qui lui sont associés [2]. Une fois que le manque de connaissance sera comblé, il sera plus facile de prévenir le cancer du sein et le taux d'incidence en sera diminué. 1.2.1 Thérapies utilisées Des études ont démontré que plus de la moitié des femmes souffrant d'un cancer du sein opérable qui ne recevaient qu'un traitement local (chirurgie) mouraient suite au développement de métastases. De façon à améliorer le taux de survie de ces femmes, on leur fait maintenant suivre un traitement médical systémique. Il peut s'agir de thérapie endocrine, de chimiothérapie ou de thérapie ciblée combinée à une chirurgie. Ce traitement systémique peut être donné avant ou après le traitement local de la tumeur. Si la tumeur est importante, un traitement systémique avant la chirurgie peut mener à une diminution de la masse tumorale, ce qui peut permettre d'effectuer une chirurgie conservative plutôt qu'une mastectomie [3]. Les thérapies endocrines sont efficaces dans le cas du cancer du sein hormonodépendant, c'est-à-dire que le récepteur à l'œstrogène ou à la progestérone est retrouvé à la surface des cellules cancéreuses. Parmi les thérapies endocrines on retrouve le tamoxifène et les inhibiteurs d'aromatase. Le tamoxifène est un agoniste partiel de l'œstrogène, il permet de réduire de 40 à 50% le risque de développer un cancer controlatéral. Par contre, une utilisation prolongée du tamoxifène est associée avec une augmentation de 3 à 4 fois du taux d'incidence du cancer de l'endomètre ainsi qu'une augmentation du nombre de thromboses veineuses chez les patientes postménopausées. Les inhibiteurs d'aromatase de troisième génération comme Panastrasole, le letrozole et l'exemestane, agissent en inhibant la synthèse de l'œstrogène. Ils

3 permettent de réduire de plus de 40 à 50% le risque de développer un cancer controlatéral et permettent d'obtenir un taux de survie sans cancer et sans métastase plus élevé que celui du tamoxifène. Ils entraînent moins de cancers de l'endomètre et de thromboses veineuses que le taximofêne, mais réduisent par contre la densité osseuse, ce qui conduit à une augmentation des risques de fractures et d'ostéoporose [3, 4]. La chimiothérapie est efficace pour les cancers du sein ayant un mauvais pronostic. Généralement, on se base sur les éléments suivants pour déterminer si la chimiothérapie doit être utilisée : la présence de nodules lymphatiques positifs, l'absence du récepteur à l'œstrogène, la présence du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique (HER2), le faible grade histologique, la présence d'un réseau lymphatique, l'augmentation de la taille de la tumeur et si la patiente est âgée de moins de 35 ans. La chimiothérapie comporte elle aussi des effets secondaires. Parmi ceux-ci, on retrouve : la perte des cheveux, la fatigue, la léthargie, des nausées et des vomissements, une toxicité hématologique dont la neutropénie, une toxicité au niveau des ovaires qui cause l'infertilité et une induction de la ménopause [3]. La thérapie ciblée avec le trastuzumab est efficace dans les cas de cancer du sein exprimant le récepteur HER2 à leur surface, ce qui représente environ 15 à 20 % des cancers du sein. Ce type de cancer est généralement associé à un mauvais pronostic et est généralement résistant à certains types de chimiothérapies et au tamoxifène. Le trastuzumab est un anticorps monoclonal humanisé qui cible spécifiquement le récepteur HER2 à la surface des cellules cancéreuses. Une fois lié, il va causer entre autre : une diminution de l'expression du récepteur HER2 à la surface cellulaire, une réduction de la prolifération cellulaire, une suppression de la production de facteurs angiogéniques comme le facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), une augmentation de la sensibilité à la chimiothérapie et une contribution à l'apoptose de la cellule cible. Le trastuzumab permet de réduire les risques de récurrence de 50% lorsqu'il est administré en même temps que la chimiothérapie ou suite à cette dernière. Par contre, le trastuzumab est cardiotoxique [3, 5].

4 1.3 Cellules immunitaires infiltrant le tissus tumoral Le cancer du sein est intéressant pour l'élaboration d'une stratégie anti-tumorale par ce qu'il est caractérisé par la présence de cellules immunitaires infiltrant le tissu tumoral. De plus, on retrouve généralement la présence des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I à la surface des cellules cancéreuses. L'existence d'un système immunitaire actif au niveau de la tumeur et le fait que les cellules cancéreuses expriment les molécules de CMH de classe I à leur surface permettent leur élimination par les lymphocytes T CD8+. 1.3.1 La cellule dendritique Les TILs sont recrutés à l'intérieur de la tumeur par un système immunitaire actif dont le principal acteur est la cellule dendritique. La cellule dendritique est une cellule présentatrice de l'antigène professionnelle (APC) tout comme les macrophages et les cellules B. Par contre, la cellule dendritique est l'apc la plus efficace puisqu'elle n'a pas besoin d'être activée pour exprimer à sa surface la molécule de CMH de classe II ainsi que la molécule de costimulation B7, contrairement aux macrophages et aux cellules B qui nécessitent une activation. La cellule dendritique naïve est résidente au niveau des tissus. Elle provient des cellules souches hématopoïetiques de la moelle osseuse et, selon sa localisation, elle peut provenir de la lignée lymphoïde ou myéloïde. De façon générale, la cellule dendritique à pour fonction d'apprêter et de présenter des antigènes aux lymphocytes T de façon à activer le système immunitaire adaptatif. Ces antigènes peuvent provenir de cellules infectées par un virus ou un microorganisme, ou encore, de cellules du soi qui sont altérées. Normalement, lorsque des antigènes exogènes sont internalisés ils doivent être dégradés par la voie endocytaire d'apprêtement et de présentation de l'antigène. Les peptides ainsi créés sont présentés uniquement complexés aux molécules de CMH de classe II. Par contre, la cellule dendritique a la propriété de pouvoir transférer des antigènes exogènes dans la voie de présentation du CMH de classe I. Pour se faire, elle libère (par un mécanisme moléculaire encore inconnu) dans le cytoplasme les

5 protéines internalisées qui sont contenues dans les endosomes. Une fois les peptides antigéniques dégradés, elle doit les présenter aux lymphocytes T pour activer le système immunitaire [6]. La cellule dendritique possède à sa surface des récepteurs qui lui permettent de détecter tout dommage ou destruction non physiologique des cellules, la présence de microorganismes et l'inflammation tissulaire. Lorsque ses récepteurs sont stimulés, la cellule dendritique acquière la capacité de migrer jusqu'aux organes lymphoïdes dû à une modification de ses récepteur de chémokines. Une fois au niveau des organes lymphoïdes, elle présente les peptides antigéniques couplés aux molécules de CMH aux lymphocytes T [7]. 1.3.2 Le lymphocyte T Il existe deux sous-populations de lymphocytes T : les lymphocytes T auxiliaires et les lymphocytes T cytotoxiques. Ces deux types de lymphocytes T peuvent être différenciés par la présence à leur surface de la molécule coréceptrice CD4 ou CD8. Ainsi, le lymphocyte T auxiliaire exprime généralement à sa surface le corécepteur CD4 (lymphocyte T CD4+) et le lymphocyte T cytotoxique exprime la molécule CD8 (lymphocyte T CD8+). Le corécepteur CD4 permet au lymphocyte T auxiliaire de reconnaître un complexe CMH-peptide dans le contexte du CMH de classe II. Ce dernier est retrouvé à la surface des APCs. Le corécepteur CD8 permet aux lymphocytes cytotoxiques de reconnaître le complexe CMH-peptide dans le contexte du CMH de classe I. Ce dernier est retrouvé à la surface de toutes les cellules nucléées. Le lymphocyte CD4+ a pour fonction de sécréter de nombreuses cytokines qui vont jouer un rôle important dans l'activation des autres cellules du système immunitaire comme les lymphocytes T CD8+, les lymphocytes B et les macrophages. Le lymphocyte T CD8+ possède, une fois activé, une activité cytotoxique. Il a pour fonction d'éliminer spécifiquement les cellules du soi qui sont altérées parmi lesquelles ont retrouve les cellules tumorales et les cellules infectées par un virus. C'est donc pourquoi les lymphocytes T CD8+ sont les cellules les plus importantes dans l'immunité anti-tumorale [6].

6 Le lymphocyte T naïf n'a jamais rencontré l'antigène pour lequel il est spécifique et ne peut pas avoir d'activité effectrice tant qu'il n'a pas été activé par une ACP. La rencontre de ces deux types de cellules s'effectue dans les organes lymphoïdes secondaires parmi lesquels on retrouve la rate et les ganglions. Les lymphocytes naïfs circulent de façon constante à travers les organes lymphoïdes secondaires. Ils passent donc du sang à la rate ou aux ganglions lymphatiques pour retourner dans la circulation sanguine. Un lymphocyte peut faire ce circuit jusqu'à une ou deux fois par jour. La circulation constante des lymphocytes permet d'augmenter la probabilité de rencontre entre une APC qui présente un complexe CMHpeptide précis et le lymphocyte qui lui est spécifique. Environ un lymphocyte sur 10 5 possède un récepteur spécifique pour un complexe CMH-peptide précis [6]. De plus, la circulation des lymphocytes T peut être nécessaire à leur survie. En effet, les lymphocytes T naïfs ont besoin d'un signal pour leur permettre de survivre en périphérie. Ce signal est fourni par le contact entre le lymphocyte T naïf et un complexe CMH-peptide du soi retrouvé à la surface des cellules dendritiques [8]. La circulation des lymphocytes T ainsi que leur activation initiale avec l'apc dépend d'interactions cellule-cellule qui ne sont pas spécifiques à l'antigène. Ces interactions sont contrôlées par des molécules d'adhésions retrouvées à la surface cellulaire du lymphocyte T et de la cellule avec laquelle il interagit. Parmi ces molécules d'adhésions, on retrouve principalement les sélectines, les intégrines et des membres de la superfamille des immunoglobulines. Les sélectines sont des molécules d'adhésions importantes pour le passage des lymphocytes vers les tissus. La L-Selectine est retrouvée à la surface des lymphocytes T naïfs et permet, avec l'aide des intégrines et des immunoglobulines, leur sortie du sang vers les organes lymphoïdes périphériques. La P-Selectine et la E-Selectine sont, quant à elles, exprimées à la surface de l'endothélium vasculaire des sites d'infections et permettent le recrutement des lymphocytes effecteurs vers les tissus endommagés. Pour ce qui est des intégrines, il s'agit d'une famille de protéines responsables des adhésions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire. Tous les lymphocytes T expriment à leur surface l'intégrine al(32 aussi appelée antigène associé à la fonction des lymphocytes 1 (LFA-1). Cette intégrine a pour fonction de permettre l'adhésion et l'arrêt des lymphocytes pendant leur processus d'extravasation ou de migration vers les tissus. Il s'agirait aussi de la molécule d'adhésion la plus importante pendant l'activation des lymphocytes T. Finalement, un grand nombre de

7 molécules d'adhésion appartiennent à la superfamille des immunoglobulines. On retrouve dans cette famille les molécules d'adhésion intercellulaire (ICAMs), ICAM-1, ICAM-2 et ICAM-3, qui se lient toutes à l'intégrine LFA-1 retrouvée à la surface de la cellule T. ICAM-1 et ICAM-2 sont retrouvées sur les cellules endothéliales ainsi que les APCs. Une fois liées elles auraient pour fonction d'empêcher les lymphocytes de passer au travers de la paroi des vaisseaux sanguins. ICAM-3 est retrouvée à la surface de tous les leucocytes et peut lier, en plus de LFA-1, la lectine DC-SIGN à la surface des cellules dendritiques. ICAM-3 joue donc un rôle important dans l'adhésion cellulaire entre le lymphocyte T et la cellule dendritique [8]. La rencontre entre le lymphocyte T et l'apc s'effectue par la liaison spécifique du TCR ainsi que sa molécule coréceptrice (CD4 ou CD8) au complexe CMH-peptide. Le nombre de complexe CMH-peptide minimum nécessaire à l'activation du lymphocyte T varie selon la classe de CMH impliqué et l'état de maturité du lymphocyte T. Pour le CMH de classe I, ce nombre peut varier de moins d'une dizaine à quelques milliers selon la combinaison de complexe CMH-peptide et les clones de lymphocytes T effecteurs impliqués [9]. Une étude a même démontré qu'il serait possible qu'un seul complexe CMH-peptide soit suffisant pour activer un lymphocyte T effecteur [10]. Pour ce qui est du CMH de classe II, de 200 à 400 complexes seraient suffisant pour induire la stimulation du lymphocyte. Par contre, pour obtenir une activation complète, 5000 complexes CMH-peptide seraient requis [11], Une activation complète se traduit par la production d'interleukine 2 (IL-2) et la prolifération du lymphocyte activé. La production d'il-2 commence à être détectée lorsque 1500 complexes sont utilisés pour activer un lymphocyte T naïf, alors qu'un lymphocyte effecteur en nécessite une centaine. Pour ce qui est de la réponse proliférative, un lymphocyte naïf à besoin d'être stimulé par 400 complexes CMH-peptide afin d'obtenir une prolifération détectable, alors qu'un lymphocyte effecteur en a besoin de 40 [12]. L'activation du lymphocyte T naïf nécessite deux signaux. Un lymphocyte T effecteur ne nécessite que la présence du premier signal pour pouvoir être activé et exercer son activité effectrice. Le premier signal d'activation est fourni par la liaison du TCR et du corécepteur à un complexe CMH-peptide qui lui est spécifique, ce qui indique à la cellule T que l'antigène a été rencontré. Ce signal induit la prolifération et la différenciation du lymphocyte T naïf, mais uniquement lorsque le deuxième signal est présent. Ce deuxième signal, qui est un signal de

X costimulation, est fourni par la liaison de la molécule B7, retrouvée à la surface de l'apc, avec la molécule CD28 du lymphocyte T [6, 8]. L'absence de ce signal résulte en une délétion ou une anergie du lymphocyte T naïf. Ce deuxième signal permet donc l'activation complète du lymphocyte T naïf. L'activation du lymphocyte T se traduit par une cascade intracellulaire de signaux biochimiques qui va mener à l'activation de facteurs de transcriptions responsables de l'activation du gène de l'il-2 ainsi qu'à la modulation de nombreux autres gènes qui vont permettre la prolifération et la différenciation du lymphocyte activé en lymphocytes effecteurs. Ces lymphocytes effecteurs forment une population qui possède un TCR spécifique contre un même antigène et qui a comme caractéristiques un niveau d'activation très bas (ne nécessitent que le premier signal d'activation) ainsi qu'une capacité élevée de production de cytokines ou d'induction de la mort cellulaire [13]. Une fois que le stimulus antigenique n'est plus présent dans l'organisme, la plupart des lymphocytes effecteurs qui lui étaient spécifiques meurent. La petite fraction de lymphocytes qui persiste est composée de lymphocytes T mémoires. Ces lymphocytes, persistent dans l'organisme dans un état quiescent et vont permettre une réactivation rapide du système immunitaire si le stimulus antigenique est à nouveau rencontré [6, 13]. 1.3.3 Recrutement des lymphocytes T infiltrant au niveau de la tumeur Lorsqu'une tumeur se développe, la cellule dendritique ingère par endocytose ou phagocytose des débris cellulaires provenant de la tumeur [6]. Les débris cellulaires qu'elle internalise peuvent provenir de corps apoptotiques, de cellules en nécrose et même de cellules tumorales intactes. La cellule dendritique dégrade ces débris cellulaires pour en faire des peptides antigéniques tumoraux qui vont être présentés à la surface cellulaire couplés aux molécules de CMH de classe I et de classe II. Lorsque la cellule dendritique reçoit un signal d'induction de maturation, qui peut être fourni par des facteurs proinflammatoires retrouvés dans le milieu tumoral ou par des cellules en train de mourir dans des conditions de stress, elle migre

9 jusqu'aux ganglions lymphatiques. Pendant cette migration, la cellule dendritique devient mature. Sa maturation se traduit par des changements au niveau moléculaire. Elle augmente, tout d'abord, la présentation des antigènes tumoraux à sa surface et réduit leur internalisation, puis elle augmente l'expression à sa surface de la molécule de costimulalion B7 [7, 14]. Une fois au niveau du ganglion, la cellule dendritique présente les complexes CMH-peptides antigéniques tumoraux aux lymphocytes T circulants. Le lymphocyte T qui arrive au niveau du ganglion se lie de façon transitoire aux cellules dendritiques qu'il rencontre. Cette liaison transitoire implique les molécules d'adhésion CD2, LFA-1 et ICAM-3 du lymphocyte T qui se lient respectivement avec les molécules LFA-3, ICAM-1, ICAM-2 et DC-SIGN à la surface de la cellule dendritique (LFA-1 se liant avec 1CAM-1 et ICAM-2) (figure 1.1). Cette liaison donne le temps au lymphocyte T d'échantillonner un grand nombre de complexes CMH-peptides tumoraux retrouvés à la surface de la cellule dendritique mature. Lorsqu'il y a reconnaissance d'un complexe CMHpeptide, le signal intracellulaire engendré chez le lymphocyte T cause, entre autre, un changement de conformation de la molécule LFA-1 [8]. Ce changement augmente son affinité pour les molécules d'adhésion ICAM-1 et ICAM-2 qui se traduit par la stabilisation de l'interaction entre le lymphocyte T et la cellule dendritique au niveau de leur point de contact, ce qui initie la formation de la synapse immunologique [7, 8]. Figure 1.1 : Molécules d'adhésion impliquées dans l'adhésion transitoire entre un lymphocyte T et une cellule dendritique. Cette figure est basée sur celle présentée par Janeway et al [8J.

10 L'association entre la cellule dendritique et le lymphocyte T peut durer de quelques minutes à quelques heures pendant lesquelles le lymphocyte est activé par la reconnaissance du peptide antigénique, ce qui cause la production d'il-2 et sa prolifération. Quatre à cinq jours après le début de la phase proliférative induite par l'il-2, les cellules T activées se différencient en lymphocytes T effecteurs capables de synthétiser toutes les molécules nécessaires à leurs fonctions spécialisées comme lymphocytes auxiliaires ou cytotoxiques. Une fois effecteurs, les lymphocytes T expriment à leur surface cellulaire un haut niveau de molécules d'adhésion LFA-1, CD2, et VLA-4. Ils perdent l'expression de la L-selectine, ce qui permet leur sortie du ganglion lymphatique, dans lequel ils se trouvaient, pour retourner en circulation. De plus, les changements au niveau de leurs molécules d'adhésion leurs permettent de lier spécifiquement l'endothélium situé au niveau du site tumoral. De cette façon, ils peuvent pénétrer au cœur de la tumeur pour exercer leurs fonctions effectrices afin d'éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses [6, 8, 15, 16]. 1.1.1 Destruction des cellules tumorales Une fois à l'intérieur de la tumeur, les lymphocytes T CD4+ et CD8+ vont coopérer afin de détruire les cellules tumorales. L'élimination directe des cellules cancéreuses est effectuée grâce à l'activité cytotoxique des lymphocytes CD8+. Lorsqu'un lymphocyte T CD8+ effecteur qui infiltre le tissu tumoral rencontre un complexe CMH-peptide antigénique pour lequel il est spécifique à la surface d'une cellule cancéreuse, il s'en suit une modification au niveau de l'expression des molécules d'adhésion ce qui entraîne la formation d'un conjugué entre les deux cellules (comme lors de la rencontre entre un lymphocyte naïf et une APC). Le conjugué reste formé pendant 5 à 10 minutes, ce qui permet au lymphocyte CD8+ d'exercer son activité cytotoxique. Il est possible pour lui d'éliminer spécifiquement plus d'une cellule tumorale parce que chaque fois que son TCR est lié, lors de la reconnaissance d'une cellule tumorale, les enzymes de destruction sont à nouveau synthétisées [6, 8]. Le lymphocyte

Il réorganise son Golgi, ses microtubules ainsi que ses granules de stockage de façon à diriger spécifiquement la sécrétion vers son point de contact avec la cellule tumorale. La réorganisation permet une destruction spécifique de la cellule tumorale, ce qui n'entraîne pas de dommage au tissu sain. Par la suite, il y a une augmentation de la concentration de calcium intracellulaire du lymphocyte dû à la reconnaissance du complexe CMH-peptide menant au relâchement des granules lytiques. Les granules ont été synthétisés pendant la maturation du lymphocyte en lymphocyte effecteur suite à la rencontre de l'apc au niveau du ganglion lymphatique. Se sont des lysosomes modifiés qui contiennent deux types de protéines cytotoxiques, une perforine et des serines protéases appelés granzymes. Les enzymes sont stockés sous une forme active à l'intérieur des granules lytiques, mais les conditions à l'intérieur des granules inhibent leur activité. Ce n'est qu'une fois relâchés au niveau de la zone de contact entre le lymphocyte et la cellule cancéreuse qu'ils peuvent exercer leur activité cytotoxique. Les perforines se polymérisent pour former des pores cylindriques, au niveau de la membrane plasmique de la cellule cancéreuse, qui détruisent l'intégrité de la membrane cellulaire. De leurs côtés, les granzymes sont des protéases qui initient la mort cellulaire par apoptose en activant la voie des caspases [6, 8]. Elles pénètrent la cellule cible par un mécanisme dépendant de l'énergie mais indépendant des perforines. Toutefois, la présence des perforines est requise pour que les granzymes puissent initier l'apoptose et être transloquées au niveau du noyau de la cellule cible [17, 18]. L'apoptose de la cellule cancéreuse se traduit par l'altération de la morphologie cellulaire, la formation de vésicules au niveau du noyau et la fragmentation de l'adn en segments de 200 paires de bases. 1.1.2 Les lymphocytes T infiltrant le cancer du sein Les lymphocytes T infiltrants (TILs) que l'on retrouve dans le cancer du sein sont majoritairement des lymphocytes T CD4+. Ceux-ci sont subdivisés en deux groupes selon l'expression à leur surface de la molécule CD25. Le CD25 est la chaîne a du récepteur de 1TL-2. Il est exprimé de façon transitoire à la surface des lymphocytes T suite à leur activation, mais de façon constitutive à la surface des lymphocytes T régulateurs (Treg). Les

12 cellules CD4+CD25+ ont une fonction d'inhibition du système immunitaire et seront décrites en détails à la section 1.2.2. Parmi les TILs, on retrouve aussi des lymphocytes T CD8+, mais en moins grand nombre que les lymphocytes T CD4+ et dans quelques cas de cancer du sein des lymphocytes T NK (pour «natural killer») [19-22]. D'un point de vue cinétique, il semble que lorsque la quantité de TILs augmente au niveau de la tumeur avec le temps, il y a diminution de la quantité de lymphocytes T CD4+ et augmentation de la population de lymphocytes T CD8+ (bien que la population de CD4+ reste toujours la plus importante) [21, 22]. Au niveau du cancer du sein, on ne retrouve pas seulement des lymphocytes T qui infiltrent le tissu tumoral mais aussi des lymphocytes B, des cellules NK et des macrophages. Toutes ces cellules peuvent participer, à leur façon, à l'immunité anti-tumorale. Par contre, elles sont retrouvées en nombre beaucoup moins important que les TILs [19, 23]. Il a été démontré que les TILs présents au niveau du cancer du sein possèdent un phénotype activé puisqu'ils expriment à leur surface des molécules spécifiques à leur activation comme le CD25, CD44, CD69, et le CD95. En revanche, ils ne parviennent pas à stopper la progression tumorale malgré le fait qu'ils soient activés [20-23]. 1.2 Environnement tumoral La présence d'un système immunitaire actif au sein de la tumeur mène à la sélection des cellules tumorales les moins immunogéniques, ce qui permet à la tumeur de ne plus être reconnue par le système immunitaire. Ce phénomène est appelé immunoédition et peut être divisé en trois phases, soit l'élimination, l'équilibre et l'évasion (figure 1.2) [18].

u Figure 1.2 : Les trois phases de l'immunoétition 24. La phase d'élimination correspond à l'éradicalion efficace des cellules tumorales qui se développent. La phase d'élimination débute lorsque le système de surveillance intrinsèque ne réussi plus à contrôler la croissance cellulaire. Le système de surveillance intrinsèque inclut les facteurs contrôlant la réparation de l'adn, la régulation de l'apoptosc cl l'inhibition des contacts intercellulaires. Cette phase consiste en une action combinée du système immunitaire inné et acquis. Elle est initiée lorsque survient un remodelage du stroma causé par l'angiogénèse et l'invasion du tissu par les cellules tumorales. Ces dommages causés au tissu peuvent mener à la production de molécules pro-infiammatoires. Ces dernières, ainsi que les cytokines produites par les cellules tumorales elles-mêmes, délivrent un signal de danger aux cellules du système immunitaire inné, ce qui permet leur recrutement au niveau du site tumoral. Les cellules NK, yôt et les lymphocytes T NK. sont ainsi recrutés et sécrètent de l'interféron gamma (IFN-y), qui est une cytokine importante pour la réponse anti-tumorale, suite à la reconnaissance des cellules cancéreuses. L'IFN-y permet la sécrétion locale de chémokincs qui entraînent, à leur tour, le recrutement d'encore plus de cellules du système immunitaire inné. Lorsque les cellules NK tuent les cellules tumorales en induisant leur apoptosc, les antigènes tumoraux provenant de ces cellules deviennent disponibles et

14 permettent de recruter le système immunitaire adaptatif via les cellules dendritiques (voir la section Erreur! Source du renvoi introuvable.)- Une fois que les lymphocytes T CD4+ et CD8+ sont recrutés au niveau de la tumeur, les lymphocytes T CD8+ tuent spécifiquement les cellules tumorales et les cellules T CD4+ leurs fournissent les cytokines nécessaires pour leur bon fonctionnement (figure 1.3)[18, 24]. 1 Inflammation CIM+TCell Figure 1.3 : Fonctions des cellules T dans l'activité anti-tumorale [25]. La phase d'équilibre est la phase la plus longue de l'immunoédition et peut s'étendre sur une période de plusieurs années chez l'homme. Elle correspond à un équilibre dynamique entre les cellules tumorales qui ont survécu à la phase d'élimination et les cellules du système immunitaire. Les cellules du système immunitaire parviennent à contenir les cellules tumorales en exerçant une sélection sur ces dernières. Par contre, l'hétérogénéité et l'instabilité génétique des cellules tumorales leur permettent de développer des mécanismes d'évasion du système immunitaire [18, 24]. Parmi les instabilités génétiques répertoriées chez les cellules cancéreuses, on retrouve une instabilité au niveau : des chromosomes, des microsatellites et de la réparation par excision nucléotidique [24]. Ainsi, même si la plupart

15 des cellules qui sont à l'origine du développement tumoral sont éliminées, de nouvelles cellules comportant des mutations qui leur confèrent une immunogénicité réduite surgissent. Finalement, la phase d'évasion est la phase de croissance de la tumeur. Les cellules tumorales qui ont été sélectionnées au cours de la phase d'équilibre ne sont plus contenues par le système immunitaire et se multiplient pour enfin devenir cliniquement détectables. Pour y parvenir, les cellules tumorales doivent acquérir des techniques d'évasion du système immunitaire inné et adaptatif [18, 24]. Parmi celles-ci, on retrouve la sécrétion de cytokines immunosuppressives, la résistance à l'apoptose et la perte d'expression des molécules de costimulation et des molécules de CMH. De plus, la phase d'évasion est également favorisée par le fait que l'environnement tumoral ne soit pas un milieu propice pour le bon fonctionnement du système immunitaire à cause de la présence de Tregs, de cellules dendritiques non fonctionnelles et de l'induction de l'anergie des cellules T [18, 21, 24, 26-29]. Dans cette section, seuls les éléments se rapportant au cancer du sein seront abordés. 1.2.1 Système d'évasion des cellules tumorales Pendant l'immunoédition, la pression sélective exercée sur les cellules tumorales entraîne la sélection des cellules possédant des mécanismes de résistance au système immunitaire. Dans le cas du cancer du sein, on répertorie entre autre la sécrétion de cytokines inhibitrices, la perte d'expression des molécules du CMH de classe I, la perte des molécules de costimulation, la perte d'expression du FAS et l'expression du ligand de Fas (FasL) [30]. Les cellules tumorales, comme les cellules stromales qui composent le tissu du cancer du sein, sont reconnues pour sécréter différentes cytokines dans le milieu tumoral comme le VEGF, FIL-10 et le facteur de croissance tumoral P (TGF-(3). Ces cytokines agissent sur les cellules du système immunitaire ainsi que sur les cellules tumorales. Elles induisent une suppression locale des TILs, affectent la maturation des cellules immunitaires et finalement, favorisent l'angiogénèse et la prolifération des cellules tumorales elles-mêmes. Le VEGF cause la prolifération des cellules endothéliales de façon à développer un réseau vasculaire tumoral. De

16 plus, il favorise l'invasion et la migration des cellules tumorales et agit comme facteur de survie pour les cellules métastasiques [8]. Par contre, le VEGF inhibe la maturation et la fonction des cellules dendri tiques, ce qui peut conduire à l'induction de la suppression du système immunitaire. En effet, si un lymphocyte T est stimulé par une cellule dendritique immature, son activation n'est pas complète dû à l'absence de molécules de costimulation et il devient alors anergique ou éliminé de la circulation [27, 30]. Le TGF-P induit une inhibition directe de la différenciation des cellules T [21]. Finalement, l'il-10 agit sur le système immunitaire en inhibant la différenciation, la maturation et la fonction des cellules dendritiques. De plus, l'il-10 permet aux cellules tumorales de ne plus être reconnues par les TILs parce qu'elle entraîne une perte d'expression des molécules de CMH de classe I en inhibant la production de la protéine associée à l'apprêtement de l'antigène (TAP) [26, 31]. La perte d'expression des molécules de CMH de classe I est fréquente dans le cas du cancer du sein. Généralement, cette perte est associée avec l'augmentation du grade tumoral parce qu'elle rend les cellules tumorales faiblement immunogénique. Les cellules tumorales ne sont donc plus détruites par les lymphocytes T CD8+ puisque ces dernières reconnaissent les cellules tumorales grâce à la présence des complexes CMH-peptides tumoraux à leur surface [30]. Par contre, la perte des molécules de CMH de classe I par les cellules tumorales peut entraîner leur reconnaissance et leur destruction par les cellules NK du système immunitaire inné [18, 26, 32]. Il existe quatre classes de mécanismes menant à une altération des molécules de CMH de classe 1:1) une instabilité du complexe CHM-peptide causé par la perte de la pv microglobuline (pvm) (la pvm s'associe à la chaîne a du CMH pour former la molécule de CMH de classe I), la perte des molécules TAP ou un défaut structurel de la molécule de CMH ; 2) une recombinaison mitotique ou une non disjonction du chromosome contenant les gènes codant pour le CMH de classe I ; 3) la perte de l'allèle codant pour le CMH de classe I entraînée par une mutation ou une délétion partielle ; 4) la perte d'expression du locus codant pour les gènes du CMH de classe I dû à un problème au niveau de la transcription [32]. Il arrive fréquemment dans le cancer du sein que les cellules perdent l'expression des molécules de costimulation. Elles sont donc incapables d'activer correctement les lymphocytes T CD8+, ce qui entraîne la tolérance de l'antigène par le système immunitaire grâce au mécanisme d'anergie ou de délétion des lymphocytes T [26, 30].

17 L'élimination des cellules tumorales par les lymphocytes T CD8+ se fait habituellement par la libération de granules cytotoxiques, mais elle peut aussi s'effectuer par la voie du Fas. Cette voie conduit à la mort cellulaire par apoptose de la cellule exprimant le Fas à sa surface. Suite à la reconnaissance d'une cellule tumorale, le FasL, qui est un trimère exprimé à la surface du lymphocyte T CD8+, se lie au Fas retrouvé à la surface de la cellule tumorale et induit sa trimérisation. Cette trimérisation cause le rapprochement du domaine de mort retrouvé sur les molécules de Fas. Des molécules adaptatrices appelées FADD (protéines associées à Fas possédant un domaine de mort) se lient aux domaines de morts du Fas ainsi qu'à celui de la pro-caspase 8. La pro-caspase devient active suite à la liaison et entraîne l'activation de la cascade des caspases qui conduit à l'apoptose de la cellule cible [6, 8, 18]. Dans le cancer du sein, les cellules tumorales perdent l'expression à leur surface du Fas ou la sensibilité à celuici, mais acquièrent par contre l'expression constitutive du FasL. Cette combinaison d'événements permet à la cellule tumorale de ne plus être détruite par la voie du Fas lorsqu'un lymphocyte T CD8+ la reconnaît. De plus, elle lui permet d'induire la mort de la cellule du système immunitaire par la voie du Fas, puisque cette dernière exprime le Fas à sa surface [18, 30]. 1.2.2 Lymphocytes T régulateurs Pendant l'immunoédition, des facteurs extérieurs aux cellules tumorales peuvent influencer l'efficacité du système immunitaire, comme par exemple la présence des Tregs. Les Tregs sont des lymphocytes CD4+CD25+ qui ont pour fonction l'inhibition du système immunitaire pour prévenir l'auto-immunité ou l'infection chronique, ce qui conduit à la tolérance de l'antigène impliqué [14, 18, 25, 26, 28, 30, 33, 34]. Dans un état non pathologique, ils représentent environ cinq à dix pourcent de la population totale de lymphocytes CD4+ [14, 30, 34]. Les Tregs sont problématiques dans le cas du cancer du sein, bien que leur fonction et leur phénotype ne soient pas affectés, car ils sont retrouvés en nombre deux fois plus important que chez les personnes saines au niveau du sang périphérique [30, 35]. De plus, ils sont retrouvés à l'intérieur même de la tumeur et font, par conséquent, partie des TILs.

18 L'expansion des Tregs et leur présence au sein de la tumeur interfère avec le bon fonctionnement des lymphocytes T effecteurs ce qui réduit l'efficacité de l'immunité antitumorale [25]. Leur origine ainsi que leur fonctionnement ne sont pas encore bien compris. Il semblerait qu'un ligand encore non identifié soit responsable de leur génération au niveau intrathymique ainsi que de leur activation au niveau périphérique. Les Tregs auraient donc la capacité de reconnaître des ligands agonistes du soi. La génération intrathymique n'est pas la seule source possible de Tregs. En effet, il serait possible qu'une stimulation avec un peptide agoniste dans des conditions immunogéniques sous-optimales, c'est-à-dire, en présence d'une petite concentration de peptide ainsi qu'un manque de costimulation, puisse entraîner la conversion de lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes Tregs [36]. Apparemment, les Tregs effectueraient le même cheminement que les lymphocytes T naïfs avant d'arriver au tissu lésé. Ils recirculeraient donc dans le corps via les réseaux lymphatiques et sanguins, puis ils seraient activés au niveau des ganglions lymphatiques où ils se multiplieraient avant de migrer jusqu'au tissu inflammé [36]. Une fois activés, ils ont la propriété d'inhiber la fonction, la prolifération et la sécrétion de cytokines des lymphocytes T CD4+CD25- et CD8+ [14, 18, 26, 34]. Le mécanisme de suppression principal serait l'inhibition de la transcription de 1TL-2 [14, 34, 36]. L'inhibition des lymphocytes T pourrait être causée par un contact cellule-cellule et/ou par la sécrétion de cytokines, comme le TGF-P et 1TL-10, par les Tregs. Il existe, à l'heure actuelle deux scénarios proposés pour l'inhibition par contact cellule/cellule : elle pourrait s'effectuer par contact direct ou indirect entre le Treg et le lymphocyte T (figure 1.4). Les deux scénarios impliquent la rencontre des deux types cellulaires au niveau d'une cellule présentatrice de l'antigène, les deux cellules se liant à la cellule présentatrice via leur TCR. Dans le premier cas, la molécule CTLA-4 du Treg lierait les molécules CD80 et CD86 (qui correspondent aux molécules de costimulation B7.1 et B7.2 respectivement) ce qui causerait la suppression de la cellule T. Dans le second scénario, le CTLA-4 du Treg se lierait encore au CD80 et CD86, mais cette fois-ci, au niveau de la cellule présentatrice de l'antigène. Cette liaison entraînerait l'activation de l'indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO). LTDO est impliquée dans le métabolisme du tryptophane, un acide aminé. Son activation cause une réduction du tryptophane libre ce qui interférerait avec l'activation du lymphocyte T [36]. Une fois que les lymphocytes T sont inhibés, ils pourraient eux-mêmes devenir inhibiteurs en sécrétant des

19 cytokines inhibitrices comme le TGF-(3 et/ou l'il-10 [14, 34, 36]. Par contre, il semblerait que l'inhibition de la fonction des lymphocytes T CD4+CD25- et CD8+ soit réversible. CTLA-4 - CD60/86 Clor Activation i Tryplophan 1 â T efteckw Activation i CTLA-4 - CD80/86 Figure 1.4 : Mécanismes de suppression des Tregs [36]. 1.4.3 Cellules dendritiques Les cellules dendritiques peuvent, elles aussi, influencer l'efficacité du système immunitaire si leur capacité de maturation est affectée. Le développement du cancer est associé à la production locale de cytokines pro-inflammatoires. Elles stimulent la maturation terminale des cellules dendritiques qui migrent, par la suite, jusqu'aux ganglions lymphatiques pour activer et recruter des lymphocytes T au niveau du site tumoral. Par contre, la sécrétion de cytokines inhibitrices (TGF-p\ IL-10 et glucocorticoïdes) par les cellules stromales et tumorales modulent les propriétés fonctionnelles des cellules dendritiques en cours de maturation, ce qui cause une conversion. Ces dernières passent d'une fonction d'activation du système

immunitaire vers une fonction d'induction de tolérance. L'IL-10 n'a d'effet que sur les cellules dendritiques immatures puisqu'elles perdent l'expression du récepteur pour l'il-10 durant leur phase terminale de différenciation. L'IL-10 affecte la maturation des cellules dendritiques en réduisant leur expression de molécules de CMH de classe II, de molécules costimulatrices et de molécules d'adhésion ainsi qu'en réduisant la production de cytokines (IL-12). Le TGF-P cause aussi une altération de la différenciation des cellules dendritiques en induisant un arrêt irréversible de leur maturation [14]. Les cellules dendritiques immatures induisent l'anergie des lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques pour les complexes CMHpeptides qu'elles présentent et favorisent ainsi la croissance tumorale. La tolérance des antigènes tumoraux peut être la conséquence d'un manque de costimulation des cellules dendritiques. Il en résulte donc une faible activation du lymphocyte T qui se traduit par une faible prolifération suivi d'une phase rapide de contraction où la presque totalité des lymphocytes générés meurent. De plus, suite à l'induction de leur anergie, les lymphocytes T, eux-mêmes, acquièrent la capacité de supprimer l'activité des autres cellules T. Dans le cas du cancer du sein on retrouve des cellules dendritiques à l'intérieur même ainsi qu'en périphérie de la tumeur [30, 37]. Les cellules retrouvées en périphérie sont des cellules dendritiques à l'état mature. Cette localisation indique la présence d'une réponse immunitaire active dirigée spécifiquement contre la tumeur, puisque normalement les cellules dendritiques matures ne sont retrouvées que dans les organes lymphoïdes secondaires, où elles présentent leurs antigènes aux lymphocytes T naïfs. Au niveau du nodule lymphatique sentinelle, qui est le premier nodule à recevoir la lymphe provenant de la tumeur, on retrouve des cellules dendritiques possédant aucune ou de très petites dendrites, alors que normalement elles devraient avoir de longues protubérances cellulaires. Les cellules dendritiques intratumorales possèdent, quant à elles, un phénotype immature et sont retrouvées en nombre beaucoup plus important que dans le tissu mammaire sain. L'infiltration des cellules dendritiques pourrait être causée par la sécrétion d'une cytokine appelée protéine inflammatoire des macrophages 3a (MIP3a) par les cellules tumorales [37]. Finalement, on retrouve, au niveau du sang périphérique, un nombre de cellules dendritiques anormalement bas chez les patients atteints du cancer du sein et ce jusqu'à six mois après une chimiothérapie. Par contre, ce nombre revient à la normale seulement six semaines après une chirurgie. Il semblerait donc que le

21 cancer du sein affecte directement les cellules dendritiques sur plusieurs aspects dont leur maturation, leur fonction, leur localisation et leur nombre [30]. 1.4.4 Antigènes associés aux tumeurs Les cellules dendritiques présentent à leur surface des antigènes associés à la tumeur (TAAs) afin d'activer une réponse du système immunitaire dirigée contre les cellules tumorales qui expriment ces mêmes antigènes. Lors de la phase d'évasion de l'immunoédition, il est possible que le manque de costimulation des cellules dendritiques, comme des cellules tumorales, induise une tolérance du système immunitaire envers ces TAAs. De plus, dû à leur instabilité génétique, les cellules tumorales peuvent perdre l'expression des TAAs ce qui empêche leur reconnaissance par les lymphocytes T qui leurs sont spécifiques. Par contre, la perte des TAAs dans le cancer du sein n'est pas un fait fréquent. Les TAAs du cancer du sein, comme ceux de beaucoup d'autres cancers, sont des antigènes du soi. Donc les lymphocytes qui possédaient un TCR de haute affinité spécifique aux peptides antigéniques dérivés de ces TAAs ont été éliminés pendant leur maturation dans le thymus afin d'éviter une réaction auto-immune [26, 28, 30]. Il ne reste en circulation que les lymphocytes T possédant un TCR de faible affinité pour les peptides antigéniques dérivés de ces TAAs, ce qui les rend difficilement activables. Les TAAs du cancer du sein peuvent provenir de quatre sources : 1) de protéines mutées, 2) de protéines non mutées mais qui sont exprimées en quantité anormale au niveau de la cellule, 3) de protéines normales qui ont une distribution tissulaire anormale ou 4) de protéines normales mais qui ne devraient pas être exprimées à ce stade du développement. Jusqu'à aujourd'hui, plusieurs TAAs du cancer du sein ont été identifiés bien qu'ils ne soient pas exclusifs à ce cancer. Parmi ceux-ci, on retrouve : HER2, MUCl, p53, htert et la survivine [30]. HER2 provient du proto-oncogène c-erb-b2/her2/neu. Il est surexprimé dans environ 20 à 30% des cas de cancer du sein et est associé avec un mauvais pronostic [27, 30]. La mucine (MUCl) est une protéine hautement glycosylée qui est exprimée au niveau du tissu mammaire pendant la lactation. Dans le cancer du sein, cette protéine est surexprimée et

contient des modifications au niveau de sa glycosylation. Généralement, ce TAA est retrouvé dans les cancers du sein de faible grade histologique qui sont positifs pour le récepteur à l'œstrogène et il est associé avec un bon pronostic. Pour sa part, p53 est un gène suppresseur de tumeur qui code pour une protéine importante dans l'arrêt du cycle cellulaire. Elle est retrouvée mutée dans 20 à 40% des cas de cancer du sein et joue un rôle important dans la croissance tumorale. La transcriptase inverse de la télomérase (htert) est responsable du maintient de l'intégrité des télomères. Cette protéine, qui n'est normalement pas retrouvée au niveau du tissu mammaire, est présente dans plus de 90% des cas de cancer du sein et est une des responsables de l'immortalité des cellules tumorales. Finalement, la survivine est un TAA universel. Cette protéine fait partie de la famille des protéines inhibitrices de l'apoptose est n'est généralement pas présente au niveau du tissu mammaire [30]. 1.4.5 Système en constante évolution La tumeur et le système immunitaire sont en constante évolution. Une fois que les lymphocytes T effecteurs pénètrent au sein de la tumeur, ils se retrouvent dans un milieu extrêmement inhibiteur qui n'est pas du tout favorable à leur bon fonctionnement. Suite à leur arrivée dans cet environnement, la grande majorité d'entre eux deviennent non fonctionnels. La petite population de lymphocytes effecteurs encore actifs n'est pas de taille pour éliminer rapidement et efficacement toutes les cellules tumorales pour lesquelles ils sont spécifiques. De plus, dû à l'instabilité génétique des cellules tumorales, celles-ci modifient continuellement les antigènes cellulaires incluant les TAPs. Les TILs encore actifs ne peuvent donc plus les reconnaître. Par contre, ces nouveaux antigènes tumoraux sont présentés par les cellules dendritiques à des lymphocytes T naïfs, ce qui cause une activation et un recrutement de nouveaux lymphocytes T effecteurs au niveau de la tumeur. C'est donc dire qu'il y a, à tout moment, présence d'un système immunitaire actif au sein de la tumeur.

23 1.5 Objectifs de recherche Les travaux présentés dans ce mémoire visent à la manipulation du système immunitaire pour le traitement du cancer du sein. L'hypothèse de travail a été qu'il serait possible de prendre avantage des cellules immunitaires déjà présentes dans le tissu tumoral pour élaborer une stratégie thérapeutique. Bien que les TILs encore fonctionnels sont en nombre insuffisant pour avoir un effet marqué sur la réduction de la masse tumorale et qu'ils se trouvent dans un milieu inhibiteur qui n'est pas favorable à leur développement, nous pensons qu'en les isolant et en leur fournissant un milieu favorable à la croissance in vitro, ils pourraient se multiplier suffisamment pour avoir un impacte au niveau de la tumeur. Afin de démontrer cette hypothèse, nous avons créé un système permettant d'extraire spécifiquement du tissu tumoral les TILs activés avant qu'ils ne soient inhibés par leur environnement. Nous avons utilisé un marqueur cellulaire inductible suite à l'activation des TILs. Le CD19, une molécule qui est exprimée uniquement à la surface des lymphocytes B, a été choisie pour cette stratégie d'isolement. Un gène codant pour une version tronquée du CD19 (ACD19), ne contenant pas la partie intracytoplasmique de la molécule, a été rendu inductible par le promoteur minimum de 1TL-2. Nous avons choisi ce promoteur parce que la production d'il-2 est spécifique aux lymphocytes T et qu'elle est induite uniquement lors de leur activation (voir section 1.6.2 et 1.6.3). En résumé, nous voulons modifier des lymphocytes T pour qu'ils contiennent un gène codant pour un marqueur cellulaire sous la direction du promoteur minimum de l'il-2. Une fois activés, ils exprimeraient une molécule qu'ils ne possèdent normalement pas à leur surface ce qui nous permettrait de les isoler spécifiquement. Pour y parvenir, nous avons dû nous fixer plusieurs objectifs. Le premier était de construire un vecteur inductible dépendant de l'activation des TILs. Par la suite, l'objectif était de caractériser la fonctionnalité du vecteur en vérifiant sa stabilité et son inductibilité. Puis, il a fallu démontrer qu'il était possible d'isoler (de trier) spécifiquement les cellules exprimant le marqueur cellulaire choisi. Notre prochain but consistait à mettre en place un modèle tumoral chez la souris de façon à tester notre hypothèse in vivo. Finalement, notre dernier objectif a été de développer des conditions de transduction des lymphocytes T humains et des précurseurs de cellules T murines.

24 Hypothèse : Il serait possible de bâtir une stratégie anti-tumorale en isolant et en mettant en expansion les TILs activés. But principal : Mettre au point un système d'isolement des TILs activés. Buts secondaires : o Construction d'un vecteur inductible o Caractérisation du vecteur o Mise au point des conditions de transduction des lymphocytes o Tri des cellules activées o Mise au point d'un modèle in vivo r 1.6 Eléments de la stratégie Jusqu'à maintenant, les cellules du système immunitaire impliquées dans l'activité antitumorale ainsi que l'environnement tumoral ont été abordés. La section suivante traite des différents éléments composants la stratégie soit le CD19, l'activation du lymphocyte T et l'il- 2. 1.6.1 CD19 Le CD19 est une molécule de 95 kilodaltons retrouvée à la surface des cellules B [38-40]. Il fait partie du complexe du corécepteur de la cellule B, tout comme les molécules CD21 (récepteur 2 du complément) et CD81 [41]. Le CD 19 possède trois domaines extracellulaires, dont deux contiennent un repliement immunoglobulinique caractéristique du système

25 immunitaire adaptatif, ainsi qu'une longue queue cytoplasmique d'environ 240 acides aminés (aa) hautement conservée entre les espèces comme l'homme, la souris et le cochon (figure 1.5) [40]. Lors de l'activation du lymphocyte B, le CD19 a pour fonction de contribuer à la signalisation intracellulaire par l'entremise de sa queue cytoplasmique [38-40, 42]. Tout débute par la liaison du fragment C3d du complément à un antigène microbien. L'antigène ainsi marqué peut être lié par le récepteur de la cellule B ainsi que par le CD21 retrouvé à sa surface. Cette liaison croisée de l'antigène entraîne le rapprochement et le regroupement du corecepteur et du récepteur de la cellule B, ce qui occasionne la phosphorylation de résidus tyrosines de la queue cytoplasmique du CD 19 par les protéines kinases associées au récepteur. Une fois phosphorylé, le CD19 peut lier les tyrosines kinases de la famille Src ainsi que 1TP3- kinase (phosphatidylinositol 3-OH kinase), ce qui contribue à l'augmentation du signal intracellulaire [8, 41]. La liaison du corecepteur au récepteur de la cellule B permet d'augmenter le signal intracellulaire de 1000 à 10 000 fois. Dans les cas où l'activation du lymphocyte B ne passe pas par le CD21 (n'implique pas de fragment C3d lié à l'antigène), il est possible que le CD19 seul puisse contribuer à l'augmentation du signal intracellulaire [8, 42]. Chez le lymphocyte B, l'engagement du récepteur (et du corecepteur) mène à l'activation de trois sentiers intracellulaires qui vont, chacun, entraîner l'activation d'un facteur de transcription qui, à leur tour, induisent la transcription des gènes nécessaires à la prolifération et la différenciation cellulaire [8, 38]. Les sentiers d'activation empruntés ainsi que les facteurs de transcription impliqués sont les mêmes que lors de l'activation du lymphocyte T (voir section : 1.6.2).

26 Exon 1 Exon 7 ^oo B ' n 19 m"" " 540? îfl * COOH exon 14 Figure 1.5 : Représentation du CD19 humain [40.

1.6.2 Activa lion des lymphocytes T Lors de l'activation du lymphocyte T, le TCR à pour fonction la reconnaissance de peptides associés aux molécules du CMH présentés par la cellule présentatrice de l'antigène. La transmission du signal d'activation intracellulaire n'est pas assurée par le TCR, mais plutôt par le complexe CD3 et les chaînesç. Le complexe CD3 est composé de trois chaînes invariables différentes (CD3y, CD38 et CD3e) formant deux hétérodimères [6, 8, 43]. L'activation de la cellule T se traduit par une succession d'événements qui débute par l'activation de deux protéines kinases de la famille Src, Fyn et Lck. Chez le lymphocyte T non activé, ces deux protéines kinases sont maintenues dans un état inactif par la protéine tyrosine kinase Csk (kinase de la famille Src en C-terminal) qui phosphoryle une tyrosine à leur extrémité carboxy terminale [8, 43]. Une fois que le TCR reconnaît un complexe CMH-peptide, le CD45, qui est une tyrosine phosphatase transmembranaire, peut éliminer le phosphate situé sur la tyrosine inhibitrice de Fyn et Lck et ainsi permettre leur activation [6, 8, 13]. Une fois activée, Fyn peut s'associer aux queues cytoplasmiques du CD3 et des chaînesç et ainsi permettre la translocation du corécepteur (CD4 ou CD8) au niveau du TCR. Cette translocation permet à Lck, qui est associée avec le corécepteur, de s'associer avec les queues cytoplasmiques du CD3 et des chaînesç. Une fois à ce niveau, Fyn et Lck phosphorylent des motifs appelés ITAM (motif permettant l'activation des immunorécepteurs via une tyrosine) qui composent le CD3 et les chaînesç [6, 8, 13, 43]. La phosphorylation des ITAMs est le point de départ du processus de transmission du signal d'activation intracellulaire. Cette phosphorylation permet le recrutement de la protéine tyrosine kinase ZAP-70 (protéine associée à zêta) au niveau du CD3 et sa liaison aux ITAMs via ses domaines SH-2 (domaines d'homologie Src-2). La protéine ZAP-70 peut, par la suite, être activée par phosphorylation grâce à Fyn ou Lck. Une fois activée, ZAP-70 a pour substrat les protéines SLP-76 (protéine de leucocyte contenant des domaines SH-2) et LAT (lien d'activation dans les cellules T). Ces protéines n'ont pas de fonction catalytique, mais fonctionnent plutôt comme des molécules adaptatrices et de liaison, qui permettent le lien entre des protéines proximales et distales [8, 13, 43]. Leur recrutement conduit à l'activation de trois voies intracellulaires qui permettent de transmettre le signal provenant du récepteur activé jusqu'au niveau du noyau. De ces trois sentiers, deux sont initiés

par l'enzyme PLC-y (phospholipase C-y). Cette dernière hydrolyse un phospholipide membranaire, le PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-biphosphate), en IP3 (ionositol 1,4,5- triphosphate) et en DAG (diacylglycérol). Chacun des composés ainsi formés initie une voie de signalisation intracellulaire. L/IP3, pour sa part, cause une augmentation de calcium (Ca 2+ ) au niveau intracellulaire, ce qui active la calcineurine qui est une phosphatase dépendante de la calmoduline. La calcineurine activée déphosphoryle le facteur de transcription NF-AT (facteur nucléaire des lymphocytes T activés) qui se trouve au niveau du cytoplasme. Cette déphosphorylation provoque sa translocation au niveau du noyau où il agit en tant que régulateur de la transcription. Le DAG cause, avec l'aide de l'augmentation de Ca 2+, l'activation de la protéine kinase C (PKC). La PKC phosphoryle la molécule 1K-B, ce qui cause la libération du facteur de transcription NF-KB. Le facteur de transcription ainsi libéré, passe du cytoplasme au noyau de la cellule. Finalement, la troisième voie de signalisation est initiée par l'activation de la petite protéine G, Ras. Une fois activée, elle permet l'initiation de la voie des MAP kinases (protéine kinase activée par un mitogène). Cette voie consiste en une cascade de phosphorylation de MAP kinase. Une MAPKKK active une MAPKK qui active à son tour une MAPK qui va activer, au niveau du noyau, le facteur de transcription Fos. Il est important de mentionner que le signal de coactivation, induit par la liaison du CD28 et de B7, permet l'activation d'une quatrième voie intracellulaire impliquant une autre petite protéine G, Rac. Cette dernière active, elle aussi, une voie de MAP kinase qui conduit à l'activation de Jnk (Jun kinase). Jnk active Jun en la phosphorylant. Jun et Fos s'associent pour former un facteur de transcription hétérodimérique appelé AP-1 [6, 8]. Les trois facteurs de transcription produits lors de l'activation du lymphocyte T (NF-AT, NF-KB et AP-1) provoquent la transcription des gènes nécessaires à la différenciation et la prolifération cellulaire ainsi qu'à la production d'il-2 (figure 1.6). Pendant la période d'activation du lymphocyte T, qui s'étend sur une période d'environ 10 à 14 jours chez un lymphocyte T naïf, plus d'une centaine de gènes sont exprimés. De plus, l'activité métabolique ainsi que la synthèse protéique sont augmentées de plusieurs centaines de fois [44].

29 1.6.3 Production d'interleukine 2 L'expression de l'il-2 est restreinte aux lymphocytes T. Elle est produite de façon transitoire lors de l'activation spécifique du lymphocyte T et induit la prolifération des cellules T, B et NK [45]. Il s'agit d'un facteur essentiel pour la progression du cycle cellulaire de la phase G] à S. La quantité d'il-2 produite lors de l'activation est déterminante pour la prolifération du lymphocyte T. Si une quantité insuffisante d'il-2 est produite dû à un manque de costimulation, la mort ou l'anergie du lymphocyte T sera induite [46]. Le signal de costimulation qui suit la liaison de la molécule CD28 à la surface du lymphocyte T permet l'activation du facteur de transcription AP-1 qui est nécessaire à la transcription de l'il-2. De plus, il permet également la stabilisation de l'arn messager de l'il-2 qui est normalement très instable à cause d'une séquence d'instabilité située dans la région non traduite en 3'. Cette séquence est retrouvée dans tous les ARNs messagers des cytokines, ce qui permet une régulation très précise de la production et de la sécrétion des cytokines [8].

CIM ( \ CD4S TCR CD3 complox I ZAP-70 Fyn or Lck phosphorylate tyroslne resldues on the CD3e and Ç ITAMs, allowing ZAP-70 to blnd jd V- Fyn and Lck proteln tyroslne klnase clusterlng activâtes klnase actlvlty Lck r\ Proteln tyroslne phosphatase activâtes Lck and Fyn =*v* Lck activâtes ZAP-70, wltch In turn phosphorylates LAT and SLP-76. SLP-76 blnds and activâtes phosphollpase C-y (PLC-y), GEFs and Tec klnases PLC-y cleaves phosphatldyllonsltol blphosphate (PIP2) to yleld dlacylglycerol and Inosltol trlsphosphate (IP3) li DAG and Ca2+ actlvate proteln klnase C 3? 51 Proteln klnase C activâtes a transcription factor, NF-KB 3 C IP3 Increases intraceflular racmli V Ca2+ concentration, actlvatlng a phosphatase, calclneurln =V Calclneurln activâtes a transcription factor, NFAT (nuclear factor of actlvated T cells) GEFs actlvate Ras, V wltch In turn activâtes a MAP klnase cascade 3? 51 The Ras-induced klnase cascade Induces and activâtes Fos, a component of the AP-1 transcription factor ^ ^ The transcription factors NF-KB, NFAT and AP-1 Induce spécifie gène transcription, leadlng to cell prolifération and différenciation ^ Figure 1.6 : Sentiers intracellulaires impliquées dans l'activation du lymphocyte T. Cette figure est basée sur celle présentée par Janeway et al [8.

Partie 2 : Matériel et méthodes 2.1 Construction des ACD19 2.1.1 Construction des ACD19 humains La partie transmembranaire et extracellulaire du CD 19 humain ont été amplifiées par PCR à partir du plasmide POT B7 (Invitrogen, Burlington, Canada). Pour ce faire, les deux amorces suivantes ont été utilisées : 1) hcd19-fw : 5'- CCA TGG ATG CCA CCT CCT CGC CT -3', 2) hcd19-rev : 5'GTC GAC TCA AAG ATG AAG AAT GCC CAC AA -3'. Ces amorces ont été synthétisées par Integrated DNA Technologies (Coralville, États-Unis). L'amplification a été effectuée en utilisant 0,2 mm de dntp, 0,4 (J,M de chacune des amorces, 1 Lig de plasmide POT B7 et 2 U de Vent (New England Biolab, Pickering, Canada) dans un volume total de 50 J,L. Les conditions utilisées pour le PCR consistaient en 33 cycles comprenant, pour chacun d'eux, une phase de dénaturation de 1 min à 94 C, une phase de liaison des amorces de 30 s à 50 C et une phase d'élongation de 1 min 30 s à 72 C. Ces cycles ont été précédés d'une incubation de 5 min à 94 C et terminés par une incubation de 10 min à 74 C. Une fois l'amplification effectuée, l'adn amplifié par PCR a été précipité à l'éthanol 95% puis une queue d'alanine lui a été ajoutée. Pour ce faire, 0,2 mm de datp et 4 U de Taq polymérase (New England Biolab) ont été ajoutés à l'adn, dans un volume total de 25 fll. Ce mélange a été incubé pendant 15 min à 74 C puis purifié sur un gel d'agarose de 0,8%. L'ADN a été extrait du gel d'agarose à l'aide d'une colonne QlAquick (Qiagen, Mississauga, Canada) selon le protocole du manufacturier. L'ADN purifié codant pour le ACD19 humain a été lié au vecteur pgem-t (Promega, Madison, États-Unis) selon un ratio 3:1 en utilisant 3 U de T 4 DNA ligase (Promega) dans un volume total de 10 il. Les clones obtenus ont été

séquences par la plate-forme de séquençage de l'université Laval (Québec, Canada). Un clone a été sélectionné pour construire deux vecteurs, un vecteur contenant le ACD19 humain sous la direction du promoteur hpgk (hacd19) et un autre contenant le ACD19 humain sous la direction du promoteur minimum de l'il-2 (IL-2 hacd19) (tableau 2.1). La construction du vecteur contenant le ACD19 humain sous la direction du promoteur hpgk du vecteur prrl-5pme [47] a débuté par l'excision du ACD19 humain du vecteur pgem-t à l'aide des enzymes Sac II (New England Biolab) et Sal I (Invitrogen). Après avoir été coupée avec l'enzyme Sac II, l'extrémité protubérante 3' créée par l'enzyme a été convertie en bout franc à l'aide de la T 4 DNA polymérase (New England Biolab). Pour ce faire, 0,1 mm de dntp et 8 U de T 4 DNA polymérase ont été ajoutés au ACD19 humain dans un volume total de 100 il. Le mélange a été incubé 15 min à 12 C. Par la suite, l'enzyme a été inactivée à l'aide de 10 mm d'edta suivi d'une incubation de 20 min à 75 C. Finalement, l'adn a subi une extraction phénol/chloroforme, suivi d'une extraction au chloroforme avant d'être précipité à l'éthanol pour enfin être digéré par l'enzyme Sal I. Le vecteur prrl-5pme a été ouvert pour recevoir le ACD19 humain à l'aide des enzymes Bam HI (Invitrogen) et Sal I. Tout de suite après avoir été coupée par l'enzyme Bam HI, l'extrémité protubérante 5' a été modifiée en bout franc à l'aide du fragment de Klenow de la polymérase I (Invitrogen). Pour ce faire, 30 (J.M de dntp et 1 U du fragment de Klenow ont été combinés à l'adn dans un volume total de 100 \il. La réaction s'est effectuée pendant 15 min à température pièce (TP), puis a été stoppée par l'ajout de 10 mm d'edta. L'ADN du vecteur a subi une extraction phénol/chloroforme, puis une extraction chloroforme avant d'être précipité à l'éthanol pour enfin être clivé par l'enzyme Sal I. Finalement, le vecteur prrl-5pme a été déphosphorylé par la shrimp alkaline phosphatase (USB, Cleaveland, États-Unis). Par la suite, le ACD19 humain et le vecteur prrl-5pme ont été purifiés sur gel d'agarose 0,8%. L'ADN du ACD19 humain et du vecteur prrl-5pme ont été extrait du gel d'agarose à l'aide d'une colonne QIAquick. Puis, le ACD19 humain a été lié au vecteur prrl-5pme selon un ratio 3:1 en utilisant 1U de T4DNA ligase. La construction du vecteur contenant le ACD19 humain sous la direction du promoteur minimum de 1TL-2 (IL-2 hacd19) s'est effectuée en deux étapes. Premièrement, le ACD19

Y} humain a été excisé du vecteur pgem-t puis inséré dans le vecteur IL2-GL3 (Promega). Deuxièmement, la cassette contenant le promoteur IL-2 et le ACD19 humain a été excisée pour être insérée dans le vecteur prrl-5pme. Pour la première étape, le ACD19 humain a été excisé du vecteur pgem-t de la même façon que pour la construction du vecteur hàcd19. Pour sa part, le vecteur 1L2-GL3 a été ouvert avec les enzymes Nco I (Invitrogen) et Sal I, ce qui a permis d'enlever le gène de la luciférase et la queue d'alanine que le vecteur contenait. Il est à noter que l'extrémité protubérante 5' laissée par Nco I a été modifiée en bout franc à l'aide du fragment de Klenow, de la même façon que décrit pour la construction du vecteur hacd19, puis l'adn a été digéré par Sal I et enfin déphosphorylé. Par la suite, le ACD19 humain et le vecteur IL2-GL3 ouvert ont été purifiés sur gel d'agarose 0,8% avant d'être extraits sur colonne QIAquick pour enfin être liés avec 1 U de T 4 DNA ligase avec un ratio 3:1. Un clone positif pour la présence du ACD19 humain dans le vecteur IL2-GL3 a été sélectionné pour la deuxième étape de clonage. La cassette du promoteur 1L-2/ACD19 humain a été extraite de ce clone en utilisant les enzymes Nhe I (Invitrogen) et Sal I. Encore une fois, l'extrémité protubérante 5' laissée par Nhe 1 a été changée en bout franc à l'aide du fragment de Klenow avant d'effectuer la digestion avec Sal I. Le vecteur prrl-5pme a été ouvert pour recevoir la cassette en utilisant les enzymes de restriction Xho I (Invitrogen) et Sal I, ce qui a permis d'enlever le promoteur hpgk (une fois clone, le ACD19 humain est retrouvé uniquement sous la direction du promoteur minimum de l'il-2). Ici encore, l'extrémité protubérante 5' laissée par l'enzyme Xho I a été convertie en bout franc par le fragment de Klenow avant de couper avec l'enzyme Sal I et de déphosphoryler le vecteur. La cassette et le vecteur ont été purifiés, extraits et liés comme décris précédemment pour donner le vecteur IL-2hACD19.

2.1.2 Construction des ÀCD19 murins Tout d'abord, il a fallu commencer par obtenir de l'adn de souris afin de pouvoir amplifier la séquence du ACD19 murin. Pour ce faire, de l'arn d'une rate de souris C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, États-Unis) a été extrait à l'aide d'une colonne RNeasy (Quigen, Mississauga, Canada) selon le protocole standard. Par la suite, de l'adn simple brin a été synthétisé à partir de l'arn extrait. Pour ce faire, la transcriptase inverse M-MLV (Promega) ainsi que l'hexamère Random (Sigma-Genosys, Saint-Louis, États-Unis) ont été utilisés selon le protocole standard. Une fois le brin d'adn synthétisé, il a été utilisé pour amplifier par PCR le ÀCD19 murin. Pour cette amplification les deux amorces suivantes ont été utilisées : 1) mcd19-fw : 5' CCA TGG ATG CCA TCT CCT CTC C 3' et 2) mcd19- Rev : 5' GTC GAC TCA ACA ATA GAG AAA AGC CAC 3'. Ces amorces ont également été synthétisées par Integrated DNA Technologies. L'amplification par PCR a été effectuée en utilisant 0,2 mm de dntp, 0,4 im de chacune des amorces, 1 \xg d'adn obtenu à partir de l'arn de souris et 2 U de Vent dans un volume total de 50 ^L. Les conditions utilisées pour le PCR comprenaient 33 cycles composés d'une phase de dénaturation de 1 min à 94 C, une phase de liaison des amorces de 30 s à 55 C et une phase d'élongation de 2 min à 74 C. Ces cycles ont été précédés d'une incubation de 5 min à 94 C et terminés par une incubation de 10 min à 74 C. Une fois l'amplification effectuée, le produit du PCR a été précipité à l'éthanol 95%, puis une queue d'alanine lui a été ajoutée comme décrit précédemment. Par la suite le ACD19 murin a été purifié sur un gel d'agarose 0,8%. L'ADN a été extrait du gel d'agarose puis lié au vecteur pgem-t comme décrit précédemment. Les clones obtenus ont été analysés par digestion enzymatique pour vérifier la présence du ACD19 murin. Ceux qui se sont révélés positifs ont été séquences et sélectionnés pour construire deux vecteurs, un vecteur contenant le ACD19 murin sous la direction du promoteur hpgk. (macd19) et un autre contenant le ACD19 murin sous la direction du promoteur minimum de 1TL-2 (IL-2 macd19) (tableau 2.1).

35 Pour construire le vecteur màcd19, la stratégie et les techniques utilisées sont identiques à celles effectuées pour la construction du vecteur hacd19. Pour de plus amples détails, se référer à cette section. La construction du vecteur IL-2 macd19 a été effectuée selon les deux mêmes étapes qui ont été utilisées pour la construction du vecteur IL-2 hacd19. Premièrement, ACD19 murin a été sorti du vecteur pgem-t et clone dans le vecteur IL2-GL3 exactement de la même façon que pour le vecteur IL-2 hacd19. Un clone positif pour la présence du ACD19 murin dans le vecteur IL2-GL3 a été choisi pour effectuer la deuxième étape. Tout d'abord, la cassette du promoteur IL-2/ACD19 murin a été excisée du vecteur IL2-GL3 en utilisant les enzymes Sac I (New England Biolab) et Sal I. L'extrémité 3' protubérante laissée par l'enzyme Sac I a été modifiée en bout franc avec la T4DNA polymerase comme décris plus tôt, puis l'adn a été digéré par l'enzyme Sal I. Le vecteur prrl-5pme a été ouvert avec les enzymes Xho I et Sal I de façon à enlever le promoteur hpgk et l'extrémité protubérante 5' laissée par l'enzyme Xho I a été convertie en bout franc par le fragment de Klenow avant de couper avec l'enzyme Sal I. Ensuite, le vecteur a été de déphosphorylé. La cassette du promoteur IL2/mACD19 murin et le vecteur ont été purifiés, extraits et liés comme décris précédemment pour donner le vecteur IL-2 macd19. Tableau 2.1 : Description des constructions contenant le ACD19. Appellation hacdl 9 IL-2 hacdl9 macd19 IL-2 macd19 Description Gène du ACD19 humain sous la direction du promoteur humain PGK (promoteur dérivé du gène de la posphoglycérate kinase) Gène du ACD19 humain sous la direction du promoteur minimum de 1TL-2 Gène du ACD19 murin sous la direction du promoteur humain PGK Gène du ACD19 murin sous la direction du promoteur minimum de 1TL-2

36 2.2 Culture cellulaire 2.2.1 Milieux et culture des cellules Le milieu de culture utilisé pour ces travaux était du RPMI 1640 (Gibco, Burlington, Canada) auquel 100 U/ml de pénicilline (Gibco), 100 lg/ml de streptomycine (Gibco) et 10% de FBS (Bio Media Canada Inc., Drummondville, Canada) ont été ajoutés. Toutes les cellules ont été conservées dans un incubateur humide à 37 C contenant 5% de CO2. 2.2.2 Transfections Les cellules 293T (ATCC, Manassas, États-Unis) ont été transfectées au phosphate de calcium selon le protocole standard. Il est à noter que les cellules 293T sont utilisées de façon standard pour la production transitoire de virus étant donné qu'elles sont facilement transfectables. Quatre plasmides ont dû être co-transfectés pour former le lentivirus complet. Les quantités suivantes ont été utilisées : 1) 3 a,g de plasmide codant pour l'enveloppe du virus (VSV-G), 2) 5 J,g de plasmide pour l'empaquetage du virus, 3) 2,5 jxg de plasmide pour l'expression de la transcriptase inverse virale et 4) 10 (j,g de vecteur de transfert contenant le gène d'intérêt, soit ici un des quatre vecteurs prrl-5pme contenant : hacd19, IL-2 hacd19, macd19 ou IL-2 macd19. Le virus a été récolté 48 et 72 h après la transfection. Il a été centrifugé, filtré, aliquoté puis a été congelé à -80 C jusqu'à son utilisation.

2.2.3 Transduction de lignée cellulaire La lignée cellulaire Jurkat (ATCC) a été transduite à deux reprises. La première transduction a été effectuée avec 300 000 cellules Jurkat dans un volume de 2 ml de RPMl auxquelles ont été ajoutés 1 ml de virus hacd19, 1L-2 hacd19, macd19 ou IL-2 macd19 et 8 ng/ml de polybrène (Sigma). Les cellules ont été centrifugées pendant 1 h à 1800 rpm. La deuxième transduction a été effectuée 6 h après la première. Pour ce faire, 1 ml de milieu a été remplacé par 1 ml de virus hacd19, IL-2 hacd19, macd19 ou IL-2 macd19 et 8 ig/ml de polybrène. Les cellules ont encore une fois subit une centrifugation de 1 h à 1800 rpm. Le lendemain, 2 ml de milieu ont été remplacés par 2 ml de RPML Les cellules ont été analysées par cytométrie de flux (FACS) 48 h après leur dernière transduction. 2.2.4 Isolement des lymphocytes T périphériques L'isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBLs) a été effectué sur gradient de Ficoll-Paque (Amersham Biosciences, Piscataway, États-Unis) selon un protocole standard. Par la suite, une adhérence au plastique d'une durée de 1 h a été effectuée afin de conserver seulement les lymphocytes. Les cellules non adhérentes ont donc été récupérées et comptées. Puis, les lymphocytes ont subi un isolement pour ne garder que les lymphocytes T CD8+ (cet isolement sert surtout à se débarrasser le plus possible des lymphocytes B). Cette séparation négative a été effectuée à l'aide d'un kit d'isolement magnétique EasySep (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Finalement, les cellules ont été activées avec des billes anti-cd3/cd28 (Dynal Biotech ASA, Oslo, Norvège) afin de permettre l'expansion spécifique des lymphocytes T in vitro. Pour cette activation, les cellules ont été resuspendues à une concentration de 1 x 10 6 /ml et 6,7 ul/ml de billes ont été ajoutées.

:<8 2.2.5 Transduction des cellules primaires Les lymphocytes T CD8+ ont été transduits 24 h après leur isolement, leur mise en culture et leur activation. Chaque infection a été effectuée en triplicata. Chacun des puits d'infection contenait 200 000 lymphocytes T CD8+ dans un volume de 500 ul de RPMI, 500 ul de virus prrl-5pme-gfp [47] (pgfp) ou IL-2 hacd19 ainsi que 8 ug/ml de polybrène. Les cellules ont ainsi été centrifugées pendant 1 h à 1800 rpm. Une deuxième transduction a été effectuée, 6 h après la première. Pour cette seconde transduction, la Vi du milieu de culture de chaque puits a été remplacé par 0,5 ml de nouveau virus pgfp ou IL-2 hacd19 et de 8 Ug/ml de polybrène. Cette fois, les cellules n'ont pas été centrifugées. Le lendemain, les trois transductions d'un même triplicata ont été combinées dans un même puits. Pour ce faire, les cellules contenues dans les trois puits ont été combinées dans un tube, centrifugées 5 min à 1600 rpm, puis resuspendues dans 1 ml de RPMI auquel 50 U/ml d'il-2 (Peprotech Canada Inc., Ottawa, Canada) ont été ajoutées. Trois jours plus tard, la moitié du milieu de culture a été changé avec du RMPI contenant 50 U/ml d'il-2 et les cellules ont été mises à une concentration de 1,25 x 10 6 /ml. Les billes pour l'expansion des cellules T anti-cd3/cd28 ont été enlevées 3 jours plus tard par 2 rondes de séparation magnétique de 5 min chacune. Les cellules ainsi récupérées ont été centrifugées 5 min à 1600 rpm puis ont été comptées et resuspendues à une concentration de 1,25 x 10 6 /ml dans du RPMI contenant 50 U/ml d'il-2. Trois à cinq jours plus tard, la moitié du milieu de culture a été changé avec du RMPI contenant 50 U/ml d'il-2 et les cellules ont été mises à une concentration de 1,25 x 10 6 /ml. Une analyse par FACS a été effectuée pour vérifier le niveau d'expression de GFP ou du ACD19 humain, 8 jours après avoir enlevé les billes, pour un total d'environ 16 jours en culture.

39 2.2.6 Activation Avant d'être analysées par FACS les cellules transduites avec un des vecteurs contenant le promoteur minimum de l'il-2 devaient être activées pour que le gène du ÀCD19 soit exprimé. L'activation a été effectuée à l'aide de phorbol 12-mystrate 13-acétate (PMA) (Sigma) et d'ionomycine (Sigma). Pour ce faire, 10 ng/ml de PMA et 0,2 ig/ml d'ionomycine ont été ajoutés aux cellules qui devaient être activées. Celles-ci ont par la suite été gardées 4 h dans l'incubateur humide à 37 C contenant 5% de CO2, avant d'être lavées deux fois avec du PBS IX, pour enfin être marquées avec un anticorps. 2.2.7 Analyse par cytométrie de flux Les anticorps utilisés pour le ACD19 humain proviennent de BD Biosciences Pharmingen (San Diego, États-Unis). Il s'agit de l'anticorps anti-cd19 humain (clone HIB19) et l'anticorps de contrôle isotypique de souris IgGi K (clone MOPC-21) tout deux couplés à l'isothiocyanate de Fluorescéine (FITC). Les anticorps utilisés pour ACD19 murin proviennent eux aussi de BD Biosciences Pharmingen. L'anticorps anti-cd19 murin (clone 1D3) et son anticorps de contrôle isotypique de rat IgG2a K (clone R35-95) sont tout deux couplés à la phycoérythrine (PE). Finalement, pour l'analyse de l'expression de Sca I, aucun marquage n'a été effectué en plus de celui effectué pour l'isolement des cellules, puisque ce marquage utilisait déjà un anticorps Sca I marqué au PE. Les cellules ont donc tout simplement été passées au FACS immédiatement après leur isolement. Pour ce qui est de l'anticorps de contrôle isotypique de rat IgG2 a K (clone R35-95), il a été ajouté à un échantillon de cellules à la place de l'anticorps anti-sca I pendant l'isolement des cellules. Pour faire le marquage, les cellules ont été centrifugées 5 min à 1600 rpm. Le surnageant a été enlevé et l'anticorps a été ajouté. Les cellules ont été incubées 45 min sur glace dans la noirceur. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS IX puis resuspendues à une

concentration appropriée dans du PBS IX avant d'être analysées par un cytomètre de flux de Beckman Coulter (Ville Saint-Laurent, Canada). Les données recueillies ont été traitées par le programme Expo32 vl.2 (Beckman Coulter). Il est important de mentionner que c'est uniquement les cellules vivantes qui ont été sélectionnées pour l'analyse des résultats. 2.2.8 Isolement CD19 L'isolement pour le ACD19 humain a été effectué à l'aide d'un kit de sélection positive pour le CD 19 humain d'easysep (StetnCell Technologies, Vancouver, Canada) selon le protocole du manufacturier. Par la suite, les cellules ont été analysées par FACS. Il est à noter que le marquage a été effectué en même temps que l'isolement. L'anticorps anti-cd19 humain a été ajouté aux cellules en même temps que le cocktail d'anticorps EasySep. Son anticorps de contrôle isotypique, a quant à lui été ajouté à la place du cocktail d'anticorps de sélection positive. 2.3 Souris Les lignées de souris C57BL/6J et C57BL/6J-Apc m " (Apc Mm ) proviennent de chez The Jackson Laboratory (Bar Harbor, États-Unis). La lignée Apc Mm a été maintenue dans notre animalerie en croisant des mâles Apc Mm avec des femelles C57BL/6J. Les souriceaux Apc ont été différenciés des souriceaux C57BL/6J par génotypage. Suite à l'apparition évidente des signes de morbidité, les souris Apc Mm ont été sacrifiées par asphyxie au dioxyde de carbone (C0 2 ).

Il 2.3.1 Génotypage Une fois les croisements effectués pour conserver la lignée Apc '", un échantillon de tissu a été prélevé sur les souriceaux pour déterminer s'ils possédaient ou non la mutation au niveau du gène Apc. Les homozygotes pour la mutation ne sont pas viables, les souris ne peuvent donc être qu'homozygote pour le gène sain (C57BL/6J) ou hétérozygote (Apc Min ) [48-50. Un morceau de queue de chaque souris a donc été prélevé après leur sevrage en effectuant une anesthésie à la xylazine-kétamine pour souris (0,1 ml/log de souris). Les prélèvements ont été effectués selon les procédures et politiques en vigueur à l'université Laval. Par la suite, l'adn a été extrait de l'échantillon prélevé. Afin d'y parvenir l'échantillon de tissus a été dégradé à la protéinase K. Le morceau de tissu a donc été incubé dans un volume total de 200 \il contenant 0,9% de Tween 20 (EM Sicencc), 10% de tampon 10X de l'enzyme Taq polymérase (Invitrogen) et 12 a,g de protéinase K (Sigma). L'incubation a duré 7 h dans un bain à 55 C. Au cours de cette incubation, le mélange a été vortexé vigoureusement à plusieurs reprises afin d'accélérer la dégradation du tissus. En suite, la protéinase K a été inactivéc pendant 10 min dans un bain à 95 C. Puis, un PCR pour amplifier le locus du gène Apc contenant la mutation a été effectué a l'aide des amorces suivantes : 1) MAPCHIII-Frow : 5' TCT CGT TCT GAG AAA GAC AGA AG T 3' et 2) MAPCHIII-Rev : 5' TGA TAC TTC TTC CA A C TTT GGC TAT 3' (Alpha DNA, Montréal, Canada). Les nucléotides surlignés en vert ne correspondent pas à la séquence du locus du gène Apc, ils ont été modifiés pour générer des sites de restriction pour l'enzyme Hind III [51]. Ces modifications ne touchent pas la mutation ponctuelle des souris Apc '". Chaque amplification par PCR a été effectuée dans un volume total de 50 ux en utilisant 5 ux de digestion du tissu à la protéinase K, 0,2 mm de dntp, 0,4 flm de chacune des amorces et 2 U de Taq polymérase. Les conditions utilisées étaient les suivantes : 33 cycles comprenant, une phase de dénaluration de 30 s à 94 C, une phase de liaison des amorces de 2 min à 60 C et une phase d'élongation de 2 min à 72 C. Ces cycles ont été précédés d'une incubation de 5 min à 94 C et terminés par une incubation de 10 min à 72 C. Une fois l'amplification terminée, les échantillons ont été digérés par l'enzyme Hind III (Invitrogen) pendant 17 h, puis mis sur gel pour vérifier leur génotype. Le PCR produit un fragment de 155pb. Les modifications apportées aux amorces permettent de créer deux sites de

restriction pour l'enzyme Hind III situés à 21 et à 144pb [51]. Si la souris n'a pas la mutation au niveau de son gène Apc, on retrouve suite à la digestion trois fragments de 21, 123 et 12pb. Si la mutation pour le gène Apc est présente, le site de restriction situé à 21pb est modifié et l'enzyme ne peut plus couper, il en résulte deux fragments, un de 144pb et un de 12pb. Une fois sur gel d'agarose 3%, les échantillons provenant de souris C57BL/6J (donc homozygote sans la mutation) vont présenter une seule bande visible à 123pb alors que les échantillons provenant de souris Apc Mm (donc hétérozygote pour la mutation) vont présenter une bande à 144pb ainsi qu'une bande à 123pb. Ce qui permet de déterminer facilement le génotype de chacun des animaux. 2.3.2 Induction de tumeurs Les tumeurs mammaires ont été induites chez les souris Apc '" en injectant un agent carcinogène, le N-nitroso-N-ethylurea (ENU) (Sigma-Aldrich). Les souris étaient âgées entre 35 à 45 jours et ont reçu une seule injection intra-péritonéale de 50 ou 75 mg/kg d'enu. Les déchets résultant des injections d'enu ainsi que les déchets biologiques des souris injectées (sur une période de deux semaines) ont été traités selon le protocole de gestion des déchets biomédicaux en vigueur au CRHDQ. Suite à l'injection, les animaux ont été observés 2 fois par semaine pour surveiller l'apparition et le développement des tumeurs. Dès leur apparition, les tumeurs ont été mesurées à l'aide d'un vernier. Les souris ont été sacrifiées par asphyxie au CO2 si la taille des tumeurs dépassait 2 cm 3 ou si elles présentaient des signes évidents de morbidité. 2.3.3 Extraction de lymphocytes Les lymphocytes murins ont été extraits du sang ou de la rate des souris. Pour l'extraction du sang, un prélèvement de sang d'environ 100 \il a été effectué sur les souris à partir de la saphène selon la procédure standard. Par la suite, les érythrocytes ont été éliminés de

l'échantillon sanguin par une lyse au chlorure d'ammonium IX (solution à ph 7.4 composée de NH4CI 150 mm, de NaHCOj 10 mm et d'edta 0,1 mm). Tout d'abord, le sang prélevé a été centrifugé, puis le surnageant a été éliminer et les cellules ont été incubées avec 1 ml de chlorure d'ammonium IX pendant 10 min à TP. Par la suite, les cellules ont été lavées à 3 reprises avec du PBS IX, puis resuspendue dans du RPMI avant d'être comptées. Les leucocytes ainsi isolés ont été analysés par microscopie ou par FACS. L'analyse par microscopie a été effectuée sur un microscope inversé TE 300 (Nikon, Mississauga, Canada) avec l'aide du logiciel MétaVue v6.3r7 (Molecular Devices, Sunnyvale, États-Unis). Pour l'extraction des lymphocytes à partir de la rate, cette dernière a tout d'abord été prélevée sur une souris euthanasiee par asphyxie au CO2. Puis les splénocytes ont été mis en culture. Pour ce faire, la rate a été découpée en très petits morceaux et ceux-ci ont été écrasés afin de faire sortir les cellules contenues dans le tissu. Une fois mis en culture, les cellules mononucléaires ont été isolées par gradient de Ficoll-Paque selon un protocole standard. Ces cellules ont par la suite subit une adhérence au plastique de 1 h afin de ne conserver que les lymphocytes. Les cellules ont été resuspendues dans du RPMI contenant 50 im/ml de P-Mercaptoethanol (Sigma). Les lymphocytes ainsi isolés ont servis de contrôle positif pour l'anticorps anti-cd19 murin lors des analyses par FACS. 2.3.4 Isolement des précurseurs Tout d'abord la moelle osseuse a été extraite des os longs des membres antérieurs et postérieurs de souris (fémurs, tibias et humérus). Pour ce faire, les 4 membres d'une souris euthanasiee ont été récupérés à l'aide d'un coupe-os. La peau a été enlevée et les os ont été nettoyés de tous tissus, puis désinfectés dans un bain d'éthanol. Les extrémités fermées des os ont été coupées. Les os ont été vidés de leur moelle osseuse, à l'aide d'une seringue remplie de milieu de culture RPMI et munie d'une aiguille 2TA. La moelle osseuse a bien été resuspendue afin d'éliminer les agrégats et d'obtenir une suspension cellulaire. Par la suite, les érythrocytes ont été éliminés de la suspension cellulaire par une lyse au chlorure d'ammonium. Les précurseurs ont été isolés en effectuant deux tris cellulaires consécutifs. Le

premier a été une sélection négative pour isoler les cellules LinSca à l'aide d'un kit d'isolement SpinSep (StemCell Technologies). Le deuxième tri a été effectué à l'aide d'un kit d'isolement EasySep (StemCell Technologies). Ce tri est une sélection positive qui permet d'isoler les cellules Sca +. Suite aux deux isolements, les cellules ont été resuspendues dans 1 ml de RPMI contenant 100 ng/ml de mscf (Peprotech Inc., Rocky Hill, États-Unis). 2.3.5 Transduction des précurseurs Les précurseurs de cellules T ont été transduites immédiatement après leur mise en culture. Pour ce faire, 1 ml de virus pgfp et 8 ig/ml de polybrene ont été ajoutés aux cellules. Les cellules ont été centrifugées pendant 1 h à 1800 rpm à TP. Le lendemain, % du milieu a été remplacé par du RPMI frais contenant 100 ng/ml de mscf et 50 im/ml de (î- Mercaptoethanol. Les cellules ont été analysées par FACS 48 h après leur transfection. Alternativement, les précurseurs de cellules T ont été transduites le lendemain de leur isolement et de leur mise en culture. La moitié de leur milieu a été remplacé par 1 ml de virus pgfp, 50 ng/ml de mscf et de 8 lg/ml de polybrene. Le tout a été centrifugé 1 h à 1800 rpm à TP. Vingt quatre heures après l'infection, les cellules ont soit été utilisées pour reconstituer une autre souris ou alors gardées en culture pour une analyse par FACS. Dans ce cas, le 3 A du milieu de culture a été changé pour du nouveau milieu (RPMI) contenant 50 ng/ml de mscf et 50 J,M/ml de p-mercaptoethanol. L'expression du niveau de GFP a été examinée 48 h après la transduction par FACS. 2.3.6 Reconstitution de moelle osseuse La souris devant recevoir les précurseurs qui ont été transduits avec le vecteur pgfp a été placée sous traitement à la tétracycline 1 semaine avant l'injection des cellules. La veille de

45 l'injection, la souris a été irradiée entièrement en recevant deux doses de 4 Gy, chacune l'une à la suite de l'autre, pour un total de 8 Gy. Suite à l'irradiation la souris a été transférée dans une cage stérile. Le lendemain, les cellules transduites ont été lavées avec du PBS IX puis resuspendue dans 150 ll de PBS IX. Finalement, les cellules ont été injectées en utilisant une veine de la queue de la souris irradiée. La souris a été gardée sous tétracycline pendant les deux semaines suivant la reconstitution de moelle osseuse. Le sang périphérique de la souris a été analysé 13 semaines après la reconstitution puisque le temps minimal requis pour s'assurer d'une reconstitution à long terme est d'environ 8 semaines [52, 53].

Partie 3 : Résultats 3.1 Construction des vecteurs contenant le ACD19 Quatre vecteurs contenant le ACD19 humain ou murin ont été construits. Deux vecteurs permettent l'expression constitutive du ACD19 humain ou murin (figure 3.1 B) alors que les deux autres permettent l'expression inductible du ACD19 humain ou murin (figure 3.1 C). Ces constructions ont été générées en utilisant le vecteur de transfert prrl-5pme (figure 3.1 A). Le vecteur de transfert ainsi que trois autres plasmides (enveloppe, transcriptase inverse et empaquetage) sont nécessaires pour former un virus complet. Le fait que l'information génétique soit divisée en plusieurs plasmides permet de diminuer les risques de recombinaison. Il s'agit d'un lentivirus de troisième génération (dérivé de HIV-1) qui est pseudotypé avec l'enveloppe VSV-G. Cette enveloppe permet au virus d'infecter une grande variété de cellules et d'être plus stable [54-58]. Le vecteur de transfert contient une cppt, qui est une séquence cis-active centrale permettant d'augmenter le transport nucléaire du gène d'intérêt [54, 57-59], ainsi qu'un WPRE, qui est un élément de régulation post-transcriptionnel dérivé du woodchuck hepatitis virus, permettant d'augmenter l'expression des transcrits d'arn du gène d'intérêt et d'améliorer leur poly-adénylation [57, 59-61]. Le vecteur possède également deux LTRs (longues répétitions terminales). Le virus est auto-inactif parce qu'il possède une délétion au niveau du segment U3 de son LTR en 3' [54-57]. De plus, le LTR en 3' est un hybride avec le promoteur RSV [47]. Lors de la transcription inverse, la région U3 délétée est dupliquée pour former la région U3 du LTR en 5'. La délétion est ainsi transférée au LTR en 5'. Il est donc non fonctionnel, et ne peut pas diriger la transcription du gène d'intérêt. La transcription est donc uniquement sous le contrôle du promoteur interne (PGK ou le promoteur minimum de l'il-2) [56].

Le promoteur minimum de l'il-2 utilisé pour les constructions inductibles est une séquence minimale située entre les paires de bases -326 et +24 du gène de l'il-2 [44]. Cette séquence contient plusieurs sites de liaison à des facteurs de transcription. Trois de ces facteurs sont exprimés suite à l'activation du lymphocyte T : NF-AT, NF-KB et AP-1 [44-46]. Deux d'entre eux sont des facteurs ubiquitaires exprimés de façon constitutive comme Oct-1 (facteur 1 de la protéine octamère POU) et OAP (protéine associée à l'octamere) [44]. 11 est possible que d'autres facteurs possèdent des site de liaison au promoteur comme par exemple CD28RC et Spl-like, mais leur présence est controversée [45]. Le nombre de liaison exacte qu'ont les facteurs de transcription avec le promoteur minimal ainsi que les associations qu'ils forment entre eux sont encore mal connus. Par contre, il semblerait que la présence simultanée de tous les facteurs est nécessaire pour qu'il y ait activation de la transcription. En effet, ils n'auraient pas d'interaction stable avec leur site de liaison à moins qu'ils soient tous présent au même moment [45]. La stratégie de clonage a été abordée dans la section 2.1 de la partie matériel et méthodes ainsi qu'à la figure 3.1.

48 cppt Bam HI Sal I 3' A) Vecteur prrl-5pme cppt xho, Bam HI Sal I 3' B) ACD19 constitutif murin ou humain cppt Xho Promoteur IL-2 Sali ACD19 C) ACD19 inductihle murin ou humain Figure 3.1 : Représentation schématique des différents vecteurs utilisés lors des expérimentations. Les trois schémas représentent les principaux éléments retrouvés dans le vecteur prrl-5pme ainsi que dans les 4 vecteurs construits pour permettre l'expression du ACD19. A) Représentation du vecteur prrl-5pme à son étal d'origine (sans modification). L'emplacement des sites de restrictions utilisées pour les stratégies de clonage ont été identifiés sur le schéma. B) Vecteurs exprimant le ACD19 humain ou murin de façon constitutive : le ACDI9 a été clone directement sous la direction du promoteur PGK dans le vecteur prrl-5pme entre les sites de restriction Bam HI et Sal I. C) Vecteurs exprimant le ACD19 humain ou murin de façon inductihle : le ACD19 a d'abord été clone sous la direction du promoteur minimum de l'il-2 dans le vecteur IL2-GL3. Puis, la cassette promoteur minimum IL-2/ACDI9 a été clonée entre les sites de restriction Xho I et Sal I dans le vecteur prrl- 5pme.

40 3.2 Fonctionnalité des ACD19 Une fois les 4 constructions obtenues, du virus contenant chacun des transgènes a été produit par transfection dans les cellules 293T. Suite à la production des virus, nous avons vérifié : premièrement que la molécule tronquée du CD 19 humain et murin est toujours fonctionnelle et deuxièmement que les constructions contenant le promoteur de PIL-2 sont bien inductibles. 3.2.1 Expression constitutive du ACD19 murin et humain à la surface cellulaire La première expérimentation in vitro consistait à vérifier si le fait d'avoir tronqué le gène du CD 19 humain et murin n'affectait pas la capacité de la protéine, une fois synthétisée, à être envoyée à la surface cellulaire. Ce point a été évalué en utilisant la version constitutive de l'expression du gène du ACD19 humain et murin. La lignée cellulaire Jurkat, qui sont des lymphocytes T provenant d'une leucémie aiguë, a été transduite avec les constructions hacd19 ou macd19. Comme il s'agit de cellules T, le CD 19 n'est pas retrouvé à leur surface. L'expression de la protéine ACD19 humaine ou murine a par la suite été analysée par FACS (figure 3.2 et 3.3). Lors de l'analyse de l'infection avec le virus contenant la construction macd19, des lymphocytes extraits de la rate d'une souris (splénocytes) ont été utilisés comme contrôle positif pour le marquage avec l'anticorps anti-cd19 murin, alors que les cellules Jurkat non transduites ont servis de contrôle négatif. Avant leur transduction, les cellules Jurkat n'exprimaient pas le ACD19 murin (0,1%), mais une fois transduites le ACD19 murin est retrouvé à la surface de 52,3% des cellules. Pour ce qui est de la transduction avec la construction hacd19, des lymphocytes B dérivés du sang périphérique humain qui ont été immortalisés avec le virus Epstein-Barr (LCL) ont été utilisés comme contrôle positif pour le marquage cellulaire. Le contrôle négatif a été constitué des cellules Jurkat non transduites. Avant d'être infectées, le ACD19 humain n'était pas retrouvé à la surface des Jurkat (0,4%), alors qu'il est retrouvé sur 48,3% des cellules après transduction. Donc, le fait d'avoir tronqué

so le gène codant pour le CD19 humain et murin afin d'obtenir une molécule sans la partie intracytoplasmique n'affecte pas la synthèse, la migration et la stabilisation de la protéine. Splcnocytes Jurkat Jurkat 10 ni 1 lu 2 mcdi9 10' 10" 10' 10' mcdi9 KI- IO" 10' 10' I0 1 macd19 Figure 3.2 : Analyse par FACS de l'expression à la surface cellulaire du ACD19 murin La lignée cellulaire Jurkal a été transduite deux fois avec la construction macd19 et analysée après 48 h pour l'expression du ACD19 murin à la surface cellulaire. Le graphique de gauche représente le marquage obtenu pour les splénocytes ; au centre, on retrouve le marquage de la lignée cellulaire Jurkat qui n'a pas été transduite ; à droite, il s'agit des cellules Jurkat qui ont été transduites avec la construction màcd19. Sur chacun des trois graphiques on retrouve une courbe en bleu qui représente les cellules marquées avec l'anticorps de contrôle isotypique et une courbe en vert qui représente les cellules marquées avec l'anticorps anti-cdi9 murin. L'axe des X est la mesure de la fluorescence émise par les cellules marquées et représente donc l'expression à la surface cellulaire du CD 19 ou ACD19 murin.

51 LCL Jurkat 57 Jurkal c u E u C > hcd19 10' hcd19 10' 10' 10 lo 1 lu 2 io' hacd19 Figure 3.3 : Analyse par FACS de l'expression à la surface cellulaire du ACD19 humain Les cellules Jurkal onl été infectées à deux reprises avec le virus contenant la construction hacd19 puis analysées par FACS après 4K h. Des trois graphiques représentés, celui de gauche contient les marquages obtenus pour les LCL, celui du centre les marquages des cellules Jurkat non transduites et celui de droite les marquages des cellules Jurkal transduites avec la construction hacd19. Chacun des trois graphiques contient les données relatives au marquage des cellules avec l'anticorps de contrôle isolypique (courbe bleue) ainsi qu'avec l'anticorps anti-cdi9 humain (courbe verte). L'axe des X représente la fluorescence émise suite au marquage qui correspond à la présence du CD 19 ou ACD19 humain à la surface cellulaire. 3.2.2 Inductibilité du ACD19 murin et humain La deuxième partie de ces expérimentations consistait à vérifier que la transcription du ÀCD19 pouvait être dirigée par le promoteur minimum de l'il-2, suite à son activation. Le virus produit contenant la version inductible du ACD19 humain ou murin (1L-2 hàcd19 ou IL-2 màcd19) a été utilisé pour infecter la lignée cellulaire Jurkal. Une partie des cellules transduites ont par la suite été activées et analysées par FACS (figure 3.4 et 3.5). L'intensité moyenne de fluorescence augmente de 2,5 fois suite à l'activation des cellules Jurkat infectées avec le virus contenant IL-2mACD19. Pour les cellules Jurkat transduites avec le virus contenant la construction IL-2hACD19, leur activation entraîne une augmentation de l'intensité moyenne de fluorescence de 1,6 fois.

52 36 Jurkat * > G <U G > 0 10 10' 10 2 macd19 Figure 3.4 : Analyse par FACS de l'inductibilité ACD19 murin Les cellules Jurkal ont élé infectées deux fois avec le virus contenant la construction IL-2 macd19. Les cellules ont élé activées ou non de façon non spécifique avec du PMA et de l'ionomycine pendant 4 h et analysées, 4S h après la dernière transduetion. Les deux échantillons (activés ou non) ont été marqués avec l'anticorps anti-cd19 murin. La courbe en bleu représente le marquage des cellules Jurkat infectées avec IL-2 macdi9 mais qui n'ont pas élé activées, alors que la courbe en vert représente celles qui ont été activées.

53 Jurkat 10 10' hacd19 io 2 io 3 Figure 3.5 : Analyse par FACS de l'inductibilité ACD19 humain Les cellules Jurkat ont été transduites deux fois avec du virus contenant la construction IL-2 hacd19. Après 48 h, une fraction des cellules ont été activées sur une période de 4 h avec du PMA el de l'ionomycine, puis les cellules activées ou non ont été analysées par FACS à l'aide de l'anticorps anti-cdi9 humain. Sur le graphique, le marquage des cellules transduites mais non activées est représenté par la courbe en bleu alors que celui des cellules transduites et activées est représenté par la courbe en vert. 3.3 Transduction des cellules primaires humaines Après avoir vérifié la fonctionnalité des constructions contenant le ACDI9 humain ou murin dans une lignée cellulaire, les expérimentations ont été poursuivies dans les cellules primaires humaines afin de démontrer trois choses : qu'il est possible de transduire efficacement les lymphocytes T primaires humains ; que ces lymphocytes peuvent une fois activés exprimer le ACD19 humain et qu'il est possible de les isoler spécifiquement.

NI 3.3.1 Efficacité de transduction des lymphocytes humains Il a tout d'abord fallu démontrer qu'il était possible de transduire efficacement les cellules primaires humaines. Les lymphocytes T CD8+ ont été isolés du sang périphérique humain, activés, puis infectés avec le virus contenant pgfp. Le gène rapporteur GFP présent dans le vecteur a permis de déterminer facilement l'efficacité de transduction. Suite à la transduction les cellules ont été analysées par FACS (figure 3.6). Les conditions d'infections et cultures cellulaires employées ont permis d'obtenir un taux de transduction de 54,2% des lymphocytes T CD8+. Lymphocytes T primaires Figure 3.6 : Analyse par FACS de l'efficacité de transduction des cellules primaires Les lymphocytes ont été isolés du sang périphérique, puis les lymphocytes T CD8+ ont été triés à partir de cette population. Une fois triés, ils ont été activés pour stimuler leur prolifération puis finalement, 24 h plus lard ils ont été infectés avec pgfp. Les lymphocytes transduits ont été analysés 15 jours plus lard. La courbe en bleu du graphique correspond à la fluorescence des lymphocytes T qui n'ont pas été infectés mais qui ont été gardés dans les mêmes conditions que les cellules transduites. La courbe en vert représente la lluorescence des lymphocytes T CD8+ transduits avec GFP.

55 3.3.2 Inductibilité du ACD19 humain dans les lymphocytes humains Après avoir démontré qu'il était possible d'infecter efficacement des cellules primaires humaines, l'étape suivante était de démontrer qu'il était possible d'induire l'expression du ACD19 à la surface de lymphocytes T humains suite à leur activation. L'activation a été effectuée de façon sous-optimale afin de reproduire ce que l'on devrait normalement obtenir suite à l'isolement des TILs du tissu tumoral (très peu de cellules activées perdues dans une multitude de lymphocytes inhibés). Les lymphocytes T CD8+ ont été transduits avec le virus contenant la construction IL-2 hàcd19, activés ou non, puis analysés par FACS (figure 3.7). Une fois activés de façon sous-optimale, 3,2% des lymphocytes T humains transduits expriment le ACD19 humain à leur surface, alors qu'aucun d'entre eux ne l'expriment sans activation (0,2%).

56 45 Lymphocytes T primaires 4 " G CU (3 ^(U > 0 10 K) 1 10 2 hacd19 io 3 Figure 3.7 : Analyse par FACS d'une induction sous-optimale Les lymphocytes ont été isolés du sang périphérique, puis les lymphocytes T CD8+ ont été séparés par tri cellulaire. Ils ont été activés et 24 h plus tard, transduits avec le virus contenant la construction IL-2 hàcd19. Les lymphocytes ont été activés ou non de façon sous-optimale pendant 4 h, marqués avec l'anticorps anti-cd19 humain puis analysés par FACS, 15 jours après leur transduction. La courbe en bleu du graphique représente la fluorescence émise par la population de lymphocyte T qui a été transduile mais pas activée, alors que la courbe en vert représente celle des cellules T qui ont été transduites et activées. 3.3.3 Efficacité du tri des lymphocytes exprimant le ÀCD19 humain Une fois l'activation sous-optimale effectuée, il a fallu démontrer qu'il était possible d'enrichir cette population faiblement positive pour l'expression du ACD19 humain. Pour ce faire, un échantillon de lymphocytes T CD8+ utilisés à la figure 3.7 a été soumis à un tri cellulaire pour le CD 19 humain. Un échantillon de lymphocytes T CD8+ transduits mais non activés a été utilisé comme contrôle négatif. Les cellules ont été traitées de la même façon que les cellules activées, à l'exception du fait qu'elles n'ont pas subit la séparation magnétique. Suite au tri des lymphocytes, les cellules ont été analysées par FACS pour examiner

57 l'enrichissement de la population de cellules CD 19 positives obtenu (figure 3.8). Le pourcentage de cellules exprimant le ACD19 humain n'a pas changé pour les cellules contrôle, il est toujours de 0,2%, alors que pour les cellules activées de façon sous-optimale et triées, il passe de 3,2% à 56,3% suite à l'isolement. Lymphocytes T primaires 10 10' io 2 io 3 hacd19 Figure 3.8 : Analyse par FACS du tri ecllulaire pour le CD19 humain Le tri a été effectué sur les lymphocytes T CD8+ activés de façon sous-optimale immédialemenl après l'analyse par FACS présentée à la seetion précédente. Il s'agit donc des mêmes cellules. Les cellules ont été isolées à l'aide d'un kit de séparation pour le CD19 humain avant d'être analysées par FACS. Le marquage a été effectué en même temps que l'isolement. La courbe en bleu montre la Huorescence de l'échantillon utilisé comme contrôle négatif. La courbe verte indique la fluorescence obtenue des lymphocytes T CD8+ activés de façon sous-optimale suite à leur isolement pour l'expression du CD 19 humain.

5 8 3.4 Mise en place d'un modèle tumoral in vivo pour l'étude des TILs Après avoir fait la démonstration qu'il était possible d'induire l'expression (de façon sousoptimale) du ACD19 à la surface des cellules primaires humaines et d'isoler spécifiquement cette population, les expérimentations ont été poursuivies in vivo. Pour ce faire, la souris Apc Mw possédant un bagage génétique de souris C57BL/6J a été choisie parce que ce modèle animal permet l'étude du cancer du tissu mammaire. La lignée de souris Apc Mm possède une mutation autosomique dominante non-sens (codant pour un codon stop) au niveau du codon 850 du gène Apc [50, 62-65]. La présence de cette mutation cause l'apparition de tumeurs intestinales chez les animaux atteints ainsi qu'une prédisposition au développement de tumeurs mammaires [50, 62, 63, 65, 66]. De plus, la mutation augmente la sensibilité des souris Apc Mm aux agents carcinogènes et aux radiations. Une exposition à ces agents augmente le taux d'incidence des tumeurs mammaires et intestinales [50, 62, 63]. Les souris Apc Mm ont une très courte durées de vie, qui varie généralement entre 120 et 150 jours, dû à une anémie chronique causée par les tumeurs intestinales [49, 62, 67]. La lignée de souris a été maintenue en croisant un mâle Apc Mm avec une femelle C57BL/6J. L'utilisation d'une femelle Apc Mw est plus difficile puisque elles ne sont souvent pas assez en santé pour mener à terme une grossesse [67]. Les souriceaux ont été génotypes par PCR (voir section 2.3.1) pour identifier les souris Apc Mm. Suite à l'établissement d'une colonie de souris Apc Mm, le développement des tumeurs mammaires chez le modèle animal a été étudié. Il a tout d'abord fallu vérifier s'il était bien possible pour nous d'induire des tumeurs mammaires en utilisant un agent carcinogene (ENU) ainsi que de vérifier le pourcentage d'efficacité d'induction des tumeurs mammaires. Ensuite, il a fallu vérifier le temps d'apparition des tumeurs et leur taux de croissance.

59 3.4.1 Induction et pourcentage d'induction des tumeurs chez la souris Apc Min Le premier but de nos expériences avec la souris Apc Mm a été de vérifier qu'il était possible d'induire des tumeurs mammaires et de déterminer quel était le pourcentage d'induction de tumeurs. Afin de reproduire ce qui a déjà été fait dans la littérature, 50 mg/kg d'enu ont été injectés chez les souris Apc Mm [63, 68]. Après compilation des données (figure 3.9) seulement 64,3% (9 sur 14) des animaux développaient des tumeurs mammaires. La quantité d'enu a donc été augmentée à 75 mg/kg. Suite à cette modification, 84,8% (28 sur 33) des souris ont développé des tumeurs mammaires. Les expérimentations ont donc été poursuivies en utilisant 75 mg/kg d'enu. La figure 3.10 présente un exemple typique de tumeur mammaire obtenue chez les souris Apc Mw.

60 Nombre de souris ayant développé des tumeurs 40- a 3o- 9 o GA nombre de o H 50 75 quantité d'enu injectée en mg/kg Figure 3.9 : Graphique représentant la proportion des souris ayant développé des tumeurs mammaires suite à l'injection d'enu Les souris Apc Ml " ont reçu une injection intra-péritonéale de 50 ou 75 mg/kg d'enu alors qu'elles étaient âgées de 35 à 45 jours. Elles ont été suivies 2 fois par semaine pour déterminer s'il y avait apparition ou non de tumeurs mammaires. Une colonne entière sur le graphique représente le nombre de souris injectées avec 50 ou 75 mg/kg d'enu. La partie en bleu d'une colonne représente le nombre de souris n'ayant pas développé de tumeur, alors que la partie en vert correspond aux souris ayant développé des tumeurs.

61 Figure 3.10 : Photographie d'une souris Apc '" ayant développé une tumeur mammaire Exemple de tumeur retrouvée sur une souris Apc '". La tumeur s'est développée suite à l'injection de 75 mg/kg d'enu de façon intra-péritonéale. 3.4.2 Temps écoulé avant l'apparition de tumeurs chez les souris Apc '" Suite à l'établissement de la concentration d'enu à injecter, le temps d'apparition des tumeurs mammaires chez la souris Apc Mm a été étudié. Pour ce faire, un groupe de souris a été traité avec 75mg/Kg d'enu, puis a été suivi pour noter l'apparition des tumeurs (figure 3.11). Les données recueillies démontrent que la période d'apparition d'une première tumeur sur des animaux sains (sans tumeur déjà apparente) s'étale entre 21 et 59 jours avec une très forte concentration entre les jours 38 et 45.

62 Pourcentage de souris sans tumeur en fonction du temps 120 -T- 100 II SD 80- S 60 -- I 40-20 - 0 -- 0 10 20 30 40 50 60 nombre de jour après injection d'enu Figure 3.11 : Graphique de l'étude du pourcentage de souris sans tumeurs dans le temps Le groupe de 28 souris Apc Ml " a été injecte de façon inlra-péritonéale avec 75 mg/kg d'enu, alors qu'elles étaient âgées entre 35 à 45 jours. Ensuite, les souris ont été observées deux fois par semaine pour l'apparition de tumeurs mammaires et les données onl été compilées sous forme de graphique. 3.4.3 Croissance de tumeurs chez la souris Apc Mm Le même groupe de 28 souris a été utilisé pour étudier la croissance moyenne des tumeurs. Chaque développement de tumeur a été suivi et enregistré jusqu'au décès de toutes les souris Apc '" (figure 3.12). Une fois les données compilées, elles indiquent qu'en moyenne la taille des tumeurs reste négligeable jusqu'à environ 38 jours, puis elle augmente de façon très rapide entre 48 et 59 jours pour atteindre une moyenne maximale de 0,686 cm à 67 jours.

63 Courbe de croissance moyenne des tumeurs 0,8 0,7 a 0,6 0,5 a 0,4 taille 0,3 0,2 0,1 0 -r II) 20 30 nombre de jour après injection de ENU 7(1 Figure 3.12 : Graphique de l'étude du taux de croissance moyen des tumeurs Le groupe de 28 souris injectées à l'hnu a été suivi deux fois par semaine pour mesurer le développement de chaque tumeur. La moyenne de toutes les tumeurs répertoriées sur tous les animaux a été effectuée pour chaque point de mesure. Les données ainsi recueillies ont été compilées sous forme de graphique. 3.5 Expérimentation chez la souris Apc Min Une fois que le modèle in vivo a été bien caractérisé, nous avons procédé aux étapes nécessaires pour tester notre hypothèse de recherche. La première étape aurait dû être l'isolement et l'infection de lymphocytes de souris. Par contre, dû à la présence de plusieurs types de blocages présents suite à l'entrée du virus dans les lymphocytes de souris, les lymphocytes murins sont transduits 100 fois moins efficacement que les lymphocytes humains [691. C'est pourquoi, la technique adoptée, pour permettre de vérifier notre hypothèse in vivo, consiste à transduire des précurseurs de cellules T plutôt que les lymphocytes T matures euxmêmes. Les précurseurs sont des cellules caractérisées par la présence à leur surface des

molécules Sca-1 et c-kit ainsi que l'absence d'expression des antigènes exprimés au stade tardif de la maturation des cellules lymphoïdes (lineage négative) (c-kit + Sca-l + Lin) et sont retrouvées au niveau de la moelle osseuse [70]. De façon générale, elles ont une capacité d'auto-renouvellement et peuvent reconstituer à elles seules la totalité du système hématopoïétique. Avant de pouvoir entreprendre les expérimentations in vivo avec la construction IL-2 macd19, il a fallu tout d'abord démontrer qu'il est possible d'isoler les cellules précurseurs et de les transduire efficacement. Ainsi, il a été nécessaire de vérifier qu'ils peuvent reconstituer le système hématopoïétique, dont la lignée lymphoïde, une fois retournés in vivo et que ces cellules expriment bien le gène de transfert utilisé. 3.5.1 Efficacité du tri des précurseurs L'efficacité de l'isolement des précurseurs de la moelle osseuse a été démontrée en effectuant deux tris cellulaires successifs afin d'assurer un isolement spécifique et optimale. Les isolements ont été suivis d'une analyse par FACS pour vérifier l'isolement et l'enrichissement de la population de précurseurs (figure 3.13). L'analyse par FACS démontre que 51,9% des cellules isolées sont des cellules Sca-1 +.

65 53 Moelle osseuse Ç/3 *-> a eu tu 0 10 10 1 10 2 I0 3 Sca-1 Figure 3.13 : Analyse par FACS de l'efficacité du tri cellulaire La moelle osseuse a été extraite des os longs et soumise à un tri négatif pour ne garder que les cellules Lin Sca- 1 +. Un deuxième tri, celte fois-ci positif, a été effectué pour l'isolement des cellules Sca-1 +. Les cellules ont par la suite été analysées par FACS. La courbe en bleu représente la Iluorescencc des cellules marquées avec l'anticorps de contrôle isotypique et la courbe en verl montre la fluorescence des cellules isolées. 3.5.2 Efficacité de transduction des précurseurs Par la suite, il a fallu démontrer que le problème d'efficacité d'infection rencontré chez les lymphocytes murins ne se retrouvait pas également chez les précurseurs. C'est donc pourquoi, les précurseurs ont été transduits avec le vecteur pgfp puis analysés par FACS. L'expression de GFP a démontré un niveau de transduction de 15,9 à 31,6% selon les conditions utilisées. Un résultat représentatif du niveau de transduction obtenu est représenté à la figure 3.14.

66 Précurseurs Figure 3.14 : Analyse par FACS de l'efficacité de transduction des précurseurs Suile à leur isolement les précurseurs onl élé transduils une seule fois avec centrifugation avec le vecteur pgfp puis analysé par FACS 48 h plus tard pour vérifier le taux de Iransduction. La courbe en bleu représente les précurseurs non transduils qui on été gardés dans les mêmes conditions de culture que les cellules transduites. En vert on retrouve les précurseurs Iransduits. 3.5.3 Analyse du transfert de gène dans les leucocytes in vivo Après avoir démontré qu'il était possible d'isoler et d'infecter efficacement les précurseurs, il a fallu confirmer qu'une fois de retour in vivo ces précurseurs pouvaient reconstituer à long terme la souris hôte. Il a fallu démontrer spécifiquement que la lignée lymphoïde était bien reconstituée (puisque c'est les lymphocytes T qui nous intéressaient) et que le gène introduit dans les précurseurs était effectivement transmis lors de la différenciation en cellules matures. Pour ce faire, une souris a été reconstituée avec des précurseurs qui ont été transduils avec le virus pgfp. Après s'être assuré d'une reconstitution à long terme, les leucocytes du sang périphérique ont été analysés par microscopie pour vérifier la présence de cellules exprimant

()7 GFP (figure 3.15). Une souris contrôle C57BL/6J non reconstituée a été utilisée pour vérifier le degré d'auto-fluorescence des cellules. L'observation au microscope montre bien la présence de leucocytes exprimant GFP. 1 Figure 3.15 : Analyse par microscopie de l'efficacité du transfert de gène Les précurseurs ont été isolés et transduits avec pgfp puis utilisés pour reconstituer une souris C57BL/6J. Après 13 semaines, un échantillon du sang périphérique de la souris reconstituée a été prélevé. Les globules rouges ont été éliminés el les leucocytes ainsi isolés ont été analysés par microscopie pour vérifier la présence de cellules expriment GFP. En A) on retrouve les cellules de la souris contrôle en visible et en B) en fluorescence. Les leucocytes de la souris reconstituée sont retrouvés en visible en C) et en fluorescence en D).

68 3.5.4 Pourcentage de cellules GFP positives Ensuite, la proportion de leucocytes exprimant GFP a été étudiée. Les leucocytes extraits du sang périphérique de la souris reconstituée ont été analysés par FACS (figure 3.16). Les leucocytes extraits d'une souris C57BL/6J non reconstituée ont été utilisés comme contrôle négatif. L'analyse révèle que 10% des leucocytes provenant de la souris reconstituée expriment GFP. Leucocytes Figure 3.16 : Analyse par FACS de l'efficacité du transfert de gène Du sang périphérique de la souris reeonsliluée a élé prélevé. Les globules rouges ont été éliminés et les leucocytes ainsi séparés ont élé analysés par FACS. La courbe en bleu représente la Huorescence émise par les leucocytes de la souris contrôle alors que la courbe en vert illustre la fluorescence des leucocytes de la souris reconstituée.

Partie 4 : Conclusion 4.1 Discussion La présence de cellules du système immunitaire encore actives au sein du tissu tumoral nous a amené à penser qu'il était possible de bâtir une stratégie anti-tumorale à l'aide de ces cellules, en parvenant à les isoler spécifiquement et en leur fournissant un milieu favorable à leur croissance. Afin de démontrer l'hypothèse proposée, nous avons décidé de mettre au point un système inductible suite à l'activation des lymphocytes T qui permettrait d'exprimer le ACD19 à leur surface (une fois activés) et de les isoler spécifiquement grâce à cette molécule. Pour atteindre l'objectif fixé, nous avons dû commencer par établir les objectifs secondaires suivants : construire des vecteurs inductibles ou non contenant le ACD19 ; tester les constructions ainsi obtenues pour vérifier leur fonctionnalité ; vérifier qu'il est possible de transduire, activer et isoler les cellules T primaires humaines en utilisant le vecteur IL-2 hacd19 ; étudier notre modèle in vivo chez la souris ; démontrer qu'il est possible de transduire les précurseurs, de reconstituer une souris et vérifier que le transfert de gène s'effectue jusqu'aux leucocytes matures. Nos travaux ont commencé par la construction de 4 vecteurs soit hacd19, IL-2 hacd19, macd19 et IL-2 macd19 à partir du vecteur prrl-5pme. Les constructions contenant les versions constitutives du ACD19 (hacd19 et macd19) nous ont permis de vérifier que l'utilisation d'une version tronquée du gène du CD 19 humain et murin n'affecte pas la protéine pour ce qui est de sa production, de son envoi à la membrane cellulaire et de sa stabilisation. En effet, puisque environ 50% des cellules expriment le ACD19 murin ou humain à leur surface après transduction, le fait que la protéine même tronquée est bien exportée et stabilisée à la surface cellulaire est démontré de façon claire. Pour leur part, les versions inductibles (IL-2 hacd19 et IL-2 macd19) ont été testées pour vérifier que le promoteur minimal de l'il-2 est bien fonctionnel et qu'il permet la transcription du gène

70 codant pour le ACD19. Ce qui c'est avéré être le cas, puisque l'expression du ACD19 murin mesurée par l'intensité moyenne de fluorescence augmente suite à l'activation par rapport aux cellules contrôles. L'utilisation de lignées lymphocytaires comme les Jurkat représente une alternative attrayante pour faire l'analyse fonctionnelle de nos constructions parce qu'elles sont faciles à transduire et a cultiver in vitro. Cependant, il s'agit de cellules tumorales qui se divisent continuellement même en l'absence d'activation. Ce qui veut dire qu'elles ont probablement acquis un certain niveau d'activation qui peut produire un bruit de font dans notre système. Il a donc fallu poursuivre les études dans un contexte plus optimal en utilisant les lymphocytes primaires, suite aux études fonctionnelles effectuées avec les cellules tumorales. Une fois que la fonctionnalité des constructions a été testée, les expérimentations ont été poursuivies dans des cellules primaires humaines. Des lymphocytes dérivés du sang périphérique humain ont été utilisés pour les expérimentations. Il est important de mentionner que les lymphocytes B ne sont pas contaminants dans ces expériences pour deux raisons. Premièrement, un tri pour les lymphocytes T CD8+ a été effectué, lors de l'isolement des lymphocytes du sang, de façon à éliminer le plus possible de lymphocytes B. Deuxièmement, les cellules ont été activées à l'aide de billes anti-cd3/cd28, ce qui permet une activation et une expansion spécifique des lymphocytes T. Les cellules sont gardées 16 jours en culture pour permettre aux lymphocytes de se multiplier suffisamment ainsi que de permettre au niveau d'activation des lymphocytes, causé par les billes, de revenir au niveau basai après que les billes aient été retirées (1 semaine avant l'analyse par FACS). Il est important que le niveau d'activation soit à son minimum pour ne pas avoir d'expression du ACD19 avant l'activation avec le PMA et l'ionomycine. Pour ce qui est des expérimentations, un taux de transduction de plus de 50% des lymphocytes T a été obtenu avec les conditions de transduction utilisées. Ce taux est relativement bon puisque dans la littérature les taux de transduction de cellules primaires obtenus en utilisant un lentivirus sont d'environ 15 à 80% selon les conditions utilisées [71-73]. Après avoir démontré que nous obtenions un bon taux de transduction des cellules primaires, une activation sous-optimale des lymphocytes T transduits avec la construction IL-2 hacd19 a été effectuée afin de reproduire ce que nous retrouverions au niveau tumoral lors de l'isolement des lymphocytes T, c'est-à-dire, une

7! minorité de lymphocytes T activés parmi une majorité de lymphocyte T inhibés. L'activation sous-optimale nous a permis d'obtenir un faible pourcentage (3,2%) de lymphocytes T qui expriment le ACD19 humain. Ce qui pourrait être représentatif de ce que nous retrouverions suite à l'isolement des TILs du tissu tumoral. Les lymphocytes activés ont été soumis à un tri cellulaire pour le CD 19 humain. Un enrichissement d'environ 18 fois a été obtenu, ce qui nous démontre qu'il est possible d'enrichir de façon notable une population pratiquement indécelable auparavant. De façon générale, les expériences effectuées avec les cellules primaires nous démontrent qu'il est bien possible d'isoler spécifiquement des lymphocytes T activés à l'aide de notre système et ce même s'ils se trouvent en très faible proportion, ce qui veut dire que notre objectif principal est atteint, du moins au niveau des expériences in vitro. Après avoir établi que notre système était fonctionnel avec les cellules primaires, il était logique de se diriger vers les essais in vivo. C'est pourquoi un modèle animal permettant l'étude du cancer du tissu mammaire a été choisi et étudié : la souris Apc Mm. Les expérimentations de caracterisation de la souris Apc Mm ont tout d'abord permis de déterminer qu'il nous était possible d'induire des tumeurs mammaires en utilisant de TENU. La quantité optimale d'enu à utiliser est de 75 mg/kg, puisqu'avec cette concentration environ 80% des souris développaient des tumeurs mammaires, ce qui est plus optimal que la concentration normalement utilisée dans la littérature (50 mg/kg) [63, 68] avec laquelle nous obtenions environ 65% d'induction de tumeurs. Notre pourcentage d'induction de tumeurs obtenu en utilisant 50 mg/kg était inférieur de près de 30% à celui obtenu par Moser et al. [68]. Cette différence entre les résultats peut possiblement être expliquée par une différence au niveau de l'alimentation des souris. En effet, une étude a démontré que le pourcentage de gras contenu dans la nourriture peut influencer le développement tumoral [65]. Nos études ont également permis de déterminer que l'apparition des tumeurs s'étalaient sur une période d'approximativement 40 jours suite à l'injection d'enu, avec une forte augmentation entre 40 et 45 jours. Nos résultats sont en accord avec ceux de Moser et al. qui ont observé un développement tumoral qui s'étend entre environ 30 à 80 jours avec une apparition accrue des tumeurs entre 40 et 50 jours [68]. Finalement, nos expérimentations de caracterisation ont permis de déterminer que la taille moyenne des tumeurs reste pratiquement négligeable jusqu'à environ 40 jours après l'injection d'enu et qu'elle augmente par la suite rapidement entre 50 et 60 jours pour atteindre une taille moyenne maximale d'environ 0,7cm. À notre

72 connaissance, il s'agit de la première étude à être effectuée pour déterminer le taux de croissance moyen des tumeurs mammaires chez la souris Apc. La caractérisât ion du modèle animal va nous permettre de mieux planifier les expériences futures impliquant l'induction de tumeurs, puisque nous connaissons maintenant la quantité optimale d'enu à injecter ainsi que la cinétique du développement tumoral chez la souris Apc M ". Suite à la caractérisât ion du modèle animal, nous avons déterminé les conditions expérimentales afin d'isoler et de transduire les précurseurs Lin"Sca-l +, de reconstituer une souris avec ces précurseurs modifiés et de vérifier s'il y a transfert de gène jusqu'aux leucocytes matures. Nous avons tout d'abord commencé les expérimentations par un double isolement des précurseurs à partir de la moelle osseuse qui à permis d'enrichir la population d'environ 1730 fois, puisqu'au niveau de la moelle osseuse on retrouve seulement entre 0,05 et 0,01% de précurseurs [74]. Il est important d'arriver à bien isoler les précurseurs afin de pouvoir démonter qu'il est possible de les transduire et de s'assurer d'un plus haut taux d'efficacité de reconstitution. En effet, nous avons tenté d'effectuer des reconstitutions en utilisant la totalité des cellules de moelle osseuse, mais sans succès. Toutes les souris sont décédées très rapidement (résultats non montrés). Les précurseurs sont des cellules difficiles à infecter à cause de leur état de quiescence [74, 75]. Par contre, les cellules plus différenciées sont beaucoup plus facile à infecter. En obtenant un bon enrichissement de la population de cellules Lin"Sca-l +, on augmente le niveau de transduction des cellules responsables de la reconstitution à long terme de la moelle osseuse. Les précurseurs ainsi isolés ont été transduits avec une efficacité variant de 15 à 30% selon les conditions employées en utilisant le vecteur pgfp. Cette efficacité est acceptable puisque Kurre et al. ont obtenu des taux de transduction variant entre 5,7 à 14,5% en utilisant un lentivirus semblable au nôtre, bien que les conditions utilisées étaient légèrement différentes [76]. Ce résultat démontre qu'il nous est bien possible d'infecter des précurseurs murins avec notre lentivirus, ce qui n'était pas le cas avec les lymphocytes matures. En effet, nous avons essayé de les infecter à plusieurs reprises mais sans succès (résultats non montrés). Cet échec est expliqué par l'existence de plusieurs blocages qui diminuent l'efficacité de transduction des lymphocytes murins matures. Parmi ces mécanismes, on retrouve dans le cas de l'utilisation d'un lentivirus : une diminution de la transcription inverse tardive, l'existence d'une molécule appelée Fvl qui possède un effet antirétroviral (située entre la transcription inverse et l'intégration) et une diminution

73 importante du transport nucléaire du génome viral [69]. L'efficacité d'infection que nous avons obtenue pour les précurseurs prouve donc que nous pouvons utiliser cette méthode pour essayer d'obtenir des lymphocytes exprimant le gène d'intérêt. Finalement, les précurseurs transduits ont été utilisés pour reconstituer une souris et examiner ainsi le transfert de gène. Après reconstitution du système hématopoïétique (13 semaines), 10% de leucocytes dérivés du sang périphérique exprimaient GFP, ce qui nous indique que le transfert de gène a bien été effectué. Le taux de transfert obtenu est acceptable si on se base sur les études retrouvées dans la littérature qui utilisent un lentivirus. Par exemple, le taux de transfert obtenu pour l'analyse du sang périphérique total par Kurre et al. est d'environ 10% et pour Chen et al. il est de 4,6 à 8,0% [52, 76]. Quant à Terkikh et al., ils obtiennent un taux de transfert de 12,8% ± 3,9% pour l'analyse de la lignée lymphoïde [77]. Notre résultat confirme qu'en passant par les précurseurs nous arrivons bien à obtenir des lymphocytes matures qui expriment un gène d'intérêt. Les expérimentations réalisées in vivo nous ont donc permis de mettre en place les conditions expérimentales afin de tester si l'enrichissement et l'expansion des TILs in vitro augmente leur effet thérapeutique. En conclusion, les expérimentations effectuées in vitro ont permis de conclure à la fonctionnalité des vecteurs construits ainsi qu'à l'efficacité de notre système d'isolement des lymphocytes T activés. Le travail in vivo à permis de caractériser le modèle tumoral ainsi que d'établir les conditions nécessaires à l'expérimentation avec la construction IL-2 macd19 (voir section 4.2). Nous avons donc réussi à mettre au point un système permettant d'isoler spécifiquement les lymphocytes activés présents au niveau du site tumoral. Ce système pourrait être utilisé pour caractériser les TCR retrouvés sur les lymphocytes actifs en permettant de les cloner et de les utiliser pour rediriger la spécificité des lymphocytes périphériques. De plus, ce système pourrait également servir à l'élaboration d'une stratégie anti-tumorale en permettant d'isoler et d'enrichir la population de TILs actifs au sein de la tumeur.

4.2 Perspectives À partir des conditions mises en place avec le modèle in vivo nous pourrions utiliser la construction IL-2 macd19 afin de caractériser les TILs ainsi que de tester leur potentiel thérapeutique (figure 4.1). Pour ce faire, il faudrait tout d'abord commencer par reconstituer une souris avec des précurseurs génétiquement modifiés avec IL-2 macd19 pour générer des lymphocytes exprimant de façon inductible le ACD19 murin. Par la suite, il faudrait injecter ces lymphocytes dans une souris Apc Mm traitée avec de TENU, attendre que le développement tumoral s'effectue, extraire la tumeur, mettre en culture les TILs et isoler spécifiquement les TILs qui sont activés. Suite à leur isolement, les TILs seraient mis en expansion puis ils seraient caractérisés ou analysés pour vérifier leur potentiel thérapeutique. Leur caractérisation pourrait être effectuée en comparant la proportion des différentes chaînes V(3 du TCR des lymphocytes retrouvés à l'intérieur de la tumeur avec celles des lymphocytes retrouvés en périphérie dans les organes lymphoïdes secondaires. Le potentiel thérapeutique pourrait être évalué en réinjectant les TILs activés, qui auraient été triés et mis en expansion, chez une souris Apc Mm ayant développé une tumeur. La souris ainsi traitée serait par la suite suivie pour observer si les TILs injectés permettent une diminution de la taille de la masse tumorale.

75 Lymphocytes génétiquement modifiés ChO -8 Extraction tumorale Mise en culture des cellules *> ) Réinjection Tri des TILs activés Caractérisation Figure 4.1 : Schéma représentant l'essai in vivo qui pourrait être effectué Une fois que les TILs auront été caractérisés et que leur potentiel thérapeutique aura été démontré chez la souris, il serait possible d'envisager un essai clinique chez les personnes atteintes du cancer du sein. Voici un exemple d'essai clinique qu'il serait possible de réaliser en utilisant notre système d'isolement des lymphocytes T activés (figure 4.2). Pour commencer, un échantillon sanguin ainsi qu'un échantillon tumoral d'un patient seraient prélevés lors d'une biopsie ou d'une chirurgie. Les lymphocytes ainsi que les monocytes seraient extraits à partir du sang périphérique obtenu. Les lymphocytes seraient transduits avec le virus contenant la construction IL-2 hacd19, alors que les monocytes seraient induits à se différencier en cellules dendritiques. L'échantillon tumoral serait dégradé pour en faire des peptides qui seraient incubés avec les cellules dendritiques produites. Les cellules dendritiques présenteraient donc les peptides antigeniques provenant de la tumeur à leur surface. Les lymphocytes transduits seraient incubés avec les cellules dendritiques ainsi générées. De cette façon, si parmi les lymphocytes du patient, qui auraient été transduits, certains possèdent un

/(» TCR spécifique pour un des peptides tumoraux présentés par les cellules dendritiques, ils devraient être activés et présenteraient à leur surface le ACD19 humain. Les lymphocytes seraient par la suite triés pour ne garder que ceux qui sont activés, mis en expansion, puis réinjectés chez le patient. Le patient serait donc suivi pour déterminer si les lymphocytes réinjectés ont un effet thérapeutique. Isolation des lymphocytes T Transduction avec IL-2hACD19 ^O < \ 0 9 n + Isolation des monocytes $s Maturation en cellules \7 dendritiques Lyse de la tumeur > 0< Lymphocytes modifiés génétiquement Cellules dendritiques présentant des peptides tumoraux tt=> TrihACD19 Figure 4.2 : Schéma représentant l'essai clinique proposé

Bibliographie 1. Société canadienne du cancer et Institut national du cancer du Canada. Statistiques canadiennes sur le cancer 2005. 2005, Toronto: Canada, p. 120. 2. Boyle, P., Breast cancer control: Signs ofprogress, but more work required. The Breast, 2005(14): p. 429-438. 3. Smith, LE., and S. Chua, ABC of breast diseases. Médical treatment ofearly breast cancer. I: adjuvent treatment. BMJ, 2006. 332: p. 34-37. 4. Houssami, N., J.Cuzick, and J.M. Dixon, The prévention, détection, and management of breast cancer. MJA, 2006. 184(5): p. 230-234. 5. Burstein, H.J., the Distinctive Nature of HER2-Positive Breast Cancers. N Engl J Med, 2005. 353(16): p. 1652-1654. 6. Goldsby, R.A., T.J. Kindt, and B.A. Osborne, Immunologie, Le cours de Janis Kuby. 2001, Paris: DUNOD. p.660. 7. Arina, A., et al., Clinical implications of antigen transfer mechanisms from malignant to dendritic cells: Exploiting cross-priming. Expérimental Hematology, 2002. 30: p. 1355-1364. 8. Janeway, C.A., et al., Immunobiology, éd. 5th. 2001, New York and London: Garland publishing. 9. Kageyama, S., et al., Variations in the number of peptide-mhc class 1 complexes required to activate cytotoxic T cell responses. J Immunol, 1995. 154(2): p. 567-76. 10. Sykulev, Y., et al., Evidence that a single peptide-mhc complex on a target cell can elicit a cytolytic T cell response. Immunity, 1996. 4(6): p. 565-71. 11. Reay, P.A., et al., Détermination ofthe relationship between T cell responsiveness and the number of MHC-peptide complexes using spécifie monoclonal antibodies. J Immunol, 2000. 164(11): p. 5626-34. 12. Kimachi, K., M. Croft, and H.M. Grey, The minimal number of antigen-major histocompatibility complex class II complexes required for activation of naïve and primed T cells. Eur J Immunol, 1997. 27(12): p. 3310-7. 13. Chandok, M.R., and D.L. Farber Signaling control ofmemory T cell génération and function. Seminars in Immunology, 2004. 16: p. 285-293. 14. Jonuleit, H., G. Adema, and E. Schmitt, Immune régulation by regulatory T cells: implications for transplantation. Transpl Immunol, 2003. 11(3-4): p. 267-76. 15. M.Ng, J., Designing a Vaccine for Cancer A Look Into Dendritic Cell Cancer Vaccine Research. Me Master Meducator, 2004. 3: p. 13-18. 16. Redmond, W.L. and L.A. Sherman, Peripheral tolérance ofcd8 T lymphocytes. Immunity, 2005. 22(3): p. 275-84. 17. Shi, L., et al., Granzyme B (GraB) autonomously crosses the cell membrane and perforin initiâtes apoptosis and GraB nuclear localization. J Exp Med, 1997. 185(5): p. 855-66. 18. Malmberg, K.J. and H.G. Ljunggren, Escape from immune- and nonimmune-mediated tumor surveillance. Semin Cancer Biol, 2006. 16(1): p. 16-31. 19. Wong, P.Y., et al., Functional analysis of tumor-infûtrating leukocytes in breast cancer patients. J Surg Res, 1998. 76(1): p. 95-103.

20. Joncker, N.T., et al., Antigen-independent accumulation of activated effector/memory T lymphocytes into human and murine tumors. Int J Cancer, 2006. 118(5): p. 1205-14. 21. Reome, J.B., et al., Type I and type 2 tumor infiltrating effector cell subpopulations in progressive breast cancer. Clin Immunol, 2004. 111(1): p. 69-81. 22. Georgiannos, S.N., et al, The immunophenotype and activation status ofthe lymphocytic infùtrate in human breast cancers, the rôle ofthe major histocompatibility complex in cell-mediated immune mechanisms, and their association with prognostic indicators. Surgery, 2003. 134(5): p. 827-34. 23. Kuroda, H., et al., Immunophenotype of lymphocytic infiltration in medullary carcinoma ofthe breast. Virchows Arch, 2005. 446(1): p. 10-4. 24. Dunn, G.P., L.J. Old, and R.D. Schreiber, The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol, 2004. 22: p. 329-60. 25. Yu, P. and Y.X. Fu, Tumor-infiltrating T lymphocytes: friends orfoes? Lab Invest, 2006. 86(3): p. 231-45. 26. Seliger, B., Stratégies oftumor immune évasion. BioDrugs, 2005. 19(6): p. 347-54. 27. Adam, J.K., B. Odhav, and K.D. Bhoola, Immune responses in cancer. Pharmacol Ther, 2003. 99(1): p. 113-32. 28. Mapara, M.Y. and M. Sykes, Tolérance and cancer: mechanisms oftumor évasion and stratégies for breaking tolérance. J Clin Oncol, 2004. 22(6): p. 1136-51. 29. Prevost-Blondel, A., et al., Tumor-infiltrating lymphocytes exhibiting high ex vivo cytolytic activityfail toprevent murine melanoma tumor growth in vivo. J Immunol, 1998. 161(5): p. 2187-94. 30. Allan, C.P., et al., The immune response to breast cancer, and the case for DC immunotherapy. Cytotherapy, 2004. 6(2): p. 154-63. 31. Salazar-Onfray, F., et al., Down-regulation ofthe expression andfunction ofthe transporter associated with antigen processing in murine tumor cell Unes expressing IL-10. J Immunol, 1997. 159(7): p. 3195-202. 32. Madjd, Z., et al., Total loss ofmhc class 1 is an independent indicator ofgood prognosis in breast cancer. Int J Cancer, 2005. 117(2): p. 248-55. 33. Leong, P.P., et al., Phenotyping of lymphocytes expressing regulatory and effector markers in infûtrating ductal carcinoma ofthe breast. Immunol Lett, 2006. 102(2): p. 229-36. 34. Wang, R.F., G. Peng, and H.Y. Wang, Regulatory T cells and Toll-like receptors in tumor immunity. Semin Immunol, 2006. 18(2): p. 136-42. 35. Liyanage, U.K., et al., Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancréas or breast adenocarcinoma. J Immunol, 2002. 169(5): p. 2756-61. 36. von Boehmer, H., Mechanisms of suppression by suppressor T cells. Nat Immunol, 2005. 6(4): p. 338-44. 37. Bell, D., et al., In breast carcinoma tissue, immature dendritic cells réside within the tumor, whereas mature dendritic cells are located in peritumoral areas. J Exp Med, 1999. 190(10): p. 1417-26. 38. Mahmoud, M.S., et al., Enforced CD] 9 expression leads to growth inhibition and reduced tumorigenicity. Blood, 1999. 94(10): p. 3551-8. 39. Tedder, T.F. and CM. Isaacs, Isolation ofcdnas encoding the CD] 9 antigen of human and mouse B lymphocytes. A new member ofthe immunoglobulin superfamily. J Immunol, 1989. 143(2): p. 712-7. 78

40. Zhou, L.J., et al., Structure and domain organization ofthe CD]9 antigen ofhuman, mouse, and guinea pig B lymphocytes. Conservation ofthe extensive cytoplasmic domain. J Immunol, 1991. 147(4): p. 1424-32. 41. Rickert, R.C., Régulation ofb lymphocyte activation by complément C3 and the B cell coreceptor complex. Curr Opin Immunol, 2005. 17(3): p. 237-43. 42. Fearon, D.T. and M.C. Carroll, Régulation ofb lymphocyte responses toforeign and self-antigens by the CD19/CD21 complex. Annu Rev Immunol, 2000. 18: p. 393-422. 43. Mustelin, T., and K. Tasken, Positive and négative régulation oft-cell activation through kinases andphosphatases. Biochem. J., 2003. 371: p. 15-27. 44. Flanagan, W.M. and G.R. Crabtree, In vitro transcription faithfully reflecting T-cell activation requirements. J Biol Chem, 1992. 267(1): p. 399-406. 45. Rothenberg, E.V. and S.B. Ward, A dynamic assembly of diverse transcription factors intégrâtes activation and cell-type information for interleukin 2 gène régulation. Proc NatlAcad Sci USA, 1996. 93(18): p. 9358-65. 46. Hughes, C.C. and J.S. Pober, Transcriptional régulation ofthe interleukin-2 gène in normal human peripheral blood T cells. Convergence of costimulatory signais and différences from transformed T cells. J Biol Chem, 1996. 271(10): p. 5369-77. 47. Zufferey, R., et al., Self-inactivating lentivirus vectorfor safe and efficient in vivo gène delivery. J Virol, 1998. 72(12): p. 9873-80. 48. Czarnomska, A., et al., Opposite effects ofmodifiers ofthe ApcMin mutation in intestine and mammary gland. Cancer Res, 2003. 63(15): p. 4533-7. 49. Dietrich, W.F., et al., Genetic identification ofmom-1, a major modifier locus affecting Min-induced intestinal neoplasia in the mouse. Cell, 1993. 75(4): p. 631-9. 50. Imaoka, T., et al., Mammary tumorigenesis in ApcMin/+ mice is enhanced by X irradiation with a characteristic âge dependence. Radiât Res, 2006. 165(2): p. 165-73. 51. Luongo, C, et al., Loss ofapc+ in intestinal adenomas from Min mice. Cancer Res, 1994. 54(22): p. 5947-52. 52. Chen, W., et al., Lentiviral vector transduction of hematopoietic stem cells that médiate long-term reconstitution oflethally irradiated mice. Stem Cells, 2000. 18(5): p. 352-9. 53. Forman, D., C. Tian, and J. Iacomini, Induction of donor-specific tolérance in sublethally irradiated récipients by gène therapy. Mol Ther, 2005. 12(2): p. 353-9. 54. Kafri, T., Lentivirus vectors: difficulties and hopes before clinical trials. Curr Opin Mol Ther, 2001. 3(4): p. 316-26. 55. Mikkola, H., et al., Lentivirus gène transfer in murine hematopoietic progenitor cells is compromised by a delay in proviral intégration and results in transduction mosaicism and heterogeneous gène expression inprogeny cells. J Virol, 2000. 74(24): p. 11911-8. 56. Miyoshi, H., et al., Development ofa self-inactivating lentivirus vector. J Virol, 1998. 72(10): p. 8150-7. 57. Pfeifer, A. and I.M. Verma, Gène therapy: promises andproblems. Annu Rev Genomics Hum Genêt, 2001. 2: p. 177-211. 58. Salmon, P. and D. Trono, Lentiviral vectors for the gène therapy oflymphohematological disorders. Curr Top Microbiol Immunol, 2002. 261: p. 211-27. 59. Vigna, E. and L. Naldini, Lentiviral vectors: excellent toolsfor expérimental gène transfer and promising candidates for gène therapy. J Gène Med, 2000. 2(5): p. 308-16. ' 79

60. Saenz, D.T. and E.M. Poeschla, FlV.from lentivirus to lentivector. J Gène Med, 2004. 6Suppll:p. S95-104. 61. Zufferey, R., et al., Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional régulâtory élément enhances expression oftransgenes delivered by retroviral vectors. J Virol, 1999. 73(4): p. 2886-92. 62. Moser, A.R., et al., ApcMin: a mouse modelfor intestinal and mammary tumorigenesis. Eur J Cancer, 1995. 31A(7-8): p. 1061-4. 63. Moser, A.R., et al., ApcMin, a mutation in the murine Apc gène, prédisposes to mammary carcinomas and focal alveolar hyperplasias. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(19): p. 8977-81. 64. Shoemaker, A.R., et al, Somatic mutational mechanisms involved in intestinal tumor formation in Min mice. Cancer Res, 1997. 57(10): p. 1999-2006. 65. Wasan, H.S., et al, Dietaryfat influences onpolypphenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(7): p. 3308-13. 66. Karabinis, M.E., et al, Heterozygosity for a mutation in Brcal or Atm does not increase susceptïbïlity to ENU-induced mammary tumors in Apc(Min)/+ mice. Carcinogenesis, 2001. 22(2): p. 343-6. 67. Moser, A.R., H.C. Pitot, and W.F. Dove, A dominant mutation that prédisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science, 1990. 247(4940): p. 322-4. 68. Moser, A.R., L.F. Hegge, and R.D. Cardiff, Genetic background affects susceptibility to mammary hyperplasias and carcinomas in Apc(min)/+ mice. Cancer Res, 2001. 61(8): p. 3480-5. 69. Baumann, J.G., et al., Murine Tcells potently restrict human immunodeficiency virus infection. J Virol, 2004. 78(22): p. 12537-47. 70. Camargo, F.D., et al., Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood, 2006.107(2): p. 501-7. 71. Bovia, F., et al., Efficient transduction ofprimary human B lymphocytes and nondividing myeloma B cells with HIV-1-derived lentiviral vectors. Blood, 2003. 101(5): p. 1727-33. 72. Cavalieri, S., et al, Human T lymphocytes transduced by lentiviral vectors in the absence oftcr activation maintain an intact immune compétence. Blood, 2003. 102(2): p. 497-505. 73. Chinnasamy, D., et al, Lentiviral-mediated gène transfer into human lymphocytes: rôle ofhiv-1 accessory proteins. Blood, 2000. 96(4): p. 1309-16. 74. Yang, L., et al., Identification oflin(-)scal(+)kit(+)cd34(+)flt3- short-term hematopoietic stem cells capable ofrapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant récipients. Blood, 2005. 105(7): p. 2717-23. 75. Morrison, S.J., et al, Identification ofa lineage of multipotent hematopoietic progenitors. Development, 1997. 124(10): p. 1929-39. 76. Kurre, P., et al., Efficient marking of murine long-term repopulating stem cells targeting unseparated marrow cells at low lentiviral vector particle concentration. Mol Ther, 2004. 9(6): p. 914-22. 77. Terskikh, A.V., et al., Long-term persistence ofa nonintegrated lentiviral vector in mouse hematopoietic stem cells. Exp Hematol, 2005. 33(8): p. 873-82. 80