Laboratoire de Virologie Journée OMEDIT - ARLIN Auvergne Test de Diagnostic Rapide de la grippe Christine Archimbaud-Jallat Service de Virologie Pr H Peigue-Lafeuille CHU Clermont-Ferrand
Rappels sur les virus de la grippe - Famille orthomyxoviridae genre INFLUENZA 3 types de virus TYPE A : EPIDEMIES SPECTACULAIRES Homme / animal Circulation plus importante, Variations antigéniques TYPE B : Homme EPIDEMIES RESTREINTES beaucoup + stable Structure des virus grippaux Neuraminidase Hémagglutinine - ARN (8 SEGMENTS), enveloppé Patrimoine génétique : ARN simple brin segmenté Protéine M 2 (Type A seulement) - Chaque type est divisé en sous type selon la composition de 2 protéines Hémaglutinine (H) (15 H) Neuraminidase (N) (9 N) - Réservoirs humains (2014) : 2 sous-types A circulent: H1N1 et H3N2 (vaccin)
Rappels sur LA GRIPPE 2014 2013 Mars avril 2013 Les virus de type A et B peuvent circuler simultanément, mais en général, en alternance au cours d'une saison donnée. Contagiosité (max 12 jours): - 24 à 48 heures avant l apparition des signes pendant la période symptomatique
Méthodes de diagnostic des infections respiratoires Gold standard Culture cellulaire MDCK ou Œuf de poule IMMUNO- FLUORESCENCE Détection des virus intracellulaires par des anticorps monoclonaux IMMUNO- CHROMATOGRAPHIE Détection qualitative des antigènes viraux RT-PCR Détection du génome viral 2-10 J Inconvénients Lourde qq labos Avantages Virus infectieux 3 heures VRS, hpmv, ADV, grippe, parainfluenzae Inconvénients Nombreux prélèvements SANS CELLULES RESPIRATOIRES Avantages Plus sensible / test rapide Faible coût 10-30 min VRS Grippe A/B Inconvénients Sensibilité limitée Diagnostics faux + / faux Avantages Rapidité- faible coût 3 4 heures Grippe A/B + + 6 autres v respiratoires Inconvénients PCR multiplexe : influenza A et B contrôle cellulaire Prix des multiplexes (VRS A, VRS B, 18 ) Avantages Sensibilité +++
Place des Tests de Diagnostic Rapides de la grippe (TDR) -Utilisation restreinte des (TDR) Grippe en France - par les réseaux de surveillance de la grippe Groupes Régionaux d Observation de la Grippe (GROG) - qq centaines de pédiatres, généralistes ou urgentistes -en juillet 2012 HCSP a rédigé un rapport : «Conduite à tenir devant une ou plusieurs infections respiratoires Aiguës dans les collectivités de personnes âgées» Souligne que la disponibilité récente des TDR grippe permettrait : - de mettre en évidence plus facilement les infections - adapter plus rapidement la prise en charge des patients (médicaments, examens complémentaires)
Evaluation des performances des TDR dans la grippe Etude ANSM En Août 2012: la DGS a saisi l Agence Nationale de Sécurité des Médicaments et des produits de santé (ANSM) en vue d évaluer les performances des TDR Objectifs : Développer l utilisation des TDR dans les maisons de retraite Travail: - Étudier les documents fournis par les fabricants (20 TDR) - attention sur les performances affichées des tests (sensibilité) - Les notices de 20 tests rapides de diagnostic étudiées (notice en Français) - conception - nature des prélèvements - temps de lecture Notice du TDR - types de souches testées, - limites de détection, - sensibilité, spécificité - mis à disposition de contrôles positifs
Conception des dispositifs (TDR) Principe: Test d immunochromatographie sur membrane Détection des antigènes spécifiques du virus de la grippe A ou B grâce à des anticorps spécifiques fixés sur une bandelette
Conception des dispositifs (TDR) Bandelettes 1ère étape : Extraction des antigènes grippaux Migration Ag/Ac sur nitrocellulose
Conception des dispositifs (TDR) Cassettes Temps de lecture des tests: entre 8 et 15 mn eurobio
Conception des dispositifs (TDR) 20 tests: 18 détectent Grippe A et B 2 détectent grippe A Nature du ou des Antigènes ciblés = non spécifiée - Pour 6 dispositifs= nucléoprotéine (Ag conservé types A et B)
Types prélèvements et quand? Nature: Prélèvements respiratoires: écouvillonnage nasal, de gorge ou nasopharyngé/rhinopharyngé, lavage nasal ou nasopharyngé, ou aspiration nasale ou nasopharyngée Quand : Dans les 48 h (quantité de virus maximale) Avant traitement antiviral Respecter les mesures d hygiène pour éviter de se contaminer! Rapport Haut Conseil de la santé publique Conduite à tenir devant une ou des Ira en Ehpad/Juillet 2012 MMWR / November 2, 2012 / Vol. 61 / No http://http://www.rmlonline.com/site/sections/496
Ecouvillonnage nasopharyngé (adultes) Qualité du prélèvement +++ Région postérieure: fosse nasale, tapissée d un épithélium de type respiratoire X 400 Lavage Broncho- Alvéolaire
Ecouvillonnage naso-pharyngé sur milieu de transport viral type VIROCULT écouvillons stériles validés uniquement pour la conservation et le transport des virus Dispositif VIROCULT Universal Transport Media (UTM) with mini-flocked Swab Mousse imbibée 1ml milieu de transport Péremption quelques mois (antibiotiques)
Aspiration naso-pharyngée en pédiatrie et en réanimation sonde d aspiration dans la partie antérieure du rhino-pharynx. Prélèvement de référence en pédiatrie chez les 0 à 4 ans = Prélever le plus précocement possible après l apparition des signes cliniques: 1- Eliminer les mucosités par mouchage soigneux 2- Injecter du sérum physiologique assez profondément pour atteindre les fosses nasales. Aspirer avec le dispositif 3- Envoyer au laboratoire, à température ambiante, dans un sachet plastique, avec la feuille de renseignements cliniques.
Souches virales détectées (TDR) Détection des souches : - pas d exigence particulière (nb et types de souches) d où grande hétérogénéité suivant les tests 20 - souches utilisées anciennes 5 tests: H1N1pdm09 12 7
Limite de détection des TDR Limite de détection = concentration à partir de laquelle un échantillon contenant du virus est rendu positif - grande variabilité suivant les tests - expression différente des concentrations: TCID50/ml, CEID50/ml, pfu/ml, pv/ml, ng/ml Difficile de comparer les trousses de diagnostic - pas de consensus pour exprimer les concentrations des limites de détection
Comparaison des performances des TDR à d autres techniques Sensibilité: probabilité que le test soit positif si la maladie est présente Spécificité: probabilité d obtenir un test négatif chez les non-malades - TDR vs RT-PCR - TDR vs culture cellulaire - TDR vs autres TDR Résultats de concordance: sensibilité, spécificité -Sensibilité inférieure (TDR vs PCR ou TDR vs culture) -sensibilité identique (TDR vs autre TDR)
Conclusions de L ANSM Évaluation des performances des TDR grippe Recommandation : harmoniser la présentation des performances des tests - préciser la nature des antigènes ciblés par les AC - Mesurer les limites de détection par qrt-pcr (nb eq cp/ml) - Comparer les TDR avec RT-PCR (Ref) - Inclure des contrôles + et dans chaque kit - Valider les tests avec des souches récentes de virus grippaux saisonniers
Etude des Performances diagnostiques des TDR 2012, Vol 156 Number 7, 100-111 Résultat méta-analyse (Canadienne): 159 études - 26 tests rapides - 35% durant la pandémie H1N1 - Comparaison TDR avec Culture ou RT-PCR (gold-standard) Sensibilité 62,30% Spécificité 98,20%
Comparaison: performances des TDR à d autres techniques Sensibilité hétérogène des tests: Age des patients Sensibilité 66,6% (enfants) vs 53,9% (adultes) (p<0.001) Type viral 64,6% (Influenza A) vs 52,5% (influenza B)(p=0.05) Technique de Référence 72.3% (TROD / culture) 53.9% (TROD) / RT-PCR) Chartrand C, et al. Accuracy of rapid influenza diagnostic tests: a meta-analysis. Ann Intern Med. 2012 3;156(7):500-11.
Accuracy of rapid influenza diagnostic tests: a meta-analysis. Chartrand C, Leeflang MM, Minion J, Brewer T, Pai M. Ann Intern Med. 2012;156(7):500-11.
Comparaison: performances des TDR à d autres techniques Sensibilité hétérogène des tests est due: Autres facteurs peu ou non explorés: - Durée des symptômes avant le test - Type d écouvillon (nylon, coton ) - Milieu de transport (nature et quantité) - Délai dans la réalisation du test - Charge virale Chartrand C, et al. Accuracy of rapid influenza diagnostic tests: a meta-analysis. Ann Intern Med. 2012 3;156(7):500-11.
Charges virales grippe Charges virales : - 10 2 à 10 7 copies/ml, - variable en fonction des types et sous types de virus Résultats exprimés par rapport au nb de cellules (PCR B2M) Design étude : 2007-2011 122 patients + 320 contacts familiaux inclus 189 cas de grippe ---A: H3N2 ---A: H1N1pdm09 ---A:H3N2 ---B Suess T et al;. Comparison of shedding characteristics of seasonal influenza virus (sub)types and influenza A(H1N1)pdm09; Germany, 2007-2011. 2012. PLoS One. 7(12)
Charges virales grippe H1N1 2007-08 H3N2 2008-09 H1N1 2009-10 Etude : petites communautés Hutterite Canada) 3 hivers (2008, 2009, 2010) (Prélèvements personnes malades et non malades) H1N1 : pic CV 24-48h avant les symptômes puis H3N2 : pic CV 2 j après début des symptômes progressive sur 8j Loeb et al., Longitudinal Study of Influenza Molecular Viral Shedding in Hutterite Communities. 2012. J Infect Dis. 1;206(7):1078-84
Nouveau test rapide (Sofia) Principe: Test d immunofluorescence sur membrane Détection des antigènes spécifiques du virus de la grippe A ou B grâce à des anticorps spécifiques fixés sur une bandelette Lecture: 16 mn
Diaporama fourni par le laboratoire INGEN
Bouscambert Duchamp CNR Grippe Lyon / INGEN
Bouscambert Duchamp CNR Grippe Lyon / INGEN
Bouscambert Duchamp CNR Grippe Lyon / INGEN
Bouscambert Duchamp CNR Grippe Lyon / INGEN
Bouscambert Duchamp CNR Grippe Lyon / INGEN
Évaluation du test rapide bionexia influenza A+B (biomérieux) pour la détection des virus influenza A et B Laboratoire de Virologie CHU Clermont-Ferrand
Évaluation rétrospective 4 hivers (2011, 2012, 2013, 2014) du 20 décembre au 31 mars 2914 Prélèvements (Grippe) Aspirations naso-pharyngées Ecouvillonnages naso-pharyngés (Virocult/Copan) Tous les jours RT-PCR Argène MWS influenza A/B r-gene Utilisation RT-PCR CNR Lyon Négatif Positif 571 (20%) RT-PCR Sous-typage A (H3N2) / A (H1N1) Vendredi apm Samedi Négatif N= 582 TDR Positif 26 (4,4%)
Évaluation TDR grippe CHRU Clermont-Fd (Hivers 2011-2014) Test utilisé: bionexia influenza A+B (BioMérieux) Prélèvements: n=582 - écouvillonnages naso-pharyngés : n=306 - Aspirations nasopharyngées: n=276 Patients: <2 ans (n=190) 2-15 ans (n=98) >16 ans (n=293) N=288
Évaluation TDR grippe CHRU Clermont-Fd (Hivers 2011-2014) Objectifs : Déterminer la Sensibilité / Spécificité: BioNexia vs RT-PCR En fonction: - Type d échantillon - Age du patient Résultat : Prélèvements n=582 TDR: 14/582= 2.4% + PCR: 105/582 =18% + TDR + TDR - n=26 (23A, 3B) n=556 4/26 Faux + RT-PCR + RT-PCR - n=79 (14%) n=477 Sensibilité Spécificité BioNexia / RT-PCR 22% 99%
Évaluation TDR grippe CHRU Clermont-Fd (Hivers 2011-2014) Résultat: Nature du prélèvement TDR vs RT-PCR Sensibilité Spécificité Total 22% 99% Aspirations nasopharyngées 35,5% 98,4% Ecouvillonnages nasopharyngés 16% 100%
Évaluation TDR grippe CHRU Clermont-Fd (Hivers 2011-2014) Résultat: Age des patients TROD vs PCR Sensibilité Spécificité Total 28% 83% < 2ans 28,6% 98,3% 2-15 ans 34,4% 98,5% > 16 ans 14,0% 100% Enfants excrètent plus longtemps et en plus grande quantité
Évaluation TDR grippe: CONCLUSIONS -Test BioNexia influenza A+B a une bonne spécificité (98,3 et 100%) (qqsoit âge ou nature du prélèvement) -Faible Sensibilité du test : 22% / RT-PCR raison technique : Trop grande dilution de l échantillon dans milieu de transport (3ml or <1ml recommandé) Patients différents: hospitalisés plus tardivement avec complication de grippe
En novembre 2013 Tester SOFIA influenza A+B FIA
Évaluation SOFIA grippe CHRU Clermont-Fd Test sur 22 échantillons : RT-PCR + (12 Inf A et 10 Inf B) Sensibilité BioNexia/ RT-PCR Sofia/ RT-PCR Total 18% 55% Aspirations nasopharyngées (n=9) 33% 78% Ecouvillonnages nasopharyngés (n=14) 7% 36% X 3 Influenza A (n=12) 25% 50% Influenza B (n=10) 10% 60% Enfants < 15 ans (n=12) 33% 75% Adultes 15 ans (n=10) 0% 30%
Utilisation de SOFIA grippe CHRU Clermont-Fd Hiver 2013-2014 BILAN du 24 décembre 2013 au 11 janvier 2014 CHU Clermont-Ferrand 53 échantillons respiratoires 5 vrais positifs (VP) 5 faux positifs (FP) Réactovigilance à ANSM
CONCLUSIONS Tests de diagnostic rapide grippe : - gde variabilité de sensibilité - pas toujours réévalués avec les souches circulantes (défaut sensibilité) - plus sensibles - à partir d aspirations nasopharyngées - chez les enfants - pour les virus influenza A Attention: TDR= Tests d orientation diagnostique de la grippe tout résultat négatif doit être obligatoirement contrôlé par PCR Perspective: - CNR grippe à Lyon évalue tous les TDRs grippe commercialisés sur le marché Français
Vaccin antigrippal 2012-2013 Vaccin antigrippal 2013-2014 Pour la saison 2013-2014 dans hémisphère Nord, la souche B diffère de celle des vaccins de la saison précédente : A/California/7/2009 (H1N1), inchangée A / Victoria / 361 / 2011 (H3N2) inchangée B/ Massachussetts/2/2012, nouvelle
Virus à tropisme respiratoire primaire Plutôt Responsables d épidémies - Virus influenzae A et B Plutôt Responsables de cas endémiques ou sporadiques - Rhinovirus/ contrôle cellulaire rhinite -Virus respiratoire syncytial (VRS)/ Métapneumovirus bronchiolite - Coronavirus/ Parainfluenzae SRAS (2003) Pneumopathie +signes dig - Adenovirus/ Bocavirus pneumonie laryngite Il n existe pas de spécificité étiologique, la stratégie diagnostique nécessite de rechercher systématiquement tous les virus à tropisme respiratoire primaire
Recherche des virus est dépendante de la saison /contexte épidemique / âge En HIVER Diagnostic par RT-PCR (multiplex Argène) ADULTES Grippe A/ Grippe B Rhinovirus/ contrôle ENFANTS Grippe A/ Grippe B Rhinovirus/ contrôle VRS/ Métapneumovirus ADULTES + Réa, IDéprimés,Cardio,Pneumo) Grippe A/ Grippe B Rhinovirus /contrôle VRS/ Métapneumovirus Coronavirus/ Parainfluenzae ADV/ Bocavirus ENFANTS + Réa, IDéprimés,Néo-nat Grippe A/ Grippe B* Rhinovirus / contrôle VRS/ Métapneumovirus Coronavirus/ Parainfluenzae ADV/ Bocavirus
Recherche des virus est dépendante de la saison /contexte épidemique / âge Hors période hivernale Diagnostic par RT-PCR (multiplex Argène) ADULTES ENFANTS Rhinovirus/ contrôle Rhinovirus/ contrôle ADULTES + Réa, IDéprimés,Cardio,Pneumo) ENFANTS + Réa, (IDéprimés,Néo-nat) Rhinovirus /contrôle Coronavirus/ Parainfluenzae ADV/ Bocavirus Rhinovirus / contrôle Coronavirus/ Parainfluenzae ADV/ Bocavirus
Ecouvillonnage naso-pharyngé chez l adulte sur milieu de transport viral type VIROCULT VIROCULT : tube contenant un milieu de transport spécifique pour la conservation des virus respiratoires, dans lequel il faut immerger l écouvillon de prélèvement. METHODE DE PRELEVEMENT : chez l adulte Prélever le plus précocement possible après l apparition des signes cliniques. 1- Eliminer les mucosités par mouchage soigneux (IF) 2- Insérer l écouvillon dans une narine jusqu aux fosses nasales (zone osseuse du nez) afin de pouvoir prélever des cellules respiratoires. 3- Orienter l écouvillon parallèlement au palais. 4- Tourner doucement pour récupérer le maximum de cellules 5- Oter le bouchon du tube de transport et plonger l écouvillon dans le milieu de transport. Refermer le tube. ENVOI AU LABORATOIRE Envoyer immédiatement au laboratoire, à température ambiante. Les renseignements cliniques sont indispensables et le nom du médecin prescripteur doit être renseigné et lisible.